做RT-PCR内参的作用是什么?应该如何选择管家基因

用Tubulin或Actin的抗体.

不要用同一阈值.内参和目的基因在分析的时候是独立进行的.
分析量的时候,先比较内参（代表加样误差）.校正加样量的差别后,才能比较目的基因.
配溶液的时候,先配成一个大管（除了样本以外的其他成分都混在一个大管内,如果有10个反应,配11份的量,这样可以留有余地）.混匀后再分配到PCR反应管,加入样本.既快又简单.

相对定量有两种方法.要求扩增效率相同的是ΔΔCt法,因为只有扩增效率相同目的基因与内参基因的Ct值之差才是恒定的值,这是使用这种方法处理数据的前提,所以正式实验之前要进行条件优化,这种方法的优势是不用作标准曲线.如果扩增效率不同就要用另一种双标准曲线法,这种方法需要标准品,稀释不同的浓度梯度,作标准曲线,根据标准曲线得到你的拷贝数在进行数据处理,得到相对值.

Western Blot
为什么必须要用内参
要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是
Western Blot
.
因为
Western
Blot
操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相
对变化.虽然,顺利的时候
Western
Blot
做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦――做不出结
果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟,作为一种有
活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象
1+1
那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样
知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的.所以,严谨的
Western
Blot
实验设计中要求有
良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用.特别是当实验出现问题时,借助参照体系很容易就
可以查出问题所在,
而不必抓耳挠腮怨天尤人.
良好的参照体系通常包括
分子量
Marker
（用来确定
蛋白条带对应的分子量大小）
,空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）
,
已知
量标准产物的正对照
；
另外还有
内参
.
可是由于经费限制或者偷懒的原因,
国内的不少人做
Western
Blot
往往省略参照,导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析.
内参是最容易被忽略的一项.我们知道,要用
Western
Blot
比较不同条件下或者不同组织中,目的
蛋白表达量的相对多少,
前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础
.特别表达量不高时,上样
量误差就很可能影响结果的分析.所以你需要内参.
内参
即是内部参照（
Internal
Control
）
,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由
管家基因编码表达的
蛋白
(Housekeeping
Proteins)
,它们
在各组织和细胞中的表达相对恒定
,在检测蛋白的表达水平变化
时常用它来做参照物.在
Western
Blot
实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样
电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,
还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上
样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性
.
在国外发表的文章中,
Western
Blot
实验结果须进行内参校正已成为一种惯例.但是,国内仍有不
少科研人员在
Western
Blot
实验中忽略了内参的使用,将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种
样品间上样量等同的唯一方法.然而各种蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,不能完全准确的确
定各种样品的准确蛋白浓度.如
UV
法直接定量,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质,相对
于比色法来说,操作简单,但是容易受到平行物质的干扰,如
DNA
的干扰；且敏感度低,要求蛋白
的浓度较高.比色法测定蛋白浓度一般有
BCA
,
Bradford
,
Lowry
等几种方法.
BCA
法与
Lowry
法
都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰.
Bradford
法敏感度最高,
且与一系列干扰
Lowry
,
BCA
反
应的还原剂（如
DTT
,巯基乙醇）相容.但是对于去污剂依然是敏感的,其最主要的缺点是不同的
标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性.另外,蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上
样,此步骤也存在操作误差.
在
Western Blot
实验时使用内参,即可简便地对定量和上样步骤产生
的误差进行校正.

首先要明白,marker和内参不是一种东西.Marker是用来标定蛋白或者DNA大小的.内参对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物.其作用是校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性.
pcr产物检测一般marker就可以了.不用内参.
western一般全都要用.
免疫组化检测蛋白偏重于蛋白在细胞及组织中的表达分布,定量较为不精确.所以要根据你实验的目的选择实验方法.

正常的,因为你提取两个材料的RNA的量不同.你根据数据算下表达量具体是差几倍,看是否与你的预期相符

提交不了答案.
不要调一致 把内参也检测了

我也遇到过这种问题,个人觉得可能是目的基因的定量引物不好,还有就是要优化PCR条件!

嗯,同意楼上的说法,内参一般都是选用细胞内表达稳定,表达量比较高的蛋白,比如一些骨架蛋白.这些蛋白一般认为不会因为实验处理,细胞状态不同而在总蛋白中的含量有大的起伏.
有内参的话,你的目的蛋白的表达的比较才有意义,否则的话,你说某一组的目标蛋白表达升高了,怎么排除你上样上多了的原因.

解题思路：（1）从条形图中得出：甲班的人数=1+1+2+3+2+1，乙班的人数=2+1+3+2+1+1；
（2）根据平均数的概念求得平均次数；
（3）根据平均数的意义分析．

（1）甲班的人数=1+1+2+3+2+1=10人，乙班的人数=2+1+3+2+1+1=10人；

（2）甲班学生参加研究性学习的平均次数=（1+2×2+3×3+4×2+5）÷10=2.7次，
乙班学生参加研究性学习的平均次数=（1+2×3+3×2+4+5）÷10=2.2次；
故填10，10；2.7，2.2．

（3）甲班学生参加研究性学习的平均次数大于乙班学生参加研究性学习的平均次数，所以在开展研究性学习方面甲班更好一些；

（4）甲班中有一个没有参加研究性学习，乙班中有两个没有参加研究性学习．

点评：
本题考点： 条形统计图；算术平均数．

考点点评： 本题考查了由条形图得出信息的能力和计算平均数的能力及平均数的实际应用．

解题思路：1、核膜包围在细胞核的外面，由内外两层膜构成，核膜上有小孔，称为核孔．
2、椭球形粒状小体是核糖体，无膜的结构．

DNA聚合酶的化学本质是蛋白质，在无膜的核糖体中合成，由细胞质通过核孔进入细胞核，所以通过的膜的层数为0层．
故选：A．

点评：
本题考点： 物质跨膜运输的方式及其异同．

考点点评： 本题考查核孔、核糖体的结构，意在考查学生分析问题和解决问题的能力，难度不大．

这样子调内参基因的条带似乎是不严谨的．理论上来说,如果你用相同总量的cDNA或DNA模板,并用相同的内参基因引物对,相同实验条件和循环次数,你应该得到相同的内参基因条带,这才能证明你的每次实验操作是可靠的啦.

这个要看你在做PCR前的加样量是否一致.如果加样量是一致的,而内参做出来差别大（比如3-4个CT值）那说明你的实验体系有严重的问题.理论上加入的DNA量一样多,内参的CT值应该都一样.如果你能肯定加样量是一致的,那说明你的样本要么降解了,要么就是你的实验处理对内参的量产生了影响,必须换一个基因做内参.还有就是你的加样量误差很大.这样的话,建议你内参和目的基因在一个管子内做.各自选用不同的颜色标记的探针,不用CYBR Green.这样就没有任何加样误差了.
这个所谓的“校正”就是保持每个样本的加样量的一致.

初中数学教学反馈与矫正探究 一、反馈与矫正的一般原则反馈是控制论的一种重要基本原理。它是指控制系统把信息输送出去，然后把其作用的结果返回来，并对信息的再输出发生影响，起到控制作用。通过反馈，可以不断地矫正偏向和失误，逐步达到预期的目的。一般说来，反馈与矫正有如下几条原则。（一）适时反馈，及时矫正在教学视导过程中，发现有两种不正常现象：一种是备课。教师根据主观意识，提前几天或几个星期备课，个别的...

我不了解你的实际情况,我给你几条建议：
1.可能是内参引物有问题
2.你扩增内参基因的PCR条件设计可能有问题,如Tm
3.你用的是一块胶吗?加核酸染料了吗?

上下引物的 Tm最好相似,不能差异太大,不然不好设计退火温度；
内参条带很亮,说明RT应该没多大问题,问题可能出现在PCR上.
没有目的基因是因为
1 该基因确实不表达；
2 你的引物不特意,到NCBI的PrimerBlast 看看；

要检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化,首选方法是Western Blot.因为Western Blot操作相对简单方便,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化.虽然,顺利的时候Western Blot做起来很简单,可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟,作为一种有活性的生物大分子,抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确,而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的不确定性的.所以,严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系,对实验结果分析是非常有用.特别是当实验出现问题时,借助参照体系很容易就可以查出问题所在,而不必抓耳挠腮怨天尤人.良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小）、空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照）、已知量标准产物的正对照,另外还有内参.可是由于经费限制或者偷懒的原因,国内的不少人做Western Blot往往省略参照,导致结果出现问题时无法分析结果,即便有结果也可能影响结果的分析.
内参即是内部参照（Internal Control）,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物.在Western Blotting 实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性.
实际上内参是最容易被忽略的一项.我们知道,要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,前提条件是等量的细胞上样,才有比较的基础,特别表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析,所以需要内参.在国外发表的文章中,Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例.但是,国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用,将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法.
然而各种蛋白质浓度定量方法,都存在局限性,不能完全准确的确定各种样品的蛋白浓度.如UV法直接定量,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质,相对于比色法来说,操作简单,但是容易受到平行物质如DNA的干扰,且敏感度低,要求蛋白的浓度较高.比色法测定蛋白浓度一般有BCA、Bradford、Lowry 等几种方法.BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰.Bradford法敏感度最高,且与一系列干扰Lowry、BCA 反应的还原剂（如DTT,巯基乙醇）相容,但是对去污剂依然是敏感的,其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性.另外,蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样,此步骤也存在操作误差.在Western blotting实验时使用内参,即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正.
在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信.此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常.
在Western Blotting实验过程中使用内参的方法通常有一下三种.第一种是超级简便的标记内参使用法,只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体,按照正常操作即可；第二种是普通内参,当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时,可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测,然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体,重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测.第三种,当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下,可以在转膜后预染,根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分,使内参蛋白与目的蛋白分开,然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育,二抗温育以及显色.
常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin.一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上.因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参!
actin即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白.actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin,其余两种广泛分布于各种组织中,包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin.这些不同的亚型组织分布是不一样的,在肌肉组织中的beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiac muscle actin.因此不同的组织本来就应该选择不同的内参,不能一概而论的.beta-actin作为内参是得到了公认的,这是针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富.尽管最近有一些文章已经开始质疑beta-actin作为内参的有效性（好像是对于上样量>20ug的蛋白区分能力下降,记不清楚了）,但是发文章应该还是没有问题的.至于其他的内参也是可以考虑用的,GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶,而tubulin和actin类似,是细胞骨架的组成部分,但是不是肌肉的主要成分,应该是一个代替品.三种同时发生变化的情况很少,需要具体分析.一旦出现上述三种内参同时发生变化,如果是总蛋白可以用胞核的内参如PCNA,TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替,当然一般这种可能性出现的几率微乎其微.
不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响,买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白,很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题.很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的,不同的公司选择的片段不一样.以最常用的beta-actin为例,有的公司选择N-端,有的选择C－端.选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数,主要有santa cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等),ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967),Axxora PLATFORM(BET-A300)等,这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带.选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等),这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号.有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”,就是由于抗体选择不对造成的.
actin几种异构体存在组织分布特异性,不同型actin之间具有较高的序列相似性(>90%).β-actin是分布于非肌细胞中的一种骨架蛋白,选择作β-actin内参时首先得保证是组织广泛表达的（尤其是做蛋白的组织表达谱时）.那么制备β-actin抗体的抗原应该是选用与actin其它异构体一致的氨基酸序列.公司制备抗体是选用beta-actin的某一段小短肽作为免疫原,可能会因为选取的短肽在不同型actin之间保守与否,而导致所制备抗体具有一定的组织特异性.如选取的短肽仅在beta型存在,所得抗体就仅能检测非肌细胞中的actin,而选取的短肽在六型中均存在,则此抗体除非肌细胞外,还可以检测cardiac,skeletal,smooth muscle细胞的actin

这个概念一般是用在定量PCR中.定量PCR是要检测某个基因的表达,降低或者提高,但是当你得出结果以后,你并不知道是它本身的表达降低/提高了,还是你操作过程中造成的误差（比如提RNA时的损失）,所以这个时候需要同时检测另外的基因作为参照.这个基因就是内参基因,这类基因是生物体或者细胞中稳定表达的基因,表达量几乎不变.常用的内参基因如 β-actin,GAPDH,18s-rRNA等

你的没个样品都应该有个内参基因来对照.这样才有意义

D

甲C ₁₄ H ₁₀ O ₅ 不饱和度是10；1mol甲水解后只生成一种产物乙，其物质的量为2mol，则甲对称，应该有两个苯环，水解后分子中一个苯环、一个羟基、一个羧基。

你做的是DNA的实时定量PCR,还是cDNA的?
模板是DNA的话可以将Ct控制在10-30之间,最大的Ct值在28以内,这样32以后的Ct在计算的时候可以忽略掉.模板是cDNA的话,有些Ct本来就很大,做水的时候更要小心了,戴好口罩手套,仔细着点.
你可以看看溶解曲线的图,只要那张图没有起峰的话,就应该不是水中有污染；如果有峰,且温度非常低,可能是引物二聚体；如果是正儿八经的峰,那就是污染了,做的时候小心些.

解题思路：根据众数的定义找出次数最多的数即可．

∵1，2，3，3，3，4，5，6中，3出现了3次，出现的次数最多；
∴这组数据的众数是3；
故选B．

点评：
本题考点： 众数．

考点点评： 此题考查了众数，用到的知识点是众数的定义，众数是一组数据中出现次数最多的数，注意众数不止一个．

western blot用来检测蛋白表达的变化,而检测表达变化的前提就是,你每个孔跑得总蛋白量是相同的,如果上样量都不同,还怎么检测不同组间目的蛋白量的区别,这样内参就可以作为检测蛋白上样量是否相同的标准.内参一般选那些表达水平比较固定的一些蛋白,比如说actin,这些蛋白的表达水平不会因为你的实验条件而改变,也就是说它始终就是表达那么多,如果这些蛋白的表达量一样,那么我们就认为总的蛋白是相同的.

要在生物体或细胞内稳定表达的基因才能作为PCR的内参基因,因此又名看家基因,由于在不同细胞、组织中常量表达,没有组织特异性,因此不同昆虫之间可以共同使用内参.

内参的选择：普通PCR内参的大小没有多大要求,但real time一般选择300bp以下 它的作用在于你提取的RNA逆转录成cDNA时,加入的浓度可能会不一致,即使用分光广度计测其浓度,也会有仪器误差.PCR时,每个标本都要做对应的内参,而且每次都要做,跑出的条带进行灰度分析,用目的基因的积分光密度比上内参的光密度就是你这个基因实际表达的量.你可以去生物帮那里了解.那里面向生物研究者、企业和研究机构,提供最新、领先、精准、高效、全面的生物产品和技术信息.1.物种：拟南芥(arabidopsis)或maize 2.基因名称：18S rRNA 3.模板：cDNA 4.PCR类型及目的：RT-PCR 5.Forward primer (5’-3’):CCATAAACGATGCCGGA Reverse primer (5’-3’):CACCACCCATAGAATCAAGA Probe:无 6.产物长度(bp)：350 7.引物浓度：50 pmol/ul 8.退火温度：54.1 9.所用仪器：PE-9600 10.提交者ID：yuxing955 11.参考文献原文：本人亲自验证,还有本实验室其他人亲自验证.please click to connect www.***.com/zt/dna/225764.html .hope that i can help you 1.物种：maize 2.基因名称：actin 3.模板：cDNA 4.PCR类型及目的：RT-PCR 5.Forward primer (5’-3’):AAATGACGCAGATTATGTTTGA Reverse primer (5’-3’):GCTCGTAGTGAGGGAGTACC Probe:无 6.产物长度(bp)：7.引物浓度：50 pmol/ul 8.退火温度：54.1 9.所用仪器：PE-9600 10.提交者ID：yuxing955 11.参考文献原文：本人亲自验证,还有本实验室其他人亲自验证 你可以去生物帮自己查找一下啊,

复合电极就是把甘汞电极和玻璃电极做在一起了,原理还是一样的,内参比电极加的是饱合氯化钾溶液,不是盐酸,外部电极是玻璃电极,它们都是与溶液相通的,不相通如何进行反应来产生电极电位.
玻璃泡内外溶液的氢离子浓度不同,产生的电位差不同,以此不测量PH值.

可以鉴定出两种状态下细胞总RNA样品内A基因量的差异,但这个差异包含着误差：
1,总RNA量的不准确性,虽然用分光光度计计算了浓度,但实际上还是有误差的存在,对那些表达水平只差那么丁点儿的样品尤其关键；
2,细胞整体表达水平会在不同情况下有差异,比如说高氧状态下细胞分裂速度更快,此时细胞内绝大多数基因表达水平都上调了,那此时A基因的增加就包括了整体水平的增加量和氧特异性诱导产生的增加量.
所以,我们需要找个能够表现细胞整体表达状态的基因作为参照,用来扣除第2种误差,同时,该参照也可以减少第1种误差对实验结果的误导.

是的,你需要用等量体系分别用每对引物进行PCR.
实际操作时,我们要求至少3份biologic replica,用来检测你所测到的表达变化确实是因为实验组与对照组之间的差别.同时这3份biologic replica需要2份technical replica,以确认差异不是由于具体实验操作过程的失误产生的.