蛋白质磷酸化如何改变酶的活性?

可以使用蛋白磷酸化水平检测试剂盒（BSP061）或磷酸化蛋白凝胶检测试剂盒（BSP043）来区分蛋白质是否已经磷酸化或者已经脱磷酸化 .

（催化）通过磷酸化激酶和去磷酸化（）是由磷酸酶催化控制细胞周期的关?键.它们被用来控制由调控通路活动确定基板的活性和执行调控通路.通过一系列的方式到下一个底物磷酸化和去磷酸化的外部信号和检查点反应激酶和磷酸酶,细胞周期调控途径.通路最终显示是通过控制M期激酶的磷酸化状态（或S相激酶）,以确定其活动.

M期激酶的活化引发的M阶段的开始,它的失活,离开M期.这表明,M相激酶活性的调节是转换：重新组织细胞的有丝分裂纺锤体底物磷酸化形成,返回到的间期细胞中的状态,需要在同一衬底的脱磷酸化.目标是什么

M期激酶的作用?重新组织的细胞有丝分裂,这些活动直接或间接引起的强积金引起的有丝分裂M期激酶.我们讨论后的结构重新组织,M期激酶探索出多种蛋白底物的作用是直接的还是间接的.它的示范作用,有两个假设：

它可能是主调控因子“的目标蛋白的磷酸化,反过来作用的靶蛋白在调节其他基本功能的一个典型的级联反应.

这可能是一个“工作室”,直接的细胞重新组织必须执行的监管功能或循环决定性的底物磷酸化.

M期激酶的磷酸化共享性质衬底有一对的Ser-Pro序列,位于一侧的碱性氨基酸残基（最常见的是丝氨酸及Pro-X-赖氨酸的形式）,在衬底的潜力是在体M的能力的依赖性激酶制剂磷酸化的底物,这些基底包括组蛋白H1（其可以是染色体缩合的需要）,核纤层蛋白的蛋白质（其可以是溶解核膜的需要）的素数（核仁,阻断核糖体合成的）和其他结构,核仁酶的活性.强度不同的证据,这取决于该基板是在一些循环的方式在体内磷酸化,和M期激酶是一个实际的激活酶.然而,从各种基板,M期激酶似乎直接涉及多种蛋白质在有丝分裂中的细胞结构的变化.

确定一个潜在的底物在细胞周期中,Cdc2的有效目标的标准,是什么呢?在体内相同的网站应该是Cdc2的在细胞周期中的磷酸化的磷酸化,当Cdc2的被激活,它被磷酸化.体内的Cdc2是周期性的磷酸化.理想情况下,CDC2激酶活性,在体内突变可能会导致磷酸化,但目前只在酵母中.要做出这样的结论,是一个显着的活性,该蛋白质的某些功能必须是一个磷酸基团的存在下发生变化.确定是否阻止有丝分裂的功能不磷酸化的磷酸化的氨基酸的突变,这可以被标记.

化Cdc2激酶研究基板H1组蛋白（一个五组的染色质蛋白的蛋白质组成,请参阅第19章）.长期以来被称为是在细胞周期于S期,有丝分裂,加上4个磷酸基团,加上两个磷酸基团的磷酸化的H1细胞H1激酶活动所提供的M期激酶.

细胞周期磷酸化的H1目的,是一个值得思考的问题,不直接表明其染色质结构的影响.可能与M期染色体的聚集,可进行复制（可能需要的解决方案旋转）,或复制后的结果（有丝分裂开始做准备）做准备这些假设是合理的,但这些发生的时间是在S期仍然缺乏了解.然而,H1组蛋白的确是一个良好的基板中的Cdc2激酶的推出,因此已成为H1激酶活性检测体内激酶活性的一种常用的方法,例如,这种检测适用的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中,通过检测H1激酶活性评估周期活性激酶M期,尽管事实上这酵母通常不包含H1组蛋白.

1:磷脂.蛋白质.多糖
2:脱氧核苷酸的高聚物,是染色体的主要成分.
染色体成分是：脱氧核糖核苷酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和蛋白质(PRO)
注意：染色体中有RNA,但是含量很少.大约在1%左右.
对于普通生物而言,只要掌握：染色体主要成分是蛋白质和DNA.
3:蛋白质由肽链组成,肽链由氨基酸组成,氨基酸由中心碳、羟基、羧基和R基组成,这些基团由原子组成/
蛋白质功能有很多,因为有很多不同的蛋白质(血红,载体等等)
功能:这些的实质都是蛋白质,但是它们的功能是运输,血红蛋白是运输氧气什么的,而载体就主要参与主动运输和协助扩散.
又例如酶啦,绝大多数的酶是蛋白质,但是它是催化作用.
还有抗体,参与免疫反应,具有细胞识别的作用.

蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式,在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位.已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因.蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程,其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的,称为蛋白质脱磷酸化.蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一,其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷酸化是在蛋白激酶的催化下,由ATP提供磷酸基及能量完成的,而去磷酸化则是由磷蛋白磷酸酶催化的水解反应.在哺乳动物细胞生命周期中,大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰;在脊椎动物基因组中,有5％的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶[1].真核细胞的蛋白质磷酸化位点主要发生在丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基侧链的羟基上,不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点,生物体内能被磷酸化修饰的蛋白质组成磷酸化蛋白质组(phos-phoproteome),磷酸化蛋白质组将是蛋白质翻译后修饰的研究热点.

磷酸化是指组成蛋白质的氨基酸的羟基被磷酸基团取代,去磷酸化就是磷酸集团在被还原成羟基.一般是很多酶磷酸化和去磷酸化的结构都不一样,导致功能会不一样,比如有的酶磷酸化以后有催化活性,去磷酸化后则没有活性.这样可以理解不?

磷酸化是个开关,一般情况下,蛋白磷酸化后就具有了功能,而去磷酸化就失去了功能；是细胞里面对蛋白功能进行调控的普遍机制.
糖基化是一种翻译修饰,有些蛋白发挥作用需要糖分子、糖链等与别的分子相互作用.是细胞产生不同功能蛋白质的一种形式

电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象.不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同.常用泳动度（或迁移率）来表 示.泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下电泳的速度.电泳技术以支持物分纸电泳,醋酸纤维素薄膜电泳,淀粉凝胶电泳,琼 脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等.经凝胶形状分有水平平板电泳,园盘柱 状电泳及垂直平板电泳.
用支持体的电泳技术：
1.纸上电泳
2.醋酸纤维薄膜电泳
3.薄层电泳
4.非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉,纤维素粉,玻璃粉,硅胶等)
5.凝胶支持体区带电泳 ①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂（糖）凝胶
不用支持体的电泳技术：
1.Tiselius或微量电泳
2.显微电泳
3.等电点聚焦电泳技术
4.等速电泳技术
5.密度梯度电泳
电泳技术的应用
在直流电场中,带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳（electropho-resis）.1809年俄国物理学家Peнce首先发现了电泳现象,但直到1937年瑞典的Tiselius建立了分离蛋白质的界面电泳（boundary electrophoresis）之后,电泳技术才开始应用.本世纪60-70年代,当滤纸、聚丙烯酰胺凝胶等介质相继引入电泳以来,电泳技术得以迅速发展.丰富多彩的电泳形式使其应用十分广泛.电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外,最主要用于蛋白质、核酸、酶,甚至病毒与细胞的研究.由于某些电泳法设备简单,操作方便,具有高分辨率及选择性特点,已成为医学检验中常用的技术.
一、电泳技术的基本原理和分类
在电场中,推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积.
F＝QE
质点的前移同样要受到阻力（F）的影响,对于一个球形质点,服从Stoke定律,即：
F′＝6πrην
式中r为质点半径,η为介质粘度,ν为质点移动速度,当质点在电场中作稳定运动时：
F＝F′即QE＝6πrην
上式交换后可写成
ν/E的含意为单位电场强度下的移动速度,里可用迁移率μ表示,即
从上式可见,球形质点的迁移率,首先取决于自身状态,即与所带电量成正比,与其半径及介质粘度成反比.除了自身状态的因素外,电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率.
电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类.前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳.区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等.
自由电泳法的发展并不迅速,因为其电泳仪构造复杂、体积庞大,操作要求严格,价格昂贵等.而区带电泳可用各种类型的物质作支持体,其应用比较广泛.本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述.
二、影响电泳迁移率的因素
⒈电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降,也称电势梯度.如以滤纸作支持物,其两端浸入到电极液中,电极液与滤纸交界面的纸长为20cm,测得的电位降为200V,那么电场强度为200V/20cm＝10V/cm.当电压在500V以下,电场强度在2-10v/cm时为常压电泳.电压在500V以上,电场强度在20-200V/cm时为高压电泳.电场强度大,带电质点的迁移率加速,因此省时,但因产生大量热量,应配备冷却装置以维持恒温.
⒉溶液的pH值溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量.例如蛋白质分子,它是既有酸性基团（-COOH）,又有碱性基团（-NH2）的两性电解质,在某一溶液中所带正负电荷相等,即分子的净电荷等于零,此时,蛋白质在电场中不再移动,溶液的这一pH值为该蛋白质的等电点（isoelctric point,pI）.若溶液pH处于等电点酸侧,即pH＜pl,则蛋白质带正电荷,在电场中向负极移动.若溶液pH处于等电点碱侧,即pH＞pl,则蛋白质带负电荷,向正极移动.溶液的pH离pl越远,质点所带净电荷越多,电泳迁移率越大.因此在电泳时,应根据样品性质,选择合适的pH值缓冲液.
⒊溶液的离子强度电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低.其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围,形成一个与运动质点符合相反的离子氛（ionic atmosphere）,离子氛不仅降低质点的带电量,同时增加质点前移的阻力,甚至使其不能泳动.然而离子浓度过低,会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量,不易维持溶液的pH值,影响质点的带电量,改变泳动速度.离子的这种障碍效应与其浓度和价数相关.可用离子强度I表示.
式中S表示溶液中离子种类,Ci和Zi分别表示每种离子的摩尔浓度与化合价.最常用I值在0.02-0.2之间.
⒋电渗在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗（electro-osmosis）.其产生的原因是固体支持物多孔,且带有可解离的化学基团,因此常吸附溶液中的正离子或负离子,使溶液相对带负电或正电.如以滤纸作支持物时,纸上纤维素吸附OH-带负电荷,与纸接触的水溶液因产生H3O+,带正电荷移向负极,若质点原来在电场中移向负极,结果质点的表现速度比其固有速度要快,若质点原来移向正极,表现速度比其固有速度要慢,可见应尽可能选择低电渗作用的支持物以减少电渗的影响.
三、电泳分析常用方法
（一）醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯.由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜.这种薄膜对蛋白质样品吸附性小,几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象,又因为膜的亲水性比较小,它所容纳的缓冲液也少,电泳时电流的大部分由样品传导,所以分离速度快,电泳时间短,样品用量少,5μg的蛋白质可得到满意的分离效果.因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测.
醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存.
⒈材料与试剂醋酸纤维素膜一般使用市售商品,常用的电泳缓冲液为pH8.6的巴比妥缓冲液,浓度在0.05-0.09mol/L.
⒉操作要点
⑴膜的预处理：必须于电泳前将膜片浸泡于缓冲液,浸透后,取出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液,不可吸得过干.
⑵加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定.对血清蛋白质的常规电泳分析,每cm加样线不超过1μl,相当于60-80μg的蛋白质.
⑶电泳：可在室温下进行.电压为25V/cm,电流为0.4-0.6mA/cm宽.
⑷染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红,糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff试剂,脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色.
⑸脱色与透明：对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5％醋酸水溶液.为了长期保存或进行光吸收扫描测定,可浸入冰醋酸：无水乙醇＝30:70（V/V）的透明液中.
（二）凝胶电泳
以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳.其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸.琼脂糖凝胶孔径较大,对一般蛋白质不起分子筛作用,但适用于分离同工酶及其亚型,大分子核酸等应用较广,介绍如下：
⒈琼脂糖凝胶电泳的原理概述琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖.其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖.许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶.因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化.在临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测.
⒉琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中,DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响,如共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA.当凝胶浓度太高时,凝胶孔径变小,环状DNA（球形）不能进入胶中,相对迁移率为0,而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移,相对迁移率大于0.
⑴设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种.其中水平型可制备低浓度琼脂糖凝胶,而且制胶与加样都比较方便,故应用比较广泛.核酸分离一般用连续缓冲体系,常用的有TBE（0.08mol/l Tris·HCl,pH8.5,0.08mol/L硼酸,0.0024mol/l EDTA）和THE（0.04mol/l Tris·HCl.pH7.8,0.2mol/L醋酸钠,0.0018mol/l EDTA）.
⑵凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5％-0.8％琼脂糖凝胶溶液,沸水浴或微波炉加热使之融化,冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/ml,然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中,厚度依样品浓度而定.注胶时,梳齿下端距玻璃板0.5-1.0mm,待脱凝固后,取出梳子,加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处.
⑶样品制备与加样：溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料（0.025％溴酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（10％-15％）或甘油（5％-10％）,也可使用2.5％Fico Ⅱ增加比重,使样品集中,每齿孔可加样5-10μg.
⑷电泳：一般电压为5-15V/cm.对大分子的分离可用电压5V/cm.电泳过程最好在低温条件下进行.
⑸样品回收：电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况,对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收,如电泳洗脱法：在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶,将其装入透析袋（内含适量新鲜电泳缓冲液）,扎紧透析袋后,平放在水平型电泳槽两电极之间的浅层缓冲液中,100V电泳2-3小时,然后正负电极交换,反向电泳2分钟,使透析袋上的DNA释放出来.吸出含DNA的溶液,进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收.
其它还有低融点琼脂糖法、醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等,但各种方法都仅仅有利于小分子量DNA片段（＜1kb）的回收,随着DNA分子量的增大,回收量显著下降.
（三）等电聚焦电泳技术
等电聚焦（isoelectric focusing,IEF）是60年代中期问世的利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术.由于其分辨率可达0.01pH单位,因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分.
⒈IEF的基本原理在IEF的电泳中,具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极,pH值逐渐增大.如前所述,蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征,这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动,直至某一pH位点时失去电荷而停止移动,此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）.同理,位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动,直到它们的等电点上聚焦为止.可见在该方法中,等电点是蛋白质组分的特性量度,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中,在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上,形成分离的蛋白质区带.
⒉pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种,一种是人工pH梯度,由于其不稳定,重复性差,现已不再使用.另一种是天然pH梯度.天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物,在正极端吸入酸液,如硫酸、磷酸或醋酸等,在负极端引入碱液,如氢氧化钠、氨水等.电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值,即各段介质中的pH相等,用pH0表示.电泳开始后,混合物中pH最低的分子,带负电荷最多,pI1为其等电点,向正极移动速度最快,当移动到正极附近的酸液界面时,pH突然下降,甚至接近或稍低于PI1,这一分子不再向前移动而停留在此区域内.由于两性电解质具有一定的缓冲能力,使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围.pH稍高的第二种两性电解质,其等电点为pI2,也移向正极,由于pI2＞pI1,因此定位于第一种两性电解质之后,这样,经过一定时间后,具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列,形成了从正极到负极等电点递增,由低到高的线性pH梯度,如图16-3所示.
⒊两性电解质载体与支持介质理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导,前者保证pH梯度的稳定,后者允许一定的电流通过.不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀.两性电解质的分子量要小,易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开,而且不应与被分离物质发生反应或使之变性.
图16－3 pH梯度形成示意图
常用的pH梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等,其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用.
电泳后,不可用染色剂直接染色,因为常用的蛋白质染色剂也能和两性电解质结合,因此应先将凝胶浸泡在5％的三氯醋酸中去除两性电解质,然后再以适当的方法染色.
（四）其他电泳技术
⒈IEF/SDS-PAGE双向电泳法1975年O′Farrall等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立了IEF/Sd S-PAGE双向电泳.其中IEF电泳（管柱状）为第一向,SDS-PAGE为第二向（平板）.在进行第一向IEF电泳时,电泳体系中应加入高浓度尿素、适量非离子型去污剂NP-40.蛋白质样品中除含有这两种物质外还应有二硫苏糖醇以促使蛋白质变性和肽链舒展.
IEF电泳结束后,将圆柱形凝胶在SDS-PAGE所应用的样品处理液（内含SDS、β-巯基乙醇）中振荡平衡,然后包埋在SDS-PAGE的凝胶板上端,即可进行第二向电泳.
IEF/ SDS-PAGE双向电泳对蛋白质（包括核糖体蛋白、组蛋白等）的分离是极为精细的,因此特别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分.
⒉毛细管电泳 Neuhoff等人于1973年建立了毛细管均一浓度和梯度浓度凝胶用来分析微量蛋白质的方法,即微柱胶电泳,均一浓度的凝胶是将毛细管浸入凝胶混合液中,使凝胶充满总体积的2/3左右,然后将其揿入约厚2mm的代用粘土垫上,封闭管底,用一支直径比盛凝胶的毛细管更细的硬质玻璃毛细管吸水铺在凝胶上.聚合后,除去水层并用毛细管加蛋白质溶液（0.1-1.0μl,浓度为1-3mg/ml）于凝胶上,毛细管的空隙用电极缓冲液注满,切除插入粘土部分,即可电泳.
毛细管电泳分析仪的诞生,特别是美国生物系统公司的高效电泳色谱仪为DNA片段、蛋白质及多肽等生物大分子的分离、回收提供了快速、有效的途径.高效电泳色谱法是将凝胶电泳解析度和快速液相色谱技术溶为一体,在从凝胶中洗脱样品时,连续的洗脱液流载着分离好的成分,通过一个连机检测器,将结果显示并打印记录.高效电泳色谱法既具有凝胶电泳固有的高分辨率,生物相容性的优点,又可方便地连续洗脱样品.

磷酸化(由激酶催化)和去磷酸化(由磷酸酶催化)是控制细胞周期的关键.它们都被用来控制调控途径自身活性和执行调控途径决定的底物活性.细胞周期调控途径由一系列激酶和磷酸酶组成,它们通过将途径的下一个底物磷酸化和...

组蛋白的磷酸化一般导致对应区域基因表达的上调.表观遗传调控包括DNA甲基化,组蛋白修饰（磷酸化,乙酰化,甲基化等）和小RNA调节,是在DNA序列的基础上对基因表达的调节,是细胞分化的本质.如果除去表观遗传调控,人体各个细胞应该是一样的,但是组蛋白修饰在DNA复制过程中不但可以被复制,也可以在相应蛋白（如组蛋白乙酰化酶）的作用下改变修饰方式,导致各种细胞基因表达的差异.
具体原理就是不同的修饰方式改变了染色小体的构象,进而调节了转录因子和DNA的相互作用,小RNA调节则通过改变mRNA和核糖体的相互作用从而达到其调节基因表达的作用.

(SILAC)的方法,可以同步定量细胞内蛋白质表达及其磷酸化水平.对于单个蛋白质从系统水平上看,这一方法可以揭示转录因子磷酸化对其下游靶基因的调控关系.

磷酸化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一,磷酸化肽段和非磷酸化肽段的不同特性,使得磷酸化肽段和非磷酸化肽段的同步鉴定及定量成为蛋白质组学研究中的难点.生化与细胞所博士生伍一博等人在曾嵘研究员指导下,运用该实验室发明的阴阳多维液相色谱-质谱系统(Yin-Yang-MDLC-MS/MS)及在线pH梯度洗脱对细胞内蛋白质酶解肽段进行分级分离,实现了一次实验中对磷酸化肽段和非磷酸化肽段的同步鉴定.进一步结合稳定同位素标记 (SILAC)的方法,可以同步定量细胞内蛋白质表达及其磷酸化水平.对于单个蛋白质而言,这一方法有助于区分两种不同的磷酸化水平改变方式,即直接受激酶调控,或者通过蛋白质表达量的变化而变化.从系统水平上看,这一方法可以揭示转录因子磷酸化对其下游靶基因的调控关系.该工作以脂肪细胞为研究对象,鉴定到了一些在分化早期磷酸化水平或表达量发生显著变化的蛋白质,进一步的生物信息学分析揭示了一些转录因子磷酸化水平与下游靶基因表达水平的关系.这一工作为系统水平上诠释脂肪细胞分化早期分子事件提供了研究策略和实验依据,发展的技术方法也可以广泛应用于信号转导分子机制研究.