请问一下菌种鉴定的方法和实验步骤

实验步骤：菌种鉴定工作是各类微生物学实验室都经常遇到的基础性工作.不论鉴定对象属哪一类,其工作步骤都离不开以下三步：①获得该微生物的纯种培养物；②测定一系例必要的鉴定指标；③查找权威性的鉴定手册. 一、经典分类鉴定方法 群体：菌落形态,在半固体或液体培养基中的生长状态等
* 形态 个体：细胞形态,染色反应,各种特殊构造等
* 营养要求：能源,碳源,氮源,生长因子等
* 生理、生化反应 酶；产酶种类和反应物性等
* 代谢产物：种类,产量,显色反应等
* 经典指标 生态特性：生长温度,对氧的需要,宿主种类等
* 生活史特点
* 血清学反应
* 噬菌体的敏感性
* 其它
经典分类法
经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法.其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类,并在分类中将表型特征分为主、次.一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分. * A. 能在 60 o C 以上生长
* B. 细胞大,宽度 1.3~1.8mm ………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )
* B. 细胞小,宽度 0.4~0.8mm
* C. 能以葡萄糖为碳源生长
* D. 能在 pH4.5 生长 …………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus )
* DD. 不能在 pH4.5 生长 …………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus )
* CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源 ……………… 4. 栖热嗜油菌属 ( 栖热嗜狮菌属 Thermoleophilum )
* AA. 不能在 60 o C 以上生长
二、现代分类鉴定方法
* 　近年来,随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用,促使微生物分类鉴定工作有了飞速发展.对微生物鉴定工作来说,已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传学特性的鉴定、细胞化学组分的精确分析以及利用电子计算机进行数值分类研究等新的层次上.
* （一）微生物遗传型的鉴定
* DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体.每一种微生物均有其自己特有的、稳定的DNA成分和结构,不同微生物间DNA成分和结构的差异程度代表着它们间新缘关系的远近.因此,测定每种微生物DNA的若干重要数据,是微生物鉴定中极其重要的指标：
1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)* 每一个微生物种的 DNA 中 GC mol% 的数值是恒定的,不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化,而且在同一个属不同种之间, DNA 中 GCmol% 的数值不会差异太大,可以某个数值为中心成簇分布,显示同属微生物种的 GC mol% 范围. DNA 中 GC mol% 分析主要用于区分细菌的属和种,因为细菌 DNA 中 GC 含量的变化范围一般在 25 ％～ 75 ％；而放线菌 DNA 中的 GC 比例范围非常窄 (37 ％～ 51%) .一般认为任何两种微生物在 GC 含量上的差别超过了 10 ％,这两种微生物就肯定不是同一个种.因此可利用 G+C mol ％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度.值得注意的是,亲缘关系相近的菌,其 G+C mol ％含量相同或者近似,但 G+C mol ％相同或近似的细菌,其亲缘关系并不一定相似,这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列,而且如放线菌的 DNA 的 GC mol% 在 37 ～ 51 之间,企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的.要比较两种细菌的 DNA 碱基对排列序列是否相同,以及相同的程度如何,就需做核酸杂交试验.
1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)* 1）每个生物种都有特定的GC%范围,因此后者可以作为分类鉴定的指标.细菌的GC%范围为25--75%,变化范围最大,因此更适合于细菌的分类鉴定.
* 2）GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定,并可检验表型特征分类的合理性,从分子水平上判断物种的亲缘关系.
* 3）使用原则：
* G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定每一种生物都有一定的碱基组成,亲缘关系近的生物,它们应该具有相似的G+C含量,若不同生物之间G+C含量差别大表明它们关系远.但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系.
1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)* 同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%.所以G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征,它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义.
* 若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株,如果其G+C含量的差别大于5%,则肯定不是同一个种,大于15%则肯定不是同一个属.
* 在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时,G+C含量是一项重要的,必不可少的鉴定指标.其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些G+C含量差别大的种类排除出某一分类单元.
2.核酸的碱基组成和分子杂交：* 与形态及生理生化特性的比较不同,对DNA的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异,因此结果更加可信.
DNA-DNA 杂交
* DNA 杂交法的基本原理是用 DNA 解链的可逆性和碱基配对的专一性,将不同来源的 DNA 在体外加热解链,并在合适的条件下,使互补的碱基重新配对结合成双链 DNA ,然后根据能生成双链的情况,检测杂合百分数.如果两条单链 DNA 的碱基顺序全部相同,则它们能生成完整的双链,即杂合率为 100% .如果两条单链 DNA 的碱基序列只有部分相同,则它们能生成的“双链”仅含有局部单链,其杂合率小于 100% .由此；杂合率越高,表示两个 DNA 之间碱基序列的相似性越高,它们之间的亲缘关系也就越近.如两株大肠埃希氏菌的 DNA 杂合率可高达 100 ％,而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的 DNA 杂合率较低,约有 70 ％. G+Cmol ％的测定和 DNA 杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径,解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题,但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决.
DNA — rRNA 杂交
* 目前研究 RNA 碱基序列的方法有两种.一是 DNA 与 rRNA 杂交,二是 16S rRNA 寡核苷酸的序列分析. DNA 与 rRNA 杂交的基本原理、实验方法同 DNA 杂交一样,不同的是① 是 DNA 杂交中同位素标记的部分是 DNA ,而 DNA 与 rRNA 杂交中同位素标记的部分是 rRNA .② DNA 杂交结果用同源性百分数表示,而 DNA 与 rRNA 杂交结果用 Tm(e) 和 RNA 结合数表示. Tm(e) 值是 DNA 与 rRNA 杂交物解链一半时所需要的温度. RNA 结合数是 100 m gDNA 所结合的 rRNA 的 m g 数.根据这个参数可以作出 RNA 相似性图.在 rRNA 相似性图上,关系较近的菌就集中到一起.关系较远的菌在图上占据不同的位置.用 rRNA 同性试验和 16SrRNA 寡核苷酸编目的相似性比较 rRNA 顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念,并导致了古细菌的建立.
3.建立16 S r RNA系统发育树
* a）使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群；
* 传统的生物进化研究,主要基于复杂的形态学和化石记载,因此多限于研究后生生物（metazoa）,而后者仅占整个生物进化历程的1/5
* b）提出了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法；
* c）对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据；
* d）突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制,建立了全新的微生物分类、鉴定理论；
* e）为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理论和研究方法,特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进行研究.
3、 16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析
* 首先, 16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中. rRNA 参与生物蛋白质的合成过程,其功能是任何生物都必不可少的,而且在生物进化的漫长历程中保持不变,可看作为生物演变的时间钟.其次,在 16S rRNA 分子中,既含有高度保守的序列区域,又有中度保守和高度变化的序列区域,因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究.第三, 16S rRNA 的相对分子量大小适中,约 1 540 个核苷酸,便于序列分析.因此,它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具.
分离菌株 16S rRNA 基因
* .从平板中直接挑取一环分离菌株细胞 , 加入 100μL 无菌重蒸 H 2 O 中 , 旋涡混匀后 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 离心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因,可直接用于 PCR 扩增.分离菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序列测定的一般步骤为： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ； 5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3' .扩增反应体积 50 m L ,反应条件为 95 ℃预变性 5min , 94 ℃变性 1min , 55 ℃退火 1min , 72 ℃延伸 2min ,共进行 29 个循环, PCR 反应在 PTC-200 型热循环仪上进行.取 5 m L 反应液在 10g L -1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测. PCR 产物测序可由专门技术公司完成.
比对分析
* 测序得到 分离菌株 16S rDNA 部分序列,此序列一般以 *.f.seq 形式保存,可以用写字板或 Editsequence 软件打开,将所得序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据进行比对分析 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast ) ,具体步骤如下：点击网站中 Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] 选项,将测序所得序列粘贴在“ search ”网页空白处,或输入测序结果所在文件夹目录,点击核酸比对选项,即“ blast ”,然后点击“ format ”,计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较,根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属,以及菌株相关信息,从而初步判断 16S rDNA 鉴定结果.
比对分析
* 遗传距离矩阵与系统发育树构建,可采用 DNAStar 软件包中的 MegAlign 程序计算样本间的遗传距离.由 GenBank 中得到相关菌株的序列,与本研究分离菌株所测得序列一起输入 Clustalx1.8 程序进行 DNA 同源序列排列,并经人工仔细核查.在此基础上,序列输入 Phylip3.6 软件包,以简约法构建系统发育树.使用 Kimura 2-parameter 法,系统树各分枝的置信度经重抽样法（ Bootstrap ） 500 次重复检测, DNA 序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值.
（二）细胞化学成分的鉴定* 除上述核酸成分外的其它化学成分的测定,是微生物化学分类法的重要内容,主要包括：1.细胞壁的化学成分.2.全细胞水解液的糖型.3.磷酸类脂成分的分析.4.枝菌酸的分析.5. 醌类的分析.6.气相色谱技术的应用.
（二）细胞化学成分的鉴定
* 微生物分类中,根据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法称化学分类法 (chemotaxonomy) .在近二十多年中,采用化学和物理技术采研究细菌细胞的化学组成,已获得很有价值的分类和鉴定资料,各种化学组分在原核微生物分类中的意义见表
细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用
细胞化学成分鉴定的意义
* 随着分子生物学的发展,细胞化学组分分析用于微生物分类日趋显示出重要性.细胞壁的氨基酸种类和数量现己被接受为细菌属的水平的重要分类学标准.在放线菌分类中,细胞壁成分和细胞特征性糖的分析作为分属的依据,已被广泛应用.脂质是区别细菌还是古菌的标准之一,细菌具有酰基脂 ( 脂键 ) ,而古菌具有醚键脂,因此醚键脂的存在可用以区分古菌.霉菌酸的分析测定己成为诺卡氏菌形放线菌分类鉴定中的常规方法之一.鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇杆菌等细胞膜都含有鞘氨醇,因此鞘氨醇的有无可作为此类细菌的一个重要标志.此外某些细菌原生质膜中的异戊间二烯醌,细胞色素,以及红外光谱等分析对于细菌、放线菌中某些科、属、种的鉴定也都十分有价值.
（三）数值分类法
* 数值分类法亦称统计分类法,是在约200年前与林奈同代人M.Adanson (1727 ~1806,法国植物学家)发展的分类原理基础上借助于现代的电子计算机技术而发展起来的.数值分类的基本步骤为：（1）计算两菌株间的相似系数；（2）列出相似度矩阵；（3）将矩阵图转换成树状谱.
数值分类的基本步骤
数值分类法
* 又称阿德逊氏分类法 .它的特点是根据较多的特征进行分类,一般为 50 ～ 60 个,多者可达 100 个以上,在分类上,每一个特性的地位都是均等重要.通常是以形态、生理生化特征,对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据.最后,将所测菌株两两进行比较,并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值,列出相似值矩阵 ( 图 14-5) .为便于观察,应将矩阵重新安排,使相似度高的菌株列在一起,然后将矩阵图转换成树状谱 (dendrogram) ,再结合主观上的判断 ( 如划分类似程度大于 85 ％者为同种,大于 65 ％者为同属等 ) ,排列出—个个分类群.
数值分类法的优越性
* 数值分类法的优越性在于它是以分析大量分类特征为基础,对于类群的划分比较客观和稳定；而且促进对细菌类群的全面考查和观察,为细菌的分类鉴定积累大量资料.但在使用数值分类法对细菌菌株分群归类定种或定属时,还应做有关菌株的 DNA 碱基的 G + Cmol% 和 DNA 杂交,以进一步加以确证.