gapdh

经N-硝基-L-精氨酸甲酯处理过的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）siRNA微小干扰RNA

做成相对定量就好了

36kD～200mA恒流湿转100min～

从你的两个图的纵坐标来看，可能是仪器读取时有问题。请检查仪器是否有损坏，或者板子、封口膜是否与仪器兼容，反应溶液是否有气泡。下面一个图如果仪器没有问题则可以说扩增失败。

现在最常用的两种分析实时定量 PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。

换个抗体，或者用别人已经做出来的抗体做一下你的标本

溶解曲线不止一个主峰1、引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；2、引物浓度不佳：适当调整引物浓度；3、退火温度低：提高退火温度；4、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；5、模板中有基因组的污染：通过引物设计避免非特异扩增。

基因组DNA拷贝数变化在许多人类疾病如肿瘤、遗传性疾病的发生发展中起重要作用，也是这些疾病的细胞遗传学表现。染色体显带已被运用了几十年，具有其高度的可靠性并成为染色体分析的金标准，但其分辨率低(约为5～10Mb)，需要中期细胞，操作费时。实时荧光定量 PCR技术用于检测插入的外源基因拷贝数 自 1994 年，第一例转基因植物产品 Flavr Savr TM 西红柿在美国上市，到 2003 年底，世界范围内转基因作物已遍布 18 个国家和地区，种植面积达 167.2 万英亩 (6770 万公顷 )( Ewen SWB,1999; 。

mirna的荧光定量pcr可以用actin做内参miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。我知道和使用过的U6内参基因只有两个：RNU6-1和RNU6-2.前一个就是常见的u6,后一个有时被称为u6b.在我的大鼠RNA样本当中,u6表达量有些太高,u6b的Cq值与我的目标miRNA比较接近,稳定性也很好.但是这些对植物样本中的内参基因选择没有什么指导意义。为了确定u6在植物中的保守性,比较快捷的办法是找到谈论这个话题的文献综述.如果没有人写过这样的综述的话,就只能靠自己去数据库找到所有序列自己对比了。关于内参基因的选择,必须实验确定特定样本中的表达水平稳定,其他文献中报导的内参基因不一定适合你的样本.做新的课题时,选择内参基因一般是选取3-5个常用的,PCR测试后选取。

等等哦我去问问专家

兄弟,不好好听课,是不行滴~ 今儿个俺粗略给你讲讲,细节你自己回去查. 咱用最简单的方法来做： 你上NCBI,查找gene--GAPDH,选择物种Rattus norvegicus （大鼠的种属名）,然后就有搜索结果了,你点进去,可以看到上面有DNA序列,下面有mRNA序列. 然后你就把两个序列拉下来,找到剪接的地方,前引物设计在上一个外显子处,后引物设计在下一个外显子处,设计条件符合RT要求就好.

要看你设计的时候，是不是设计在小鼠和人的同源序列上了，是的话，就可以通用。

以GAPDH的表达做对照，得到一个deltaCt 值。

预变性温度时间。温度调小调大会有影响。1.调整预变性温度的时间CT值会降下来。2.gapdh的ct值一般不易超过20。

常用的蛋白内参有 beta actin 和 GAPDH，它们是有区别的GAPDH分子量为146KD，检测条带大约在36kD，beta actin分子量为42KD。一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上另外，细胞总蛋白的Western Blot的内参蛋白一般用 beta actin ，膜蛋白的Western Blot一般用GAPDH为内参

常用的蛋白内参有 beta actin 和 GAPDH，它们是有区别的GAPDH分子量为146KD，检测条带大约在36kD，beta actin分子量为42KD。一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上另外，细胞总蛋白的Western Blot的内参蛋白一般用 beta actin ，膜蛋白的Western Blot一般用GAPDH为内参

常用的蛋白内参有 beta actin 和 GAPDH，它们是有区别的GAPDH分子量为146KD，检测条带大约在36kD，beta actin分子量为42KD。一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上另外，细胞总蛋白的Western Blot的内参蛋白一般用 beta actin ，膜蛋白的Western Blot一般用GAPDH为内参

GAPDH是一个基因啊 一般是作为real time pcr或者western的内参

用TBST稀释，1：1000

normalized 英["nu0254:mu0259lau026azd] 美["nu0254:mu0259lau026azd] v. （尤指国家间的关系） （使）正常化，恢复友好状态( normalize的过去式和过去分词 ); [网络] 正常化; 标准化; 均一化; [例句]Our relationship has been normalized.我们的关系正常了。[其他] 形近词： normalizer normalised formalizes 双语例句 柯林斯词典 百度知道GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。中文名甘油醛-3-磷酸脱氢酶外文名 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 简 称GAPDH性 质糖酵解反应中的一个酶分子量146kDa

分子量146kDa。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定。常用的内参有，ACTB（β－actin、β－肌动蛋白）、GAPDH或18S等。目的是在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温差等所造成的误差、这些都是管家基因，在各个组织中的表达量相对稳定，其中18S同整个基因谱有关（负责装配），它在总RNA中占的比例最高。相关信息：GAPDH（甘油醛－3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。

GADPH是作为实验的内参而使用的。GAPDH是常用的蛋白质内参。GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。GAPDH是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。GADPH是作为实验的内参而使用的。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。2.常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。

该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定。常用的内参有，ACTB（β-actin、β-肌动蛋白）、GAPDH或18S等。目的是在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温差等所造成的误差、这些都是管家基因，在各个组织中的表达量相对稳定，其中18S同整个基因谱有关（负责装配），它在总RNA中占的比例最高。相关信息GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。

没有GADPH这种物质，只有GAPDH。GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的英文缩写。GAPDH是糖酵解反应中的一个酶，广泛分布于各种组织中的细胞。GAPDH由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的；因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。扩展资料：GAPDH的相关介绍：该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的；且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。常用的内参有，ACTB（β-actin、β-肌动蛋白）、GAPDH或18S等。目的是在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温差等所造成的误差、这些都是管家基因，在各个组织中的表达量相对稳定，其中18S同整个基因谱有关（负责装配），它在总RNA中占的比例最高。参考资料来源：百度百科-GAPDH参考资料来源：百度百科-g3pdh

【GAPDH的作用】广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参，即将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。【GAPDH】或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。GAPDH是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，且GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。【Western Blot】蛋白质印迹法（免疫印迹试验）。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

GAPDH相对分子质量是146kDa(千道尔顿)。GAPDH，甘油醛3磷酸脱氢酶是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30到40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH特点该酶是糖酵解反应中的一个酶。该酶基因为管家housekeeping基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定。故被广泛用作抽提totalRNA，poly(A)加RNA，Westernblot等实验操作的标准化的内参。常用的内参有，ACTB，βactin、β肌动蛋白、GAPDH或18S等。目的是在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温差等所造成的误差、这些都是管家基因，在各个组织中的表达量相对稳定，其中18S同整个基因谱有关（负责装配），它在总RNA中占的比例最高。

一般认为一些持家基因的表达量在不同状态下变化不大，所以可以认为它们表达是恒定的，故而用来做内参简而言之，就是你有两个样品（譬如不同生长条件或者不同组织的），要比较其中某基因A表达转录变化，就分别比较两个样品中A相对于GAPDH的表达即可。譬如，如果第一个条件下A：GAPDH=2，在第二个条件下为4，那么在第二个条件下A基因的转录提高了一倍

GAPDH或G3PDH是 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。

gapdh分子量是：146 kDa。GAPDH（甘油醛－3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。选择合适的GAPDH抗体：内参抗体虽然选择较多，但是也需要遵循一定的原则，并契合实际的应用要求。首先，我们需要考虑目的蛋白的大小，我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上，因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参。由于GAPDH的检测分子量大约在36kD，因此该内参抗体不是很适合用于检测30kD-40kD大小目标蛋白的WB实验中。另外，不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。以上内容参考：百度百科-GAPDH

没有gadph，只有GAPDH。GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的缩写。GAPDH是一种糖酵解酶，广泛分布于各种组织的细胞内。GAPDH由4个分子量为146kda的30-40kda亚基和36kDa的检测带组成。GAPDH基因在几乎所有组织中都高度表达，被广泛用作Western blot蛋白标准化的内部参考。因为GAPDH作为内务基因在同一细胞或组织中的蛋白表达通常是恒定的；因此，在使用GAPDH内参比抗体时，将每个样品中测定的靶蛋白含量除以该样品中GAPDH的含量，得到每个样品中靶蛋白的相对含量，然后进行样品与样品的比较。扩展资料：GAPDH相关介绍：该酶是一种糖酵解酶，由4个分子量为146kda的30-40kda亚基组成。由于内务基因的存在，酶在几乎所有组织中都有高表达，在同一细胞或组织中的蛋白表达通常是恒定的；广泛用作提取总RNA、poly（a）+RNA、Western blot等实验操作的标准化内部参考。常用的内参数有actb（β-actin，β-actin），GAPDH或18S等。目的是避免RNA定量误差、取样误差、各PCR反应体系扩增效率不均、孔间温差等造成的误差，这些都是保守基因，在每个组织中的表达量相对稳定，其中18S与整个基因谱有关负责在总RNA中所占比例最高。参考资料来源：百度百科-GAPDH参考资料来源：百度百科-g3pdh

首先,你要提取何种生物的cDNA文库? 第二,需要多次提取不同时期不同组织的mRNA,以期望覆盖所有外显子. 二楼正解.

经验如此罢了。

做一次之后走电泳试试或者到genebank上看看序列的同源性怎么样再做判断

那是内参引物可能有问题，建议重新设计内参引物

小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）有时称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。不过这些复杂机制的反应途径目前尚未明了。

这涉及到抗体识别抗原的原理和抗体的结构。比如你要检测的蛋白为A，它有a, b, c, d 四个表位(epitope)，可以被抗体特异性认识。制作针对A的抗体是将蛋白A的一段，比如包含b+c段，打入兔子（最常见）或其他动物（山羊goat，大鼠rat，鸡chicken，仓鼠hamster），由于这是外来入侵物，动物自身的免疫系统会生产针对它的抗体来清除这个异物，而产生的抗体有些会识别b位点，有些则识别c位点。之所不用完整的蛋白，是因为全长通常会太大。然后收集被免疫了的动物的血清，这个含有针对蛋白A的的多克隆抗体（因为是识别c+d的混合抗体）就称为抗血清（antiserum)。有的产品卖的直接就是抗血清，有的则再一步将抗体纯化出来。这种多克隆抗体一般会便宜一些。而通过体外刺激小鼠的B细胞和肿瘤细胞的杂合体，分享单克隆进行培养，可以产生出只针对一个表位b的单克隆抗体（monoclonal antibody），这种抗体的特异性更高，但价格也更贵。但具体到用单抗还是用多抗，则要具体情况具体分析。比如你要测的蛋白浓度很低，用多抗检测到的可能性会比用单抗高。又或者待测蛋白会被加工切割成两段，要想两段都检测到，显然应该用针对两段表位的多抗。由此可见，一抗都是特异性针对你要检测的蛋白，你要测A，他要测B，我要测C,所以产量就不可能太大，因为需求量没有那么大。而二抗是个什么情况呢？首先要了解抗体的结构。抗体结构就像一个Y字形，两个丫的部分称为可变区（Fab)，正是这个区域特异性地识别抗原的表位。就像一把钥匙配一把锁一样，表位b只被含有b"可变区的抗体识别。而抗体Y字形下面的主干部分称为恒定区(Fc)，所有人的抗体的Fc都是一样的，不同的只是Fab区，可以是b"，可以是c"。所有鼠的抗体Fc也都是一样，所有山头的Fc也都是一样。所以制二抗，就是用一抗的Fc区去免疫动物，方法同制作一抗。注意如果一抗是在兔子上制作的，那么制二抗时就不用再打兔子了，因为兔子不会对句子的Fc产生免疫反应，不然就会产生自身免疫疾病，自己产生抗体攻击自己。有一部分不幸的人就患有自身免疫疾病。话说回来，从兔子中抽出的任意抗体，不一定要一抗（因为所有的Fc都一样），制作只含有Fc段的片段，再打到山羊中，从而获得了针对兔Fc的抗体。这个抗体能够识别所有来自于兔子体内的抗体，不论它们的Fab段是什么。也就是说二抗的适用范围远远大于一抗，因为一抗是一对一（Fab对表位），二抗是一对多（动物二Fab对动物一Fc）。所以关键在于不是二抗抗一抗不特异，而是二抗抗一抗的恒定区。

你模板是什么？

猪GAPDH uniprot ID P00355；Gene ID 396823；序列10 20 30 40 50 60 MVKVGVNGFG RIGRLVTRAA FNSGKVDIVA INDPFIDLHY MVYMFQYDST HGKFHGTVKA70 80 90 100 110 120 ENGKLVINGK AITIFQERDP ANIKWGDAGA TYVVESTGVF TTMEKAGAHL KGGAKRVIIS130 140 150 160 170 180 APSADAPMFV MGVNHEKYDN SLKIVSNASC TTNCLAPLAK VIHDHFGIVE GLMTTVHAIT190 200 210 220 230 240 ATQKTVDGPS GKLWRDGRGA AQNIIPASTG AAKAVGKVIP ELNGKLTGMA FRVPTPNVSV250 260 270 280 290 300 VDLTCRLEKP AKYDDIKKVV KQASEGPLKG ILGYTEDQVV SCDFNSDTHS STFDAGAGIA310 320 330 LNDHFVKLIS WYDNEFGYSN RVVDLMVHMA SKEβ-actin uniprot ID Q8SPK6；序列10 20 30 40 50 60 TPAMYVAIQA VLSLYASGRT TGIVMDSGDG VTHTVPIYEG YALPHAILRL DLAGRDLTDY70 80 90 100 110 120 LMKILTERGY SFTTTAEREI VRDIKEKLCY VALDFEQEMA TAASSSSLEK SYELPDGQVI130 140 150 160 TIGNERFRCP EALFQPSFLG MESCGIHETT FNSIMKCDVD IRKDLYANT

你不同的样品是来源于不同的组织，还是物种，还是品系，还是不同的发育时期，等等？P不出来不代表没结果啊，有时不表达就是结果。如果表达量很低，你可以尝试增加循环数。

β-actin由375个氨基酸组成,分子量大小为42-43kDa左右. β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。

从你的两个图的纵坐标来看，可能是仪器读取时有问题。请检查仪器是否有损坏，或者板子、封口膜是否与仪器兼容，反应溶液是否有气泡。下面一个图如果仪器没有问题则可以说扩增失败。

楼上的那位真没有说错。楼主根本就没有给出具体的问题方式，让人如何回答？

一条带啊，你做的应该是q-pcr吧

就是还原氢。光合作用与呼吸作用过程中都会生成

gapdh基因跑琼脂糖电泳时用marker多少如果是核酸marker比较简单吧,就是看marker条带的大小和你的目标条带的关系,尽量选择目标条带接近分子量的marker,或是在目标分子量附近条带较多的marker.另外就是,如果目标分子量很小,凝胶通常选择的浓度较大,就不能用分子量太大的marker,例如,只检测200bp的条带,那么用分子量最大到1000,或者500的marker就比较合适.如果分子量很大,例如在几k,就可能会选择向lamda HindIII这样最大到23K的marker.否则凝胶浓度不合适,marker条带分不开,影响对你目标分子分子量的判断.以前我们在实验室用得最多的是2000,和15000的marker,能覆盖大部分分子量的检测.

如何通过荧光定量目的基因和GAPDH计算相对表达量内参就是一个表达量在各个组基本保持不变的基因，又叫看家基因，比如常用的GAPDH， actin。或者18s rRNA也可以。如果内参表达量一致，说明你PCR的上样量一致，样本的质量也一致。如果出入很大，说明你的样本的浓度或者是质量有问题。测到的目的基因的表达量就不可靠了管家基因是用来定量的。用来计算相对表达量。管家基因在相同量样品中的表达量我们认为是一致的。然后根据这个量来计算你的基因在不同样品中的表达量。所以每一个都需要单独的样品。基因组干扰需要你在提取RNA以后用DNase处理样品。如果不放心，可以拿处理过的RNA做膜版，跑一次，如果有带就是有污染，如果没有可以合成cDNA库了。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2597http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/83641890?report=genbankhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/83641890?report=fasta

步骤如下 1. 安装制胶装置 2. 配制分离胶 3. 铺板，水封（ddH2O），最好用无水乙醇铺满。 4. 胶凝后（可以观察到明显的分界线或剩余分离胶已凝），倒掉无水乙醇，用ddH2O轻轻冲洗，可直立胶板倒掉多余的水。 5. 配制浓缩胶（2板约3ml）

要看你设计的时候，是不是设计在小鼠和人的同源序列上了，是的话，就可以通用。

甘油醛-3磷酸脱氢酶，GAPDH这个确实是对的。

有，GAPDH是三磷酸甘油醛脱氢酶，是糖酵解途径中的关键酶。糖酵解途径就是将葡萄糖转化为ATP的过程，负责为生物体提供能量，几乎所有的生物都有该途径。因此GAPDH常常被用来作为内参基因，另外还有β-actin、Ubqutin等由于其广泛存在，也可作为内参基因。

western 内参用的GAPDH分子量为146KD，检测条带大约在36kD，B-actin分子量为42KD。严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，这对实验结果分析是非常有用。要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。因此需要内参很重要。

一般作为内参（样本的加样对照）。GAPDH不同，则说明加样量不同。目的基因的变化倍数要做相应的调整。

看来是做RT-PCR的，PCR是聚合酶链式反应，也就是体外特异性扩增DNA片段，是所有PCR技术的基础；RT-PCR有2种理解，即反转录RCR（reverse transcription PCR，以RNA为模板扩增DNA）或实时PCR（real time PCR），很显然，您指的是后者。real time PCR是定量PCR的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析，也就是分析模板中特定核酸（RNA或DNA）的量。 现在的real time PCR往往 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。那么，这个时候GAPDH就派上用场了，GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的缩写，这个酶的基因是看家基因，也就是在机体各组织中的表达都趋于稳定和接近，类似的还有actin蛋白，可以作为RT-PCR的内参，也就是衡量模板取样量的一个参照物。比如，在做某一基因的RT-PCR时，脑部组织和肌肉组织中该基因的拷贝数一致，但发现在该实验组脑部组织GAPDH的量明显更多，就说明在模板取样时，脑部组织细胞取的更多，反推该基因在脑部的表达水平是低于肌肉组织的。往往我们在做RT-PCR时，需要调整，使各实验组细胞取样量一致，也就是GAPDH在实验中表现为扩增量一致，这样更便于比较目的基因的表达水平。如有疑问，欢迎继续讨论，纯属手打，欢迎采纳，祝愉快！

◆Real－time PCR技术的原理就是用一种标准对照能够估计出一种特异性靶DNA或RNA分子的相对含量。◆这种标准对照就是参照物，在定量PCR中，用它来作为扩增系统的阳性对照，并作为未知样品定量的标准，同时通过竞争性作用校正扩增系统内管间的扩增效率，使其具有可比性。参照物按其性质不同可分为内参照和外参照。内参照是与目的基因加于同一反应管中，与目的基因同时进行扩增，以反映体系中可能出现的PCR影响因素，此即所谓的竞争性PCR；而外参照则是参照物与目的基因的扩增分别在不同的管间进行，此即所谓的非竞争性PCR。◆搞清了内参和外参的概念，你的问题也就很容易解答了：由于你实验中GAPDH和目的基因反应体系是在不同的EP管中进行，所以它应属于外参照。

常用的蛋白内参有 beta actin 和 GAPDH，它们是有区别的GAPDH分子量为146KD，检测条带大约在36kD，beta actin分子量为42KD。一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上另外，细胞总蛋白的Western Blot的内参蛋白一般用 beta actin ，膜蛋白的Western Blot一般用GAPDH为内参

[=glyceraldehyde phosphate dehydrogenase]磷酸甘油醛脱氢酶

鼠。鼠抗人还是兔抗人抗体，主要是来源不同，一抗应该没什么，关键是你选择二抗时，如果一抗是鼠抗人抗体，则二抗要选择抗鼠的抗体，如羊抗鼠的二抗否则就要选择抗兔的二抗。

常用的蛋白内参有 beta actin 和 GAPDH，它们是有区别的GAPDH分子量为146KD，检测条带大约在36kD，beta actin分子量为42KD。一般选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上另外，细胞总蛋白的Western Blot的内参蛋白一般用 beta actin ，膜蛋白的Western Blot一般用GAPDH为内参

GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ）的英文缩写。GAPDH是糖酵解反应中的一个酶，广泛分布于各种组织中的细胞。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。常用的内参有，ACTB（β-actin、β-肌动蛋白）、GAPDH或18S等。目的是在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温差等所造成的误差、这些都是管家基因，在各个组织中的表达量相对稳定，其中18S同整个基因谱有关（负责装配），它在总RNA中占的比例最高。

◆Real－time PCR技术的原理就是用一种标准对照能够估计出一种特异性靶DNA或RNA分子的相对含量。◆这种标准对照就是参照物，在定量PCR中，用它来作为扩增系统的阳性对照，并作为未知样品定量的标准，同时通过竞争性作用校正扩增系统内管间的扩增效率，使其具有可比性。参照物按其性质不同可分为内参照和外参照。内参照是与目的基因加于同一反应管中，与目的基因同时进行扩增，以反映体系中可能出现的PCR影响因素，此即所谓的竞争性PCR；而外参照则是参照物与目的基因的扩增分别在不同的管间进行，此即所谓的非竞争性PCR。◆搞清了内参和外参的概念，你的问题也就很容易解答了：由于你实验中GAPDH和目的基因反应体系是在不同的EP管中进行，所以它应属于外参照。『如果我的回答对您有帮助，请点击下面的“好评”，谢谢，您的采纳是对我莫大的支持。』

gapdh分子量是146kDa。在Western Bloting实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参，比如内参GAPDH的含量来进行校正。当然除了GAPDH抗体，β－Actin抗体、β－Tubulin抗体等也是最常见的内参抗体。GAPDH（甘油醛－3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。基本介绍该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达。在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。

gapdh分子量是：GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)。是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Westernblot蛋白质标准化的内参。gapdh是什么NADPH是一种辅酶，叫还原型辅酶Ⅱ，学名还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，曾经被称为三磷酸吡啶核苷酸，英文triphosphopyridinenucleotide，使用缩写TPN，亦写作[H]，亦叫作还原氢。N指烟酰胺，A指腺嘌呤，D是二核苷酸，P是磷酸基团。分子量为833.35。它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）中与腺嘌呤相连的核糖环系2"-位的磷酸化衍生物，参与多种合成代谢反应，如脂类、脂肪酸和核苷酸的合成。这些反应中需要NADPH作为还原剂、氢负离子的供体，NADPH是NADP+的还原形式。

2019-01-09 星期三 晴 说起昨天，真的很心酸。虽然以前看过同门大致做了一遍，但许多细节还是不清楚的。自己亲身体验才清楚。。。 1.蛋白测定之后要加5X SDS上样缓冲液，该怎么加呢？是所有的标本一起加了，还是就算准备上样的量？经中心试验室CWW指点后才知道，可以一起加了。就是把蛋白样品的体积除以4就是了，这样的5Xbuffer就变为了1X。 2.紧接着是配胶，也是一堆问题。过硫酸铵（AP），给我的是一支0.5g干粉，说明书说配成10%溶液，我先是拿1mlDDW稀释，然后去了100ul在稀释成1ml。结果依据产品说明书的要求配置分离胶，过了一个消失还是不能凝固。多方求教之后才发现AP，只有5%（Oh，my god！）。于是再取了100ul加入AP溶液中，这下就解决问题。 在配胶过程中，分离胶和浓缩胶所使用的SDS浓度是不一样的。一个1cm的胶，可能需要5ml的制胶液体。 3.配胶归配胶，分离胶的玻璃板如何安装才能不漏液也是一门技术活。我没有提前去把玻璃板清洁，只是临时把玻璃板清洗、擦干、再吹干。（这浪费了许多时间，故建议有自己专属的玻璃板，后者提前准备好。）在安装玻璃板的时候，要准备剥离板的底端要齐整，然后扣在制胶架上，要将绿色的卡夹下压到底，这样才能密切贴合。不然就像我那样，胶（前面提高胶不会凝固）就从缝隙里流光了。有人建议可以在剥离板上涂一些凡士林，有减少漏液的功效。 4.好不容易把胶制好了，开始跑电泳。电泳内槽也开始漏液，真是急死人了。（这时候，老病号的电话打过来了，之前和他约好11点的时候见面，安排复查事宜。两个事情堆在一起急死了。)肾内科的老师LLL建议我把电泳槽灌满电泳液，就没办法漏了，一开始想是个好办法，后来想想把胶重装一遍吧。在重装的过程中确实发现了问题所在，原来内槽上面有一个类似台阶的小疙瘩，之前没有注意到，没有将它配齐，故而留有缝隙，漏液了。于是针对性地重装了一遍，内槽不漏液了。开始电泳。电泳显示选择60V跑浓缩胶，跑了大概十分钟，发现没有啥动静，也没有传说中的泡泡冒出。认真核实了一下电路，没有接错之后，就赶紧去处理老病号的事情。临走之前还让麻醉的小兄弟JZT帮我瞄一眼。这位小兄弟一本正经地和我说，短路了。这可把我吓了一跳，赶紧电话追过去。原来他所谓的短路，是电泳内槽水漏没了。我十分悲伤地放下了电话，抱怨今天白忙活了。等我回到实验室，打开盖子，惊喜地发现电泳内槽水是满的。也发现了marker条带出来了。就是时间很久。大概过了一个消失，终于把分离胶跑完了。开始跑分离胶，设置100V，又过了一个小时，分离胶才跑了三分之一，于是把电压调到120V，又过了一个小时，分离胶才跑了三分之二。眼瞅着下午五点了，而且内参的条带已经出来了，索性把电压调到了150V，没到半小时，就跑完了。 5.转膜。电泳的过程相对比较顺利。不过切胶也切了我大半天，犹豫怎么下手就花了10分钟，现在想来，就是目标条带的判断准确之后，先切去浓缩胶和不要的孔道，然后切去剩下的分离胶。剪PVDF膜和活化膜，比较顺利。在“三明治”的配置过程中，耽搁了一会儿。一定要切记胶和膜的对应方向，膜上还要做个标记，以便判断蛋白所在的位置。开始电转的时候，已经快七点了，一看protocol要60V电转2小时，当时就有些想放弃了。好在问了一位高手YRL，她建议300mA电转45分钟就可以了。我一听一下子轻松了不少。 6.封闭。5%牛奶封闭了一会儿，直接扔冰箱里了。因为已经体力不支了，所以电脑也没带回去。在这期间我把病理切片的名单写在了载玻片上面，算是弥补了一点原本当天要完成的工作。 今天，早早地过去，就是希望把westernblot的流程完成了。 1.洗膜。1X TBST洗膜，这个我已经提前配置好了，没有压力。5minX3次。 2.孵一抗。按照GAPDH说明书，1:4000稀释一抗。我还以为4ml的一抗稀释液要16ul的抗体。我一想，有点不合理吧。我买的GAPDH总共才25ul，一次性全部用了。好在问了肾内科的LLL，跟我解释了一下。原来是抗体和一抗稀释液的配比是1ul和4000ul，果然这样才合理。就这样开开心心地常温孵化抗体3h。在这期间去了趟病理科，把昨天弄好的病理组织块切回来，准备下一步免疫组化。 3.去完病理科，吃了个午饭，没有休息继续奋斗。到细胞房惊喜地发现放在别人细胞层的140细胞居然一点污点都没有。这是细胞培养箱的问题吗？还是我一直怀疑的培养基问题，抑或是培养液没有提前预热的问题？总之，细胞状态很好，就准备一传三，同时冻存一部分。而这次510又开始一反常态，污点变多了，但没有之前增殖那么快，所以今天510我全部扔了。同时将第一次的510复苏了。希望你要好好的，明天见分晓。 4.回收一抗。（请注意，如果你要回收抗体，建议将抗体在冰上孵育，以保证抗体质量）。TBST洗膜三遍，5minX3次。 5.孵二抗。就简单多了。按说明书1:5000稀释，于是乎，二抗和二抗稀释液的配比是1ul和5000ul，继续常温孵化了2h。回收二抗。TBST洗膜三遍，5minX3次。 4.ECL曝光。今天很幸运，在曝光的时候碰到之前认识的一个小兄弟HMT，还认真地教我一遍，包括具体的方法及其选择事由。这次曝光发现了内参还是比较整齐，其上混有一些杂带。继续找人帮我解决。 于是乎，到今天下午，我总算把WB的流程磕磕碰碰地做了一遍，算是小有结果吧。明天看一下M3的曝光情况。期待明天SZM同学给我带来新的食管细胞109和709。还有继续筹备免疫组化的东西，落实het-1a细胞的状况。。。 附： Elivision二步法免疫组化染色步骤 1 石蜡印片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗二次，每次3分钟(3x3min) 2 根据每种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3 如果有必要，每张切片加1滴或50ul的3％H202，室温孵育10分钟，以阻断内原性 过氧化物酶的活性。PBS冲洗3x3·． 4 除去PBS液，每张印片加1滴或50ul第一抗体(用户自选)，室温孵育60分钟或4"C 过夜，建议参见每种抗体的说明书。 5 PBS冲洗3x5"。除去PB5液，每张印片加1滴或50ul聚合物增强刑(试剂 A )，室腽孵育20分钟．PBS冲洗3x3． 6 除去PBS液，每张切片加1滴或50ul酶标抗鼠／免聚什物(试剂 B )，室温孵育30分钟。PBS冲洗3x3·． 7 除上PBS液，每张切片加1滴或5Oul新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜观察3~5分钟( DAB )或10分钟( AEC )。 8 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1％HCl分化自来水冲洗，PBS返蓝． 9 如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封片，如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水， 而直接用水性封片剂。