Western Blotting 没有吐温怎么洗膜

嗯,同意楼上的说法,内参一般都是选用细胞内表达稳定,表达量比较高的蛋白,比如一些骨架蛋白.这些蛋白一般认为不会因为实验处理,细胞状态不同而在总蛋白中的含量有大的起伏.
有内参的话,你的目的蛋白的表达的比较才有意义,否则的话,你说某一组的目标蛋白表达升高了,怎么排除你上样上多了的原因.

不需要.stripping buffer是强碱,连抗原-抗体的结合都能洗掉.非特异沾上的那点东西,轻轻松松就洗掉了.

一抗就是针对你的蛋白的抗体,一般比较特异,若你的蛋白不是常见的,则需要定制（譬如用你的蛋白注射兔子）
二抗是针对一抗的抗体,看你的一抗来自哪种动物,它具有普遍性.不管你的蛋白是什么,只要是从某种动物譬如兔子中获得的一抗,二抗就都可以用同一种抗兔的.所以商品化程度很高
二抗上一般链接一些基团,经反应后显色可以检验目标蛋白

方法
1. Western blotting
Western blotting法检测P53靶向抑制剂-EGFR对人结肠癌细胞株（HT-29,colo205）中,p53/p27信号通路下游关键因子p27的蛋白表达情况,并将人结肠癌细胞株区分为p27高表达的细胞株和低表达的细胞株.
Methodology
1. Western blotting
The protein expression of the p53/p27 signal pathway downstream key factor p27 in the treatment of human colon carcinoma cell strain（HT-29,colo205）by P53 targeted inhibitor EGFR was examined by the Western blotting method, and the human colon carcinoma cell strains were separated into p27 high expression and low expression cell strains.
2. MTT和RT-PCR
MTT法测定EGFR对结肠癌细胞转染前后抑制率的变化,RT-PCR法测定p27沉默前后,mRNA的表达量的变化,根据实验结果进行统计分析.
2. MTT and RT-PCR
While the detection of the changes in inhibition rate of EGFR before and after colon carcinoma cell transfection was conducted by the MTT method, the RT-PCR method was used to detect mRNA expression level changes before and after P27 silencing, and then a statistic analysis was conducted based on the experiment results.
【英语牛人团】

楼主赶着出结果吗?三步并作两步,两步毁成一步……
个人强烈不建议三种ist antibody加在一起,因为这样做,三种抗体的nonspecific bands会重叠,遮盖需要分辨的蛋白.除非,你能确定这三种抗体的基质特异性非常高,否则,洗出来的照片就是一团黑.
如果,你真得很着急,推荐下面这个办法.如果你能确定这三种蛋白的大小相差很多,比如说A=250k B=120k C=75k.那么你就可以把VDPF Membrane切成三段,分别进行1st immunoblot,同样省时而且结果更干净.唯一需要注意的是,这样做的结果好像是不可以公开发表的（至少在我们这里是这样）,因为blot的条件不同,如果你只想测试蛋白性质,那么完全没关系.
第二个问题,因为我本身没做过CBB染色,不敢妄言.在实验室里问了一小圈,不管是东洋鬼子还是西洋鬼子都告诉我如果洗净（具体方法我没问）足够的话不排除可能可以.但大家都说比较adventurous,劝楼主慎重.

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称.近二十几年来,免疫学分析方法发展很快,特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后,使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比.继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后,1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法,建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术.它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术,是一种用酶标记抗原或抗体的方法.由于酶的高效生物催化作用,一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应,产生了放大作用,使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来.
ELISA试验是一种敏感性高,特异性强,重复性好的实验诊断方法.将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来,可敏感地检测体液中微量的特异性抗体或抗原.此项技术自70年代初问世以来,发展十分迅速,由于其试剂稳定、易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域.
ELISA基本原理
ELISA是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术.
ELISA基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记,基本原理有三条：
（1） 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性；
（2） 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；
（3） 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果.
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性.
在测定时,把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例.加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析.由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度.
免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术.它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等).免疫组化技术近年来得到迅速发展.50年代还仅限于免疫荧光技术,50年代以后逐渐发展建立起高度敏感,且更为实用的免疫酶技术.
　　免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合,制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.观察结果.
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种.它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术.很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位.Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功.这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）.

可能是你要检测的蛋白的表达量会受血清影响

是有收缩现象的,这都是正常.特别是看到预染MARK的位置变了.没关系,以膜上的条带为准.