菌落PCR的TM值和P基因的是不是一样啊

桃花发岸傍2022-10-04 11:39:542条回答

菌落PCR的TM值和P基因的是不是一样啊
连接的是T载体菌落PCR 条带很暗有杂带也不亮是不是要提高菌落PCR的TM值啊?

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西门江共回答了23个问题 | 采纳率100%: 　　菌落PCR建议,对菌落进行预变性处理,将挑取的单克隆溶于10ul无菌水（1半保存）,分5ul出来进行95度10min变性然后直接放冰上进行预变性处理,相当于提高模板量,提高产量.
　　有杂带,建议提高TM值或降低Mg离子浓度.; 1年前

箫醉枫桥共回答了14个问题 | 采纳率: 　　菌落PCR建议，对菌落进行预变性处理，将挑取的单克隆溶于10ul无菌水（1半保存），分5ul出来进行95度10min变性然后直接放冰上进行预变性处理，相当于提高模板量，提高产量。
　　有杂带，建议提高TM值或降低Mg离子浓度。菌落PCR的TM值和P基因的TM值可能出现不一样的情况是吗？就是说用P基因的TM值来菌落PCR也会P不出目的条带是吧？这个也不是，主要是菌落PCR的条件...; 1年前

您好!我想请问一下,如果使用菌落PCR的话,革兰氏阳性细菌会不会因为细胞壁很厚而P不出来呀? 湘芹1年前1: xiaomage78 共回答了17个问题 | 采纳率94.1%

会P出来的,预变性的温度长一点,10min,95－10min （95－30s:Tm-30s:延伸：决定于你的片段多大）反应体系30－50ul,40个循环,引物没问题的话,会出来

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菌落PCR做了10次还是不成功··· 菌落PCR做了10次还是不成功··· 我是第一次做菌落PCR,但是做了10次都没成功··· 用菌是JM83菌,在平板上培养成菌落的,做的时候就挑一点菌进体系中. 我的体系是 mix 混合液（里面包含了dNTP、buffer、Taq酶、Mg离子之类的东西）这是买来可以直接用的,但是不知道里面的含量是多少,不过据说是没问题的. mix 混合液 10ul Prime 1 2ul Prime 2 2ul ddH20 5ul 模板 1ul 模板是直接挑菌用,没有经过处理的. 然后混合好后直接就拿去P了,但是没成功过. 后来我同学说把菌体处理一下,就是沸水浴加热5min然后高速离心取上清做模板.还是不行. 后来有一次,我不小心把做感受态细胞的水当做ddH2O了,并且退火温度做了一个梯度对比,在大约50到55之间出了一点东西,是750pb的,不是我的目的片段的大小,我的目的片段大概在1300左右.那个水中mg离子浓度相当高,是80mM,里面还有20mM的Ca离子. 所以我就认为是不是mix的mg离子浓度不够,所以今天在体系中加了25mM,2.5ul的Mg离子,而ddH2O就只加了2.5ul.可是出来的结果却是Marker跑得不错,但是10个样中都只有引物···这还是没出结果···现在都不知道该怎么办了··· 红绿蓝三色光1年前4: 风一样的男儿共回答了24个问题 | 采纳率91.7%

按你的实验体系来看你的mix是2×的吧,同时你的引物应该是5uM左右的吧?
重复你的实验,但做如下改进：
1,挑菌进500ul的ddH2O,充分混匀,不需煮,取1ul做模板,你之前直接挑菌,模板有可能过多,也会p不出带；（也可以先把克隆挑到1-5ml的LB中摇菌1小时,直接取1ul来做模板）
2,设阴性对照以及阳性对照（用有目的片段的质粒或菌为模板）,如果阳性对照能出来,而你还没p出来,就说明你的菌里没目的片段.
3,你的片段为1.3kb,如果你用的是普通taq的mix,那么你的延伸要设90s或100s才够,退火温度将梯度设在52-60℃.酶离子就别多加了.
此外,检查你的平板是不是太长时间了,抗生素失效?会造成质粒丢失,自然p不出来.

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菌落PCR 和菌液PCR 用英文该怎么说? 稀里糊涂啊1年前2: gasgasduy 共回答了21个问题 | 采纳率95.2%

菌落PCR：Colony PCR
菌液PCR：Bacteria Liquid PCR
PCR：polymerase chain reaction ：聚合酶链反应
应该没错
欠我一顿饭哦

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菌株菌粉可以直接做菌落PCR么? 菌株菌粉可以直接做菌落PCR么? 购买的标准菌株粉末可以直接至于50ulTE溶液,95度热处理5分钟,作为PCR模板么?为什么我扩增不出来目的片段呢?是因为革兰氏阳性菌的细胞壁太厚么?如果是我应该怎样处理细菌粉才能用于PCR扩增的模板呢? langzi81921年前1: BOB0425 共回答了19个问题 | 采纳率100%

建议你购买专门的细菌抽提试剂盒,或者在菌液中加入胰蛋白酶37度消化半小时

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菌落pcr假阳性如图,菌落pcr,2-6道扩增0.9kb目的条带,7-12扩增1.0kb目的条带.7,8道扩增的1.0k 菌落pcr假阳性 如图,菌落pcr,2-6道扩增0.9kb目的条带,7-12扩增1.0kb目的条带.7,8道扩增的1.0kb有点偏离,9道为非特异性扩增,12道在1.0kb位置有隐约条带,是否为非特异性扩增?mark跑直线,而条带两端上扬是什么原因? wuyue10161年前2: Johnson_Jonathan 共回答了17个问题 | 采纳率94.1%

78道应该是理想的结果,如果你放在mark两边的话,应该没有偏离.而12道,如果优化一下,比如不用菌落DNA而是提纯DNA的话,也许会有好的结果.条带两端上扬是因为你的上样浓度大了.可以稀释几倍试一下.

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真菌能做菌落pcr吗?请问,对分离出的真菌进行鉴定,能用菌落pcr吗?如何可以通用引物是什么?还有反应体系如何设定,请知 真菌能做菌落pcr吗? 请问,对分离出的真菌进行鉴定,能用菌落pcr吗?如何可以通用引物是什么?还有反应体系如何设定,请知道的前辈告知~ 香山云雨1年前1: sheella 共回答了10个问题 | 采纳率90%

酵母的话,是可以做菌落PCR,跟细菌相似.如果是丝状真菌的话,建议还是提一下DNA吧.真菌鉴定目前常用的ITS序列,如果是单菌的DNA的话,用ITS1,ITS4一般就能扩增出来.PCR体系的话,常规的PCR体系就行,也能扩出来.

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菌落PCR和普通PCR区别 ssww1年前2: daywild 共回答了20个问题 | 采纳率90%

菌落PCR是直接把菌通过枪头或其他物品转移到PCR体系中,在94℃变性时,细菌一般会被煮裂解,基因组和质粒直接被释放出来作为模板；
普通PCR用的DNA模板是经提纯后的DNA,例如质粒,cDNA、genome等；
由于蛋白和其它杂质干扰的存在,菌落PCR效果一般比普通PCR效果差.

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菌落pcr是否可以直接扩增基因组上的目的基因?单菌落需要特殊处理吗 跳蚤之心1年前2: 哑哑鱼共回答了24个问题 | 采纳率79.2%

可以的.
我们验证转化结果时就是根据这个原理的,只不过一般是扩增质粒内的基因,但如果有正确的引物,同样可以扩增基因组上的基因的
关于单菌落的处理,一般是把菌落挑到无菌水里,然后沸水煮5min就可以了,目的就是把细菌细胞壁以及细胞膜破坏掉,以使基因暴露

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用革兰氏阳性菌做菌落PCR时,怎样处理菌体模板? 用革兰氏阳性菌做菌落PCR时,怎样处理菌体模板? 如题,本人刚刚开始做分子生物学方面的研究,因为大家都知道G+的胞壁比G-菌比如E.coli的要厚些,所以要在PCR之前要对模板进行一定的处理,但是怎样处理才好?我上次做的时候就挑去单菌落（猪链球菌2型）溶30微升水后用95°处理10min,然后取了5微升做模板加到PCR体系里去了,做完PCR跑胶检测的时候没有带,我觉得是我在处理模板的时候没处理好导致的,因为其他试剂都是刚买的,请各位有经验的指点一下我这个新手,步骤最好说的详细一些, efde1年前1: rencai001 共回答了23个问题 | 采纳率82.6%

为什么不抽基因组?抽出来的模板你可以用好多次.煮沸法模板有效期短,提取的效率也很低下,干扰PCR的杂质也多.就像你PCR失败一样,不一定是模板中没有DNA,也可能是杂质干扰的结果.
如果样本只是一个菌,或者不是很多,建议少量提取基因组,这样的模板是不会有问题的.至少,包括我在内我所有见过的做过这个实验的人都没有失败过.
如果样本很多,非得要煮沸法的话你这样做：
不要用PCR仪95℃处理,用液体培养基离心获得菌体,除去培养基,无菌水悬浮,沸水浴30min,迅速-20℃冰冻,化冻后8000rpm离心以沉淀细胞碎片,取2μL上清作为PCR模板.
如果你非要用PCR仪处理,也行,37℃溶菌酶预处理30min.
如果我说的你都不想做,那么请把你的模板用量减少到2μL（我指的是对于50μLPCR体系来说）,说不定是杂质太多导致你PCR失败.

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我的片段转入ppicza载体后转化到DH5a里,菌落PCR验证成功,为何就是提不出质粒? 张缙仪1年前2: ppoyu 共回答了21个问题 | 采纳率95.2%

1 做空白对照,看是否你的PCR体系有污染.
2 请考察pPICZa是否是严谨质粒.如果是的话,请大提质粒,然后鉴定.

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我想请教下我了样品里面含很多种菌,但我提不出总DNA能不能直接用样品做菌落PCR得到很多种菌了扩增产物 我想请教下我了样品里面含很多种菌,但我提不出总DNA能不能直接用样品做菌落PCR得到很多种菌了扩增产物 急哈,麻烦大侠了哦 坏猫1年前1: 长月当空共回答了24个问题 | 采纳率87.5%

可以的.但是你要设计针对每种种菌的特异性引物才行.然后每种引物分开做PCR.

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关于菌落pcr我的做法是：用枪头挑选单菌落到装有10uL水的pcr管中,然后悬浮菌液. 在做 PCR 时,吸取 2uL 关于菌落pcr 我的做法是：用枪头挑选单菌落到装有10uL水的pcr管中,然后悬浮菌液. 在做 PCR 时,吸取 2uL 做摸板,但电泳检测后,选有阳性克隆相对的菌液 8uL 与试管的液体培养基中培养.这样做, 既初步检测了阳性克隆,又保存了所需要的菌落. 但做了几次都没P出条带. 还有人说这个结果不可信,要提质粒酶切.能不能解释一下. 哪些情况假阳性. 还有实验需要注意的. 新手请教~ 魔鬼爱天使1年前4: lsbjonny 共回答了16个问题 | 采纳率87.5%

主要是不能带入AGAROSE,它是抑制PCR反应的.所以不要担心没挑到,反而更应注意别挑太多量进去,一不小心就会出假阴性.
引物也比较重要,建议引物一个为目的基因一个为载体上的

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菌落PCR的TM值和P基因的是不是一样啊

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