定量PCR实验,CT值出现过晚是怎么回事?

在百度知道里怎么会问这个问题?都有专业的书籍或者文献可供参考的.不同的试剂公司还有荧光定量的培训PPT,你需要的话我可以给你发过去.

两种啊
一种就是荧光染料只能插入到双链DNA中,这种情况就是只有开始合成了才有荧光发出
另一种是有引物有探针,探针上一个荧光基团一个淬灭基团,探针引物同时结合到模板上,只有当DNA合成到探针的时候,把探针前边那个荧光基团切掉变成游离状态,才能发出荧光

请问你做Real Time PCR做几个循环的?40个吗?40个循环的话,CT值在30左右很正常的啊,CT值30的话大概是10000copies,
说明模板含量低嘛,定量定量就是要CT值有大有小的才有比较嘛

要看你的目的基因对毒物的敏感程度了,如果比较敏感,肯定是没有问题的,实时定量PCR还是相当灵敏的

小说的文字有很多都不是最准确的,既然上面写的是“实时”,那么就应该是实时荧光定量PCR,否则普通PCR做不到“实时”.所以是一回事.

分子克隆是葵花宝典,有此一招走遍生物界都不怕!工具书另外分子生物学实验技术和细胞生物学实验技术可以参考.另外对于实验的理解和概念的掌握以及注意事项和最新实验发展方向还可以参照基因!最经典的是基因八!现在好像出到十了.希望能对你有所帮助

2个方案,第一个,重新设计一个引物,可以加长引物长度来增加退火温度.
第二个,分成两锅跑PCR,轻松就搞定.
新手?这个问题本身就不是问题,好多定量引物都是公司设计的,长度啥的都考虑好了,而且定量引物一般很短,PCR长度很短,特异性非常强,退火温度相差不会太大,即使很大,也很有希望能够找到合适温度一起跑能出的.

太大严重影响扩增效率,一般为70-200bp.

定量PCR有绝对定量跟相对定量,绝对定量就是先用已知浓度的质粒浓度梯度（1.00E+07、1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03）制作标准曲线,然后通过做Real-time PCR的CT值计算出其表达量；相对定量是比较管家基因（GAPDH）与目的基因的CT值,得出各标本之间目的基因表达量的多少.
目前实时荧光定量PCR主要用两种方法：染料法和探针法,如果科研资金充足的话,建议选用探针法,其数据比染料法准确.染料法也可以达到定量的目的,而且比较廉价.

用2ul的枪每次添加1ul并记下在10ul枪头上的液面位置,以后尽量在这个线上,如果偏差很大的话就多做几个复孔,将偏差大的舍去.

请用primer express设计就行.你想去找非常保守的区域设计引物?可以,那你把这个物种的所有亚种的此段DNA序列做一个保守型分析就行.一般来说clustal X就可以了.

实时定量目的就在于测定样品mRNA水平的含量啊!要获取扩增反应之初的模板量,必然要先提取总RNA,用多聚T引物将全部的mRNA反转录得到cDNA作为模板,再通过后续检测得出结果.

实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术
亮氨酸拉链（leucine zipper）：出现在DNA结合蛋白质和其它蛋白质中的一种结构基元（motif）.当来自同一个或不同多肽链的两个两用性的α-螺旋的疏水面（常常含有亮氨酸残基）相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构时就形成了亮氨酸拉链
蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法.
野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝.有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化,而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法.
操纵子（operon）：指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称.转录的功能单位.很多功能上相关的基因前后相连成串,由一个共同的控制区进行转录的控制,包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列.主要见于原核生物的转录调控,如乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、组氨酸操纵子、色氨酸操纵子等.
简述原核生物的复制起始过程: DNA的复制是一个边解旋边复制的过程.复制开始时,DNA分子首先利用细胞提供的能量,在解旋酶的作用下,把两条螺旋的双链解开,这个过程叫解旋.然后,以解开的每一段母链为模板,以周围环境中的四种脱氧核苷酸为原料,按照碱基配对互补配对原则,在DNA聚合酶的作用下,各自合成与母链互补的一段子链.随着解旋过程的进行,新合成的子链也不断地延伸,同时,每条子链与其母链盘绕成双螺旋结构,从而各形成一个新的DNA分子.这样,复制结束后,一个DNA分子,通过细胞分裂分配到两个子细胞中去!

你做的是DNA的实时定量PCR,还是cDNA的?
模板是DNA的话可以将Ct控制在10-30之间,最大的Ct值在28以内,这样32以后的Ct在计算的时候可以忽略掉.模板是cDNA的话,有些Ct本来就很大,做水的时候更要小心了,戴好口罩手套,仔细着点.
你可以看看溶解曲线的图,只要那张图没有起峰的话,就应该不是水中有污染；如果有峰,且温度非常低,可能是引物二聚体；如果是正儿八经的峰,那就是污染了,做的时候小心些.

1.可以测量DNA,cDNA的绝对或者相对数量.扩增曲线（或者Ct值）出现越早,说明靶目标的含量越高.
2.可以检测SNAP.单个核苷酸位点的多形性.比如在一个位点上有A和G两种基因型.引物使用一样,但是针对A和G的探针标以不同荧光.反应时检测不同颜色荧光的强弱,可以得到两种基因型的比例.

最好还是在冰上做啦,一次两次没有问题,久了多了可能问题就出来了
一般用的是灭菌的双蒸水
保证引物的终浓度就可以.都是用水稀释的,没啥差别

PCR的全称是：多聚酶链反应,用俗话说就是人为地制造一个环境,使双链基因片段进行复制、扩增
目的基因：就是你想要扩增的基因片段
变性：是在热的环境下使双链解链,一般需要94摄氏度
引物：引导复制的开始,是一种RNA单链片段,能引导复制的起始位置
聚合酶：用的是Taq酶是在火山口找到的一种耐热的酶,在它的作用下以四种脱氧核苷酸（dNTP）为原料合成双链
延伸：通俗点说就是原来的模板链和新合成的单链组成一条新的双链的过程,延伸时间的长短、温度的高低会影响新双链的质量
PCR的大致过程
1、模板DNA
2、（第一轮循环）：模板DNA变性和引物复性
3、（第一轮循环）：引物延伸
4、（第二轮循环）：新合成的双链变性和引物复性
5、（第二轮循环）：引物延伸
……
如此往复,直至结束
之后可以泡个琼脂糖电泳看看扩增的情况,也可以测OD值,计算浓度
现在也有real time PCR,实时定量PCR,可以在间隔相等的时间测反应物的浓度,获得相对较准确的数据,比较简便.
总的来说,做分子生物学实验就是一项烧钱的活

ROX Reference Dye,可用于需要Dye的Real Time PCR扩增仪,用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上,用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差.并不是每次都会用到.
一般有ROX Reference Dye和ROX Reference Dye II两种,针对不同的PCR仪.一般ABI PRISM 7000/7700/7900HT和7300 Real-Time PCR System使用ROX Reference Dye,而7500 Real-Time PCR System和7500 Fast Real-Time PCR System使用ROX Reference Dye II.其它牌子如Thermal Cycler Dice Real Time System、LightCycler 等Real Time PCR扩增仪时不必使用.

△Ct（n）=Ct目的基因（n）-Ct内参基因（n）；
△△CT（n）=△Ct（n）-△Ct（1）；然后算出2-△△CT；标准差我是同一处理做了3个平行算出来的.没法下标,用括号处理,

可以看看有几个峰,以及峰出现的位置.每个峰代表有一种产物,如果有两个峰甚至多个峰,说明引物不特异,你得到的Ct值是不可信的.还有如果出现峰的温度低,很可能是Dimer,而不是你的目的产物.
如果你相同样品各管的溶解曲线都只有一个尖锐的峰,而且不是Dimer,说明你的扩增的产物是稳定正确的,数据可以采用.
它只是反映PCR完后,产物的情况,不能得出Ct值.

博凌科为-为你1．引物设计不够优化.应避免引物二聚体和发夹结构的出现.2.引物浓度不佳.适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比.3.镁离子浓度过高.适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒.4.模板有基因组的污染.RNA提取过程中避免DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增.

你可以联找威斯腾生物,把你的实验内容和要求告诉他们,那边会给你设计分析,公司质量和服务都很不错.

这个只能参考 说明你的病毒量数量.（病毒量很少,没关系的,应该还不是大量复制）
这个还要根据你当天的实际情况--比如血液浓度,是否喝水等.每次测量都会有偏差的.
主要是测量你的肝功能情况.还有两对半.这个没提供还真不好说.
一：自己的心态很重要,别人怎么看都可以,但是自己一定要乐观和自信；
二：规律的生活习惯和清淡合理饮食
三：适当的锻炼
做到以上三点包你一生健康.以上两点能做到保证不发病.作到任意一点至少能保持稳定状态.

伯乐生命的微滴式PCR已经被广泛应用到医学、生物学等方面,如拷贝数变异、突变检测、单细胞基因表达分析等.

影响不大.探针法没影响,染料掺入法,现在的仪器都自动刷掉那些长度太小的扩增信号.
有人说可能对溶解曲线产生影响,不过我做染料掺入法做的少,没试过.
当然在设计引物时避免引物形成自身二聚体或互相二聚体是最好的,实在是形成了也没关系,上机跑一次呗,一小时的事.

没有影响,标准曲线就是这样做出来的.梯度稀释的模板有不同的Ct值,然后就可以根据这个做标准曲线了.

通常文献中说的RTPCR是指反转录PCR,实时定量一般说RealtimePCR...