粪大肠菌群测定的环境要求?

主要有ss平板,EMB:伊红美兰培养基和双糖铁培养基,
肠道致病菌不分解乳糖,所以在SS平板上生长的菌落为无色透明的小菌落.如能产生H2S,则菌落中心呈黑色.大肠杆菌在SS平板上一般不生长,但如粪便标本接种得多,大肠杆菌量多所以仍有少数生长.大肠杆菌能发酵乳糖产酸,菌落呈红色,或菌落中心显红色,很容易和致病菌区分.
观察半固体-双糖铁培养基结果.如果双糖铁培养基中乳糖不发酵,可能为肠道致病菌.根据葡萄糖发酵结果、运动力的有无等可初步判定为哪一类细菌.
伊红美兰培养基上大肠埃希菌(非致病菌)发酵乳糖产酸,结合伊红美兰形成紫黑色金属光泽有色的菌落,伤寒沙门菌等(致病菌)不发酵,不能结合乳糖伊红美兰,形成无色的菌落

菌落总数只要两天就出结果了,暂时没发现什么快速的方法.粪大肠、绿弄、金黄色葡萄球菌可以考虑用API,或者Soleris微生物光电检测系统.

产酸产气代表大肠菌群阳性用“+”符号表示,如果是阴性即未产酸产气用"_"符号表示,粪大肠菌群产气表示阳性,也是用“+”符号表示

大肠菌群测定的操作细则
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌.该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能.
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示.
1 设备和材料
1.1 温箱：36±1℃.
1.2 冰箱:0～4℃.
1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃.
1.4 天平.
1.5 显微镜.
1.6 均质器或乳钵.
1.7 平皿:直径为90mm.
1.8 试管.
1.9 吸管.
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL.
1.11 玻璃珠:直径约5mm.
1.12 载玻片.
1.13 酒精灯.
1.14 试管架.
2 培养基和试剂
2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定.
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定.
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定.
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定.
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定.
2.6 生理盐水.
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定.
3 操作步骤
3.1 检样稀释
3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液.固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液.
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液.
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管.
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管.
3.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管.每一稀释度接种3管,置36±1℃ 温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行.
3.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验.
3.4 证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况.凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性.
3.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值.
4 粪大肠菌群(faecal coliform)
4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性.
4.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值.

粪大肠菌群培养实验干净很重要的样品浓厚 ,因为培养皿不完全消毒、小导管用酒精灯加热15秒左右 闭气观察20秒左右要慢慢的不要急

取溴甲酚紫0.1g,加0.02mol/L氢氧化钠溶液20ml使溶解,再加水稀释至100ml得0.1%的溴甲酚紫水溶液；再取4ml上述溶液加水稀释至100ml,
虽然浪费点,但是实用,我们在实验室都这么操作的.

MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称.这种方法,对样品进行连续系列进行稀释,加入培养基进行培养,从规定的反应呈阳性管数的出现率,用概率论来推算样品中菌数最近似的数值.