细胞冻存的操作步骤

细胞冻存融化的原则是缓冻速融
细胞冻存（慢）
1.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清,4℃冰箱保存预冷；
2.用胰酶对细胞进行消化：倒去培养瓶中的培养基或用枪小心吸去培养板中的培养基,PBS冲洗两次,用胰酶消化细胞（尽可能温和）；
3.将预冷的冻存液悬浮细胞,用滴管轻轻吹打混匀.
4.在每支冻存管中加入1ml细胞液,密封后标记冻存细胞名称和冻存日期.
5.冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力,如果有程序降温器（放在-80℃冰箱过夜,放入液氮罐）最好；或者可以在4℃,2h；然后转到-20℃,2h；-80℃,2h；放入液氮罐.
细胞冻存管融化（快）
1.将细胞冻存管取出,浸入37℃水浴锅内,轻轻晃动,注意融化,当融得只剩一个小冰块时,将细胞插入冰中.
2.加入4℃预冷的培养基,用手指轻弹悬浮细胞团.
3.250g离心10min,去除上清液,再加入培养基,轻轻悬浮.
4.尽量将细胞中的DMSO洗去,计数.
在细胞冻存过程中,所结的冰晶对细胞伤害较大,所以过程一定要慢,DMSO能减少冰晶伤害.
在细胞复苏过程中,要快,以减少融化对细胞的伤害,其实还是冰晶的问题.DMSO浸润的细胞非常脆弱,所以可要尽快将DMSO去除,一定要轻.

渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内,一般是一些小分子物质,主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等；
非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内,一般是些大分子物质,主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等.

不能,-80度冰箱温度太高了,冷冻速度也不够

要是真的能够保证-80度恒定,应该不会全死掉.
因为已经通过0度到-60度的冰晶期了.

注意：将细胞悬浮好之后,再加入DMSO,加入DMSO后,马上悬浮细胞,系入冻存管.4度过夜,放入液氮；如果没有液氮,-80度冻细胞不好

不能用透析血清是因为细胞还会有短时间的生长,就像还需要加培养基一样.血清的浓度从10%到90%都有人用,我们用的10%的血清也没问题,不过想要细胞长的更好,多加点血清总是没坏处的.

像是传代一样,比如说你冻存的时候,细胞长满了,或者成团了,是P8代,再传一代就是P9了,冻存只是在传代的时候冻了一下,拿出来复苏就等于传了一代,所以复苏后是P9