考马斯亮蓝法测蛋白质含量标准曲线不过原点怎么办

透明质酸中的蛋白质指的是一种蛋白聚糖中的蛋白质吗,是否应该考虑除去其中的糖胺聚糖,将蛋白质纯化,因为考马斯亮蓝需要与蛋白质结合才能显色,样品中的糖胺聚糖可能有影响,或者是样品污染
考马斯亮蓝溶液应为酸性,并且变成蓝绿色是就不能再使用了
实验时一定要最后加入蛋白质溶液,
另外,样品中的Tris、乙酸、2-巯基乙醇、EDTA等物质对实验结果有少量颜色干扰,可以在做标准曲线时可以用缓冲液代替蒸馏水,就可以将干扰扣除,
但是大量的去污剂如SDS对颜色的影响太大不容易去除,只能想办法从样品中去除去污剂,

我刚做过了,刚开始做也是这样的,后来发现我用的考马斯亮蓝是R250,做标准曲线要用G250的,换过之后一次就测出来了,而且R有两个9.

空白组是水?
出现这个情况可能是你的样品中的蛋白质含量确实很低,低过一定浓度时,结果就没有参考价值了.
也有可能是考蓝工作液存放时间太久失效了,可以用一些蛋白标准品（比如BSA）来检验一下考蓝工作液是否正常.
如果要用缓冲液做空白组的话,就用和蛋白样品一样的缓冲液就可以了

调零当然是用染色剂了,加和蛋白一样的水.商品化的和我们自己配的颜色都不一样,我们自己配的就是有点发青,用起来还是蛮不错的,和BCA的试剂盒差不多,蛮不错的.

当然不对,你可用BCA法定量

该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不适用于小分子碱性多肽的定量.如核糖核酸酶或溶菌酶.去污剂的浓度超过0．2％影响测定结果.如TritonX-100、SDS、NP-40等.
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m1 95％乙醇,加入100ml浓磷酸,然后,用蒸馏水补充至200ml,此染液放4℃至少6个月保持稳定.
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准.如果待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白.通常在20ug—150ug／100ul之间绘制标准曲线.
3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中,该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS).
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液,如出现沉淀,过滤除去.
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液,作用5～30rain.染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色,在595nm波长下测定其吸光度.注意,显色反应不得超过30min．
6．根据标准曲线计算待测样本的浓度.
注意：
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合,反应快速,并且稳定,无法用普通试剂洗掉.待一两周左右,皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍
三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、 考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤.最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇,8.5%（W/V）H3PO4.
2、 标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液.
（二）、器材：
1、722S型分光光度计使用及原理（）.
2、移液管使用（）.
（三）、标准曲线制作：
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
1、
2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug）,在坐标轴上绘制标准曲线.
1）、利用标准曲线查出回归方程.
2）、用公式计算回归方程.
3）、或用origin作图 ,测出回归线性方程.即A595nm=a×X( )+6
一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上.
4）、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧.
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内）,依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量.
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算.
（五）、注意事项：
1、 玻璃仪器要洗涤干净.
2、 取量要准确.
3、 玻璃仪器要干燥,避免温度变化.
4、 对照：用被测物质以外的物质作空白对照.

我觉得都可以,当你计算其他蛋白浓度时候统一就行了.

用标准加入法,必过原点.
酸和水混合后,最好多静置一会,要不测出来的数值会不稳定.

Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg.这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质－染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多.
（2）测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间.
（3）干扰物质少.如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法.
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差.
（2）仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH.（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）.
（3）标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.

要做的合乎标准的话,应该是用空白调零的,那个数值应该是很接近零的,所以可以不管的,不用减去.

Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg.这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质－染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多.
（2）测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间.
（3）干扰物质少.如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法.
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差.
（2）仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH.（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）.
（3）标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.

大概与样品中的干扰物质有关.
干扰Folin酚法的物质有：酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等.
干扰考马斯法的：主要是去污剂,如 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH.（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）.
植物样品经常会含有酚类、有机酸等,提取蛋白可能用到Tris,这是常见的干扰物.检查一下操作程序吧.
测定浓度时用buffer作空白对照了吧?

标准曲线可以自己测定的.
一般试剂盒上也有啊