DNA甲基化状态如何被DNA复制的调节和DNA修复所利用?

甲基化特异的PCR扩增法是采用重亚硫酸盐处理DNA,未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶（U）,而甲基化的胞嘧啶(C)不变.采用特异两对的PCR引物,其中每对引物中的一条针对检测位点,其或A,若用3端的最后一个为G的引物从处理过的DNA扩增出特异产物,表明存在甲基化,若用3端的最后一个为A的引物从处理过的DNA扩增出特异产物,表明没有甲基化（因为C变为U）.这种方法的优点是避免了酶切不完全可能导致的假阳性问题,敏感性高.

去哪里找最出色的生命科学学术交流论坛?>>> 方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找.
1) 基因组整体水平甲基化分析
a) 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法
b) SssI 甲基转移酶法
c) 免疫化学法
d) 氯乙醛法
2) 特异性位点的DNA甲基化的检测
a) 甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法
b) 直接测序法
c) 甲基化特异性的PCR（methylation-specific PCR, MS-PCR）
d) 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)
e) 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（combined bisulfite restriction analysis,COBRA）
f) 甲基化敏感性单链构象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis,MS-SSCA）
g) 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳（methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis,MS-DGGE）
h) 甲基化敏感性解链曲线分析（methylation-specific melting curve analysis,MS-MCA）
i) 荧光法（Methylight）
j) DNA微阵列法
k) 甲基化敏感性斑点分析（methylation sensitive dot blotassay,MS-DBA）
l) 甲基化特异性多连接依赖性探针扩(Methylation-Specific multiplex ligation-dependent probe amplification,MS-MLPA)
3) 甲基化新位点的寻找

在甲基转移酶的催化下,DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基,形成5－甲基胞嘧啶,这常见于基因的5'-CG-3'序列.大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶,主要集中在基因5'端的非编码区,并成簇存在.甲基化位点可随DNA的复制而遗传,因为DNA复制后,甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化.DNA的甲基化可引起基因的失活.
　　DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG）
DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,大量研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达.

由于甲基化之后基因的表达说平有所下降,因此,细胞癌变之后基因变化为：
抑癌基因的甲基化水平增加；原癌基因的甲基化水平有所下降.

他们最大的区别就是前者不能遗传,后者可以遗传……
同样可以收到环境制约,但是后者发生的变化可以遗传给下一代,DNA甲基化可以导致染色体甲基化,甲基基团可以募集很多酶,进一步修饰周围的DNA和染色体,并且经过半保留复制,和复制后的再度甲基化,可以遗传下去,比如有研究发现吃奶现象是DNA甲基化的结果
参考表观遗传学的概念：
“表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科.表观遗传的现象很多,已知的有DNA甲基化（DNA methylation）,基因组印记（genomic impriting）,母体效应（maternal effects）,基因沉默（gene silencing）,核仁显性,休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等.”

DNA甲基化发生于DNA的CpG island　（CG序列密集区）.发生甲基化后,那段DNA就可以和甲基化DNA结合蛋白相结合.结合后DNA链发生高度的紧密排列,其他转录因子,RNA合成酶都无法再结合了,所以这段DNA的基因就无法得到表达了.

可以的.
普通的PCR反应是不会把甲基化修饰加上去的,你可以利用这个特点消除甲基化.

基因组中60%～90% 的CpG 都被甲基化,未甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛,位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点.有实验证明超甲基化阻遏转录的进行.DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化,使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点,以及DNA 酶的敏感位点,使染色质高度螺旋化,凝缩成团,失去转录活性.5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶,由此可能导致基因置换突变,发生碱基错配:T2G,如果在细胞分裂过程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症,而且,生物体甲基化的方式是稳定的,可遗传的.

DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,可能存在于所有高等生物中.DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达.
1.DNA甲基化的主要形式
5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤.在真核生物中,5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG和CpXpG中,原核生物中CCA/TGG和GATC也常被甲基化.
真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性:一种被称为日常型(mainte-nance)甲基转移酶,另一种是从头合成(denovo synthesis)甲基转移酶.前者主要在甲基化母链(模板链)指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化.日常型甲基转移酶常常与DNA内切酶活性相耦联,有3种类型.II类酶活性包括内切酶和甲基化酶两种成分,而I类和III类都是双功能酶,既能将半甲基化DNA甲基化,又能降解外源无甲基化DNA.
由于甲基化胞嘧啶极易在进化中丢失,所以,高等真核生物中CG序列远远低于其理论值.哺乳类基因组中约存在4万个CG islands,大多位于转录单元的5'区.
没有甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用,就可能被氧化成为U,被DNA修复系统所识别和切除,恢复成C.已经甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用, 它就变为T, 无法被区分.因此, CpG序列极易丢失.
结构基因含有很多CPG 结构, 2CPG 和2GPC 中两个胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化, 且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构.基因组中60%～ 90% 的CPG 都被甲基化, 未甲基化的CPG 成簇地组成CPG 岛, 位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点.有实验证明超甲基化阻遏转录的进行.DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化, 使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点, 以及DNA 酶的敏感位点, 使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 失去转录活性.5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶, 由此可能导致基因置换突变, 发生碱基错配: T2G, 如果在细胞分裂过程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症, 而且, 生物体甲基化的方式是稳定的, 可遗传的.
DNA 甲基转移酶有两种: 1) DNM T1, 持续性DNA 甲基转移酶—— 作用于仅有一条链甲基化的DNA 双链, 使其完全甲基化, 可参与DNA 复制双链中的新合成链的甲基化,DNM T1 可能直接与HDAC (组蛋白去乙酰基转移酶) 联合作用阻断转录; 2)DNM T3a、DNM T3b从头甲基转移酶, 它们可甲基化CPG, 使其半甲基化, 继而全甲基化.从头甲基转移酶可能参与细胞生长分化调控, 其中DNM T3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用.
DNA 去甲基化有两种方式: 1) 被动途径: 由于核因子N F 粘附甲基化的DNA , 使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化, 从而阻断DNM T1 的作用; 2) 主动途径: 是由去甲基酶的作用, 将甲基集团移去的过程.在DNA 甲基化阻遏基因表达的过程中, 甲基化CPG 粘附蛋白起着重要作用.虽然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、A P2、CM ycöM yn、N F2KB、Cmyb、Ets, 使它们失去结合DNA 的功能从而阻断转录, 但是, 甲基化CPG 粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子(SP1、CTF、YY1) , 使它们失活, 从而阻断转录.人们已发现5 种带有恒定的甲基化DNA 结合域(MBD ) 的甲基化CPG 粘附蛋白.其中M ECP2、MBD1、MBD2、MBD3 参与甲基化有关的转录阻遏;MBD1 有糖基转移酶活性, 可将T 从错配碱基对TöG 中移去,MBD4 基因的突变还与线粒体不稳定的肿瘤发生有关.在MBD2 缺陷的小鼠细胞中, 不含M ECP1 复合物, 不能有效阻止甲基化基因的表达.这表明甲基化CPG 粘附蛋白在DNA 甲基化方式的选择, 以及DNA 甲基化与组蛋白去乙酰化、染色质重组相互联系中的有重要作用.
DNA甲基化是后天基因沉默的一种主要决定性因素,在这个复杂的过程中,有三种DNA甲基转移酶催化S-腺苷-L-甲硫氨酸的一个甲基转移并加到胞嘧啶的5位碳上.这一过程与转录调节、染色体结构、外源DNA侵袭时细胞的自我保护密切相关.DNA甲基化多发生在CpG二核苷岛,是最常见的哺乳动物基因组DNA后天修饰.CpG岛是幼体突变及肿瘤抑制基因失活性突变中非常重要的发生位点.在人类癌症中,大约有25%的p53基因的突变发生在CpG岛.在癌细胞中,有大量的基因组发生了低甲基化,尤其在那些包含重复元件的正常的超甲基化并沉默的区域也发生了彻底的去甲基化.在很多癌症发生的实验模型中,这种甲基数量的降低在肿瘤发生的早期就出现了.

参考见方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲基化的检测和新甲基化位点的寻找.
1) 基因组整体水平甲基化分析
a) 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法
b) SssI 甲基转移酶法
c) 免疫化学法
d) 氯乙醛法
2) 特异性位点的DNA甲基化的检测
a) 甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法
b) 直接测序法

你做的是什么样本?我做的是人外周血,尽量在无菌环境中操作,但不需要严格无菌