贴壁细胞总RNA的提取最好用哪种方法?

博凌科为生物科技-为你胰酶使用注意：1、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染.2、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长,否则细胞铺板后生长状况会较差.贴壁细胞的消化：1、吸去培养液,用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次,以去除残余的血清2、加入少量胰酶细胞消化液,略盖过细胞即可,根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量.室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同）3、显微镜下观察,细胞明显收缩,并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来.4、此时吸除胰酶细胞消化液.加入含血清的完全细胞培养液,吹打下细胞,即可直接用于后续实验如果发现消化不足,则加入胰酶细胞消化液重新消化.如果发现细胞消化时间过长,未及吹打细胞,细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落,直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来.1000-2000g离心1分钟,沉淀细胞,尽量去除胰酶细胞消化液后,加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞,即可用于后续实验.常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin）,EDTA等,其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解,改变细胞间的连接,使组织或细胞片分散成单个细胞,制成细胞悬液用于进一步的实验.影响消化速度的因素较多,主要有胰酶溶液的活性（配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 .加入胰蛋白酶-EDTA溶液,视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定）,以使充分浸润；一般消化时间约为1至3分钟,肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明、点状（出现细小空隙）时,弃去细胞消化液,或看见培养瓶壁呈白茫 状即可.并加入适量的完全培养液终止消化,吹打分散；如见大量细胞片状脱落,已消化过头,则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作.（消化过头,可造成大量 细胞从瓶壁上脱下,甚至造成细胞破碎.由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂,所以加入完全培养基可以终止反应.胰酶配置方法：1、培养液配制,方便好用,对细胞影响小,并且培养液的ph值正好适合胰蛋白酶的溶解2、生理盐水配制,要先调ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力搅拌2-3小时,调pH 7.8-8.0,过滤除菌.）3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：称取胰酶粉末0.1g,先用少许灭菌过的PBS调成糊状,然后补足到100ml.置室温搅拌4小时或冰箱内过 夜,过滤灭菌,分装,4℃保存备用.）; 或是hanks或是D-hanks液配制（1.称取胰蛋白酶粉末置烧杯中,先用少许D-Hanks 平衡盐溶液（pH7.2 左右）调成糊状,然后再补足D-Hanks 平衡盐溶液,搅拌混匀,置室温4 小时或冰箱过夜,并不断搅拌振荡；2.次日,先用滤纸粗滤,再进行过滤除菌,分装入瓶中,低温冰箱保存备用,常用浓度为0.25% 或0.125%.胰蛋白酶溶液偏酸,使用前可调用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右.）一般0.45微米的一次性滤器过滤除菌,至于作用效果,需要消化一次细胞感觉一下,因为不同厂家的酶不一样,有的作用温和,有的作用剧烈.4、是否需要四度放置过夜,取决于你的胰酶的纯度.过去的胰酶纯度不高,所以难以溶解,需要四度过夜.而现在的胰酶纯度都很高,就没有必要四度过夜.从理论上来说,四度放置过夜,给细菌生长的机会,尽管过滤可以出去细菌,可是出不掉其代谢产物.胰蛋白酶不溶,有絮状物的原因,考虑有：1、过期或是酶已经部分变性2、溶液ph值不对3、在没过滤之前的絮状沉淀是正常现象,因胰酶多取自动物胰腺,沉淀为组织块,过滤后即可

贴壁细胞：弃去培养液,加胰酶消化,加培养液终止胰酶作用,吹打成悬液,分装传代.
悬浮细胞：离心,弃上清液,加新鲜培养基,分装传代.

MTT原理
x09MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名：噻唑蓝.是一种黄颜色的染料.
x09MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中,而死细胞无此功能.二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济. 　　缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测.这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害.
MTT 溶液的配制方法 通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml.因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃ 避光保存即可.在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住.实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好. 需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数.在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内.
x09MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了.
x09MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
x09配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解.PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L.
普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细
x09胞接种到96孔板,每孔体积200ul.2: 培养细胞：同一般培养条件,培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）.3：呈色：培养3-5天后,每孔加MTT（噻唑蓝）溶液（5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.继续孵育4 h,
x09终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液.
x09每孔加150ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分融解.4：比色：选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为
x09横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线.
药物MTT法实验步骤贴壁细胞：1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000-
x0910000 孔,（边缘孔用无菌PBS填充）.2: 5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上,
x09细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午
x09加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况3: 5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察.4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4h.若药物与MTT能够反应,
x09可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液.5: 终止培养,小心吸去孔内培养液.6: 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解.在酶联免
x09疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值.7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介
x09质、培养液、MTT、二甲基亚砜）.
悬浮细胞：1: 收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640（无血清）培
养基40ul ；②加Actinomycin D（放线菌素D有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100g/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔）,共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）.每板设对照（加100l 1640）
2: 置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察.3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4 h.（悬浮细胞推荐使用
WST-1,培养4 h后可跳过步骤4）,直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
x094、离心（1000转x10min）,小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值.
x095、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜DMSO）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）,每组设定3复孔.
注意事项：(1) 选择适当得细胞接种浓度.(2) 避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验.在呈色后尽量吸尽孔
x09内残余培养液.(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照.其他试验步骤保持一致,
x09最后比色以空白调零.
(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系.
x09(5) 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适
x09根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于
x09DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
x09(6) 一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值.

博凌科为生物科技-为你因为AnnexinV是Ca依赖的蛋白,所以不能加入EDTA, 防止EDTA螯合了Ca离子从而影响annexinV,进而影响结果.所以可以用不含EDTA的胰酶,放入温箱内进行消化,时间可以长一点,随时观察细胞情况,避免消化过度.建议用细胞刮子把细胞刮下来,然后用枪吹匀,比消化还简单,而且也避免了胰酶带来的损伤,机械的损伤还是很小的因为细胞大多呈大片大片地被刮下来.

以6孔板的一个孔为例,先把培养液吸出,加入200ul的细胞裂解液,摇床摇15分钟,加loading buffer冰上放置5分钟,用细胞刮把皿底刮几次,然后全部吸出放到离心管里,95°水浴或者金属浴煮10分钟.
每个人的方法都不太一样吧,有的会在收样之后离心去沉淀,有的会再超声几分钟,有的直接拿loading buffer当裂解液用,个人觉得这些差别都不会影响你实验结果.
不过煮肯定是必须的,不然没法保存

不是特别娇贵的细胞的话,一个瓶反复换液10左右不会有太明显的影响.如果是特别不容易贴壁的细胞品种,不仅需要传代就换瓶,有的还需要滋养层.

你说的不是很详细,首先你是想消化下来就体蛋白吗?如果是那你只能消化吧,如果采用超声波或者机械方式对你下一步实验不太好.
如果说你是过段时间再提取,那么用胰酶消化应该没问题
若果你的细胞贴的不牢,可以用力敲打也可以把细胞分散开

1、你说的那种方法是用蛋白酶K消化然后酚氯仿抽提的方法,这种方法中蛋白酶K可以消化掉各种蛋白,释放出各种核酸(包括RNA),RNaseA可以用来消化掉RNA,那么就只剩下DNA了.这种方法中蛋白酶K和RNaseA是必须的,不加蛋白酶K的话核酸释放不充分,而且提取的DNA中容易出现蛋白污染,不加RNaseA的话可能会导致提取的DNA中残留有RNA.
2、提取贴壁细胞的方法很多,你用PBS洗涤一下细胞,然后刮下来或者用酶消化细胞后离心收集之后就可以用随便什么方法提取了,说的那种方法可靠的,嫌麻烦的话就用试剂盒,比如天根的血液组织细胞基因组提取试剂盒(DP304)

这个都可以,直接加的话,会带有更多的培养液到下一步.而离心后,去掉培养液后再加,提的效率更高.培养盘上基本没残留

当贴壁细胞分裂生长到细胞表面相互接触时会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制

贴壁细胞分为两种,上皮细胞型和成纤维细胞型,在显微镜下观察时,贴壁细胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不规则的三角形或扇形,而且晃动培养液时,细胞不动.
悬浮细胞漂在培养液中,呈圆形,晃动培养液时细胞也随着漂动

对,因为传代培养十代以内叫传代培养细胞,超过10代细胞生长大部分将停止有一部分继续生长到50代10~50代叫细胞株,超过50代的细胞核型才发生了突变

先洗,再加0.25毫升Trizol或类似产品,用移液枪头在细胞生长表面上上下左右来回刮几次.注意要用处理过无RNase的枪头.细胞trizol萃取物保存在－80C.