pcr技术的原理

PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。它基于DNA的复制原理，通过酶的作用在体外模拟DNA复制过程。PCR的步骤包括变性、退火和延伸。首先，将DNA加热使其变性，使双链分离为单链。然后，降温使引物与DNA单链结合，形成DNA引物复合物。最后，加入DNA聚合酶和碱基，使DNA链延伸，并重复这个循环多次，每次都将DNA复制一倍。通过PCR，可以在几小时内从少量DNA扩增成大量DNA，以便进行进一步的研究。

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又称实时PCR技术。该技术在常规PCR基础上，添加了一条标有两个荧光基团的荧光双标记探针，一个标记在探针的5u2032端称为报告基团(Reporter，R)；另一个标记在探针的3u2032端称为荧光抑制基团或称淬灭基团(Quencher，Q)。两者可构成能量传递结构，即5u2032端R发出的荧光信号可被3u2032端R基团抑制。3u2032端的-OH已被封闭，不具有延伸的能力。探针引物在无特异性PCR扩增时，荧光信号不改变。在PCR反应开始后，随着链的延长，荧光定量PCR的Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合部位，发挥它的5u2032-3u2032外切酶活性，将荧光探针切断。一但切断，Q基团的抑制作用消失，从而引起R基团的荧光信号增长，被释放的游离R基团的数目和PCR产物的数量是一对一的关系，因此R基团的荧光信号的强弱就与PCR产物的数量成正比关系。测定出前者就可以推算出后者。这就是荧光定量PCR的原理。在PCR的过程中，连续不断地检测反应体系中的荧光信号的变化，当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和标准差，计算出99.7%的置信度大于平均值的荧光值，即阈值)，此时循环次数(ct)就被记录下来，该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，利用阳性梯度标准品的ct值，制成标准曲线，再根据样品的ct值就可以准确定出起始DNA的拷贝数。

所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。其原理是在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”。而且这种新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。扩展资料：模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。