多色莹光蛋白标记技术是什么?华裔美国科学家钱永健夺得2008年度诺贝尔化学奖,他发明多色莹光蛋白标记技术,为细胞生物学和

绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,当受到紫外或蓝光激发时,能发射绿色荧光.1992 年Prasher等详细描述了源于维多利亚水母绿色荧光蛋白的基因和蛋白质结构; 1994 年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞中克隆表达了绿色荧光蛋白.和其他标记物相比,绿色荧光蛋白拥有操作简便、结果直观等优点,从而被广泛应用于转基因动物、融合标记、基因治疗、蛋白在活细胞内功能定位及迁移变化以及病原菌侵入活细胞示踪等领域.而近年的研究表明,绿色荧光蛋白标记在移植干细胞的示踪、定量分析、分化状态的检测等方面显示了良好的应用前景.
目前,医学研究中使用的绿色荧光蛋白来源于维多利亚水母,其基因由3 个外显子组成,长达2.6 kb,蛋白产物为是由238 个氨基酸组成的单体蛋白,相对分子质量为26 888.绿色荧光蛋白呈圆柱体结构,直径约为3 nm,长约为4 nm,外围是由11 条片层链组成,内部含一个螺旋,两端由短的螺旋片段封闭,生色基团被保护于圆柱体内部.绿色荧光蛋白表达后折叠环化,在氧存在下,由65～67 位的氨基酸残基环化,形成发色团.绿色荧光蛋白在紫外光激发下发绿色荧光
的最大吸收峰为395 nm,另一小吸收峰为470 nm,最大发射峰为509 nm,在540 nm 处有一肩峰.绿色荧光蛋白在作为标记物时有以下一些优点:①不需加任何
底物,监测方便.同其他常用的分子标记物( 如β- 半乳糖基转移酶和氯霉素乙酰基转移酶等) 相比,绿色荧光蛋白最大的特点是不需要底物或辅因子,可用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜等直接观察到荧光.若在体表等容易观测的部位且荧光够强,则可直接用长波长紫外灯照射观察,使用非常方便.②绿色荧光
蛋白分子量较小,与目的基因融合后,对目的基因的结构功能影响小,大量表达对细胞也无毒性作用.另外,绿色荧光蛋白的第2～232 位氨基酸是形成生色基
团的最小结构域,而在绿色荧光蛋白的N 端和C 端的融合蛋白并不影响生色基团圆柱体结构的形成,因而不影响绿色荧光蛋白发光.目前,大约有100 多种绿色荧光蛋白融合基因蛋白得到很好的表达,且融合蛋白质同时具有绿色荧光蛋白的荧光特性和目的蛋白质的功能.③绿色荧光蛋白标记细胞后不影响或很少影响细胞的正常功能.使用绿色荧光蛋白质粒或病毒载体标记胚胎干细胞、神经干细胞、造血干细胞等后并不影响这些细胞的增殖功能和多向分化潜能.④绿色荧光蛋白荧光表达稳定,可耐受高温处理,甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质,并且无光漂白现象.如用酸、碱或盐酸胍处理,一旦恢复中性环境,或去除变性剂,荧光就可恢复并具有和原来一致的发射光谱.