梯度PCR中12道 24道

左边都是引物二聚体,模板是不是不太好,更换新的模板试试
引物问题,检查引物是不是和模板紧密配对,如果不是或者不确定,更换引物
引物之间有重叠,容易形二聚体,更换引物
模板gc含量高,建议用gc buffer 或者增加镁离子浓度

博凌科为-为你梯度PCR只是方便你寻找最佳PCR退火温度,可能减少你做PCR的次数和时间.使用时和楼上的兄弟说的一样,但有一点需要说明一下,就是你所设的温度梯度并不能象楼上的兄弟所说的那么简单,设温度梯度时,第一行的温度是需要一个简单计算的.比如一个12X8的96孔板,如果一共可设12个温度梯度,也就是说每8个孔是一个温度.你所设的初始温度是56度,你设的温度梯度是14,那你每一排的温度相差就是14/12.以些类推.另外,一个PCR引物和体系设计出来以后,如何确定一个基准的温度,然后再根据这个温度上下调整呢?其实一个很实用且简单的方法就是你将你所设计的引物我PCR产物放到Oligo中去评价,它会给你一个最佳的退火温度和循环参数,这个温度实际上就和你通过梯度PCR摸索出来的退火温度几乎是一样的.所以,以我的经验就直接用软件给出的退火温度就没有问题.

两个策略：1.提高退火温度；2.降低镁离子浓度.如果还不行就两个同时进行.

梯度PCR多半是为第一次使用某条引物,为了摸索最佳退火条件设定的.拿到引物的时候,会得到建议的Tm值,两条引物不同,你可以换算出一个退火温度.但是这个退火温度不一定是最佳反应条件,所以可以设定退火的梯度,最常用的是10C,这样每一个反应是一个退火温度,最后电泳可以观察到,在哪一个退火温度下,PCR产物产量和特异性都有保证.这样后面就可以选这个温度进行试验.
但是对于已经有最佳条件的引物,或是反应体系,是不需要做梯度PCR的.

博凌科为-为你我觉得一种可能是模板量过多,如果55度条带最亮的话你可以把它稀释10-50倍做模板.再就是产物降解,这方面也很有可能,我以前也遇到过相同问题,最后还是换了模板成功的.还有建议你下次批的时候做55和62两个梯度,这样比较保险