微生物实验（如何从环境中分离出厌氧固氮菌）

自生固氮菌的分离(选做)

实验原理
农田的表层土壤中,自生固氮菌的含量比较多.将用表土制成的稀泥浆,接种到无氮培养基上进行培养.在这种情况下,只有自生固氮菌才能生长繁殖.用这种方法,可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来.
目的要求
1．初步学会从土壤中分离自生固氮菌的方法.
2．初步学会制作临时涂片的方法.
材料用具
农田的表层土壤(土壤溶液的pH不低于6.5).
无菌研钵,无菌玻璃棒,接种环,天平,存放有载玻片的酒精缸,盖玻片,显微镜,酒精灯,火柴,镊子,恒温箱,量筒,玻璃铅笔.
灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿,结晶紫染液,无菌水.
方法步骤
一、接种
1．接种前,将灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿,放在37℃的恒温箱中一两天.随后,选取培养基上没有生长任何微生物的培养皿供实验用.
2．取10g土壤,放在无菌研钵中,注入5mL无菌水,并用无菌玻璃棒搅拌均匀,备用.
3．将接种环放在酒精灯的火焰上灭菌.略微打开培养皿盖,将接种环放在培养基边缘处冷却.然后,用接种环蘸取少许稀泥浆,轻轻地点接在培养基的表面上,共点接15～20处(注意：接种时手和衣袖不要碰到火焰,以免烧伤).
4．接种后,轻轻地盖上培养皿盖,将培养皿放在实验桌上,并在顶盖上写明实验内容、接种人的姓名和接种日期.
二、培养
将接过种的培养皿放入恒温箱内,在28～30℃的温度下培养3～4d.
三、观察
3～4d后,取出培养皿,仔细观察培养基上稀泥浆周围长出的培养物——黏液.黏液初为无色透明,以后为乳白色,最后变成褐色,表明含有自生固氮菌.
四、镜检
1．制作临时涂片
(1)用镊子从存放载玻片的酒精缸中夹取一片载玻片,将载玻片放在酒精灯火焰的上方缓缓烘烤,以便除去上面的酒精.将载玻片放在实验桌上,待载玻片冷却后,在载玻片的中央滴一滴无菌水.
(2)在火焰旁,按照接种的要求,用灭过菌的接种环从培养基上挑取少许黏液,将黏液涂在载玻片上的水滴中,加1滴结晶紫染液,混合均匀,染色1min.
(3)另取一片载玻片作推片.将推片自液滴左侧向右侧移动,使液滴均匀地附着在两片之间.然后,将推片自右向左平稳地推移(两片之间呈30～45°夹角),推出一层均匀的菌膜.
2．干燥
让临时涂片自然干燥(自生固氮菌的临时涂片不用加热固定,以免破坏荚膜).
3．在显微镜下观察
依次通过低倍镜和高倍镜观察临时涂片,可以看到染成紫色的自生固氮菌.
结论
通过显微镜能够看到几种自生固氮菌?它们在形态上各有什么特点?将得出的结论写在《实验报告册》上.
讨论
1．为什么盛放无氮培养基的培养皿应当是灭过菌的?
2．假如黏液中有三种自生固氮菌,你能不能想出一种办法,将这三种细菌分离开来?