同尾酶的连接,望指教子克隆做了无数,这次算是遇到了狠的了.最近想将毕赤酵母一个基因以多拷贝的形式连到一个载体中,因此需要

同尾酶的连接,望指教
子克隆做了无数,这次算是遇到了狠的了.
最近想将毕赤酵母一个基因以多拷贝的形式连到一个载体中,因此需要将目的基因多次整入载体,需要利用同尾酶.首先将目的基因和载体采用同尾酶进行spe1,Bln1双酶切,酶切完后,连接,这样就构建了含有一个拷贝的目的基因的载体,命名为S1（这一步非常顺利）.
奇怪的事情发生了,当再次将目的基因用spe1,Bln1酶切,而载体S1此时只用spe1单酶切,进行第2个拷贝连接的时候,却始终连接不上.
1.S1用spe1单酶切后,我先跑了一个电泳,发现Spe1并没有把质粒S1切开（一部分是超螺旋,还一部分是线性化,我加大了时间也是这样）,我于是将上面的那条线性化的条带切下来,然后进行磷酸化处理,处理完之后,再加入利用spe1,Bln1酶切好的目的基因,结果发现转化子所有的都是S1自连,我挑了8个转化子全是自连,实在找不出原因.
自己分析原因：认为最初构建S1的时候是不是有些问题,因为用spe1单酶切始终不能完全切开质粒,但是我通过PCR以及大小鉴定确实是S1构建成功的,只差测序了.
我的疑问是：是不是spe1这个酶不行,虽然公司说这个酶的活性是非常好的,我为什么用它单酶切却不能完全切开呢.
刚刚那个人说了，我构建的载体无法形成spe1,Bln1，我终于明白了，我仔细一想还真是的，我S1构建时就已经失败，S1形成的载体中既没有spe1,也没有bln1，我需要做的是把其中的一个酶给换掉，不让它们是同尾酶。