做流式细胞时候,制备细胞悬液加入荧光染料后,还要做什么处理么?

博凌科为生物科技-为你胰酶使用注意：1、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染.2、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长,否则细胞铺板后生长状况会较差.贴壁细胞的消化：1、吸去培养液,用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次,以去除残余的血清2、加入少量胰酶细胞消化液,略盖过细胞即可,根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量.室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同）3、显微镜下观察,细胞明显收缩,并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来.4、此时吸除胰酶细胞消化液.加入含血清的完全细胞培养液,吹打下细胞,即可直接用于后续实验如果发现消化不足,则加入胰酶细胞消化液重新消化.如果发现细胞消化时间过长,未及吹打细胞,细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落,直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来.1000-2000g离心1分钟,沉淀细胞,尽量去除胰酶细胞消化液后,加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞,即可用于后续实验.常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin）,EDTA等,其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解,改变细胞间的连接,使组织或细胞片分散成单个细胞,制成细胞悬液用于进一步的实验.影响消化速度的因素较多,主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 .加入胰蛋白酶-EDTA溶液,视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定）,以使充分浸润；一般消化时间约为1至3分钟,肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时,弃去细胞消化液,或看见培养瓶壁呈白茫 状即可.并加入适量的完全培养液终止消化,吹打分散；如见大量细胞片状脱落,已消化过头,则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作.（消化过头,可造成大量 细胞从瓶壁上脱下,甚至造成细胞破碎.由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂,所以加入完全培养基可以终止反应.胰酶配置方法：1、培养液配制,方便好用,对细胞影响小,并且培养液的ph值正好适合胰蛋白酶的溶解2、生理盐水配制,要先调ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力搅拌2-3小时,调pH 7.8-8.0,过滤除菌.）3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：称取胰酶粉末0.1g,先用少许灭菌过的PBS调成糊状,然后补足到100ml.置室温搅拌4小时或冰箱内过 夜,过滤灭菌,分装,4℃保存备用.）; 或是hanks或是D-hanks液配制（1.称取胰蛋白酶粉末置烧杯中,先用少许D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状,然后再补足D-Hanks 平衡盐溶液,搅拌混匀,置室温4 小时或冰箱过夜,并不断搅拌振荡；2.次日,先用滤纸粗滤,再进行过滤除菌,分装入瓶中,低温冰箱保存备用,常用浓度为0.25% 或0.125%.胰蛋白酶溶液偏酸,使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右.）一般0.45微米的一次性滤器过滤除菌,至于作用效果,需要消化一次细胞感觉一下,因为不同厂家的酶不一样,有的作用温和,有的作用剧烈.4、是否需要四度放置过夜,取决于你的胰酶的纯度.过去的胰酶纯度不高,所以难以溶解,需要四度过夜.而现在的胰酶纯度都很高,就没有必要四度过夜.从理论上来说,四度放置过夜,给细菌生长的机会,尽管过滤可以出去细菌,可是出不掉其代谢产物.胰蛋白酶不溶,有絮状物的原因,考虑有：1、过期或是酶已经部分变性2、溶液ph值不对3、在没过滤之前的絮状沉淀是正常现象,因胰酶多取自动物胰腺,沉淀为组织块,过滤后即可

PI肯定不行了 你是要做凋亡么 那就没办法了吧 Annexin 倒是可以用 如果是想染核的话还可以用DAPI 蓝色 加抗生素对细胞状态肯定有影响的 不过你只要保证要么一直加抗生素要么一直不加 不会对结果有大的影响

最好贴个图看看.
我估计是在FSC上看到的大小两群?有时候光凭这个参数来判断大小是不很特异的.建议Gate细胞后（排除了debris后）,再gate一下,以SSC-H和SSC-A作为X和Y的指标,正常情况下应该是比较紧密的直线,如果有散点在SSC-A的方向发散,说明有2个细胞聚集了,样本没有充分制备为单细胞悬液.
还有就是药物处理,生长时间长等（处于非指数生长期）有时是会改变细胞形态的,可以导致流式散点图的switch,这个情况也很常见.

区别:
a、电阻or滑动变阻器or电流表允许通过的最大电流

第一看清楚抗的是你的目标蛋白质没错,目标蛋白的物种不要搞错了,有些抗体对好几个物种的目标蛋白有反应,对你的实验有没有影响.
第二抗体的物种是小鼠,大鼠,兔子还是什么.虽然现在荧光都标记好了,一般不需要二抗.但最好还是选择你有匹配二抗的一抗,以备不时之需.如果抗体还能够做荧光染色啊,western blot啊用途多了更好.
第三荧光的颜色选择一是你的流式仪一定要能读,二是跟你需要counterstain的其他流式抗体错开频率.
第四抗体的球蛋白亚型.因为要根据这个选择isotype对照用抗体.其实严格来说不光亚型一样,浓度也要一样,每个抗体分子携带的荧光分子数量也要一样才行.最好是一个isotype你的好几个抗体都能用,就省了事了.
第五到底能测试多少样品.有些产品介绍没说清楚,可以根据推荐的浓度计算一下.一是这样才看出价格高低,二是根据自己需要选择大支还是小支.买多了过期也是浪费.
当然也可以看看他们的克隆编号--有些文献会讨论某目标蛋白的各种抗体的特异性哪个好哪个坏,这都是使用者的经验.但一般买抗体没有人这么小心这么麻烦啦.
你还可以看制作抗体所用的抗原是什么,有的是肿瘤组织提取液,有的是重组蛋白,有的是肽链片断.选用哪个跟你的实验用途有关.有些蛋白质有很多亚型,也要注意是否测试过跟那些亚型起反应.
一个非常重要的忘记说,就是单抗还是多抗.也要根据实验性质选择.搜到一篇不错的文章谈这个问题你看下吧.

分子克隆是葵花宝典,有此一招走遍生物界都不怕!工具书另外分子生物学实验技术和细胞生物学实验技术可以参考.另外对于实验的理解和概念的掌握以及注意事项和最新实验发展方向还可以参照基因!最经典的是基因八!现在好像出到十了.希望能对你有所帮助

冻干粉和稀释液必须在注射前混合,平时置于较低温度下,但是一般没必要冻着,使用前按照说明书的比例与稀释液（如生理盐水）混合.
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真是不好意思,一直没有看到.希望现在不会太晚.
我接触过的冻干粉制剂都是需要稀释的,冻干粉不能直接注射啊.用生理盐水的话抗体应该是不会变性的,因为这个环境是和人体内部一致的,大多数粉状药剂都是用生理盐水稀释的.当然必须用规定的溶液来溶解和稀释冻干粉制剂.
但是我学的是生命科学,你最好还是找医生问问吧.我怕有问题.我们实验时用到的冻干粉都是用0.9%氯化钠或5%葡萄糖溶液100 mL稀释的,但是都是给兔子、白鼠注射.而且我们买的冻干粉都是搭配稀释液一起销售的.
至于最佳稀释一栏写纯,嗯,我没见过.不知道你的是什么抗体的制剂?干扎冻干粉应该不可能吧>"

流式是一个很客观的技术,只要正常操作流式,无法人为提高某种检测结果

当然不行.如果你用的流式有2个以上激光,最好一个用FITC（激发光波长488nm）,另一个用非488激发的,这样做代偿的时候干扰小.

CE
物理文件.包括顺序结构（或顺序文件）、链接结构（或链接文件）和索引结构（或索引文件）.
物理文件系统的主要功能是把逻辑记录的相对块号,转换为实际的物理地址.对顺序文件结构,由于其文件控制块中含有文件的第一个物理块号地址和块数,容易将相对块号转换成物理块号.对于链接结构,文件控制块中仅含有文件第一个物理块地址,则可以通过链查找相应物理块.对于文件的索引结构,文件控制块中含有索引表,可以直接根据索引表,查找相应物理块地址.

听到

区别:
a、电阻or滑动变阻器or电流表允许通过的最大电流

估计不可以了,因为接了一个荧光素基团后,一抗的构象估计要变化了,即使构象不变化荧光基团产生的空间位阻作用也阻止了与二抗的结合,所以最好买专门用的做免疫组化的抗体.

采用分压式是,测量电路是与滑动变阻器一部分并联的,即与这部分电阻的电压相同,
.滑片移动可以改变与测量电路并联的电阻的阻值大小,即可使测量电路的电压从零开始变化

限流接最大阻值,分压接最小阻值.最小电流限流是电动势除以总电阻,分压是变阻器分的电压除以负载电阻.（纯电阻电路）