用pcDNA3.1(+)作为表达载体,设计PCR引物时怎么能保正不移码?起始密码子前的碱基个数应该是多少?

pcDNA3.1本身就有抗性,可以用抗性培养基进行初步筛选,然后长出来的克隆筛选,一般为三种：
1.设计扩增外源基因片段的引物,进行菌液PCR
2.提取质粒,做质粒双酶切--Hind Ⅲ和EcoRⅠ（这个最为准确）
3.设计引物做测序

首先明确一个问题,你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗,也就是说你只想把这个质粒切开吗?看你的结果好象这种可能性大些,那样我觉得最有可能是梅切不完全,即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近.
建议：首先电泳时要有原质粒作对照,这样你就可以确定跑得快的带是不是未完全切开的质粒了.其次想酶切完全,可延长梅切时间,看你的体系酶的量足够了,而且酶的量本身也不应大于1/10；只是不知梅切的时间.最后若是可以确定两条带中有一条是切开的,则可以利用胶回收纯化的方法得到所需的这一载体,在和目的片段连接,注意这时凝胶回收是必要的,但若两条带太相近,则可能切的时候难分离；若是改变实验条件最终完全梅切（只一条带,且和原质粒位置有差异）,则可以用加热65度20分钟的（对于37度酶）方法将酶灭活直接用作连接载体即可,不用回收.
以上是假设你的载体这个酶切位点唯一的情况,若不是则会切下一小段片段,并且一定要凝胶回收才可得到连接载体.

既然你是做瞬转的话,一般24h就已经有很多表达了,48h就基本上是表达的最大值了.我们一般就只做到48h就可以收了.

后期的pCDNA3.1正的与另外一个的负的是相对的,但对于真核细胞上面,上面两个载体以及他们的基因构建都是非常近似的

不知道你没杂出条带是因为什么原因,还有你杂交的抗体是目的蛋白的抗体吗?你杂杂标签蛋白试试,看看有没有条带啊?我这么说是因为,膜蛋白确实不好提取,而且提取后可能空间构想改变了,你的抗体可能识别不了了,而标签蛋白是多肽,构象不会受影响,只要不被你的目的蛋白档上就行,所以你可以用标签蛋白的抗体杂交下,试试.一般最好把标签和目的蛋白融合表达一下