rnai

用绿色荧光蛋白（GFP）反映RNA干扰（RNAi）载体的转染率，以研究RNAi载体的抑制效果

荧光定量PCR加入带荧光基团探针探针能目基结合单链DNA合双链DNA荧光基团激发光所实检测反应物荧光强度反应双链DNA浓度由于合双链DNA速率模板浓度关所参考曲线比较计算模板相浓度模板信号RNA其反应基发达量

用绿色荧光蛋白（GFP）反映RNA干扰（RNAi）载体的转染率，以研究RNAi载体的抑制效果

你是问shRNA吧？loop大小在4-11nt，7-9nt较为合适，目前常用的有GCAAGAG等；RNAi的靶基因序列在19-29nt，再加上各个元件，合成后的dsRNA长度大约在80bp左右。

VIGS病毒诱导的基因沉默。原理都是一样的，只不过是利用病毒诱导的RNA干扰。病毒做为载体（插入你靶基因的片段）去侵染寄主，引起靶基因沉默。

RNA干扰的分子抑制机制的三种方式及原理转录抑制 与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域从头合成DNA的甲基化。Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。转录后抑制不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生siRNA片断，再由合成的RISC切割靶mRNA从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻断，这种RNAi方式叫做转录后沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS)。siRNA对靶mRNA降解具有序列特异性，只能引起同源mRNA降解，如果siRNA与mRNA有一个bp不配对，RNAi作用就极大降低，如果两者有4个bp不配对，就不能产生RNAi。翻译抑制 Grishok等在研究RNAi时，发现在细胞中在细胞中存在内源性小片段单链RNA(ssRNA)，其长度也在21～25 nt之间，这种ssRNA可与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)特异性地结合，从而抑制mRNA的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的ssRNA叫做stRNA(small temporal RNA)。ssRNA的形成是因为当RNA的大小为70～80 nt时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在21～25 nt之间，这样的双链结构易被Dicer酶识别并切割成stRNA，由stRNA抑制翻译。这种方式的RNAi也作用于转录后形成的mRNA，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。

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retrotransposon或retroposon指通过RNA为中介，反转录成DNA后进行转座的可动元件。这样的转座过程称为反转座作用retrotrans—position。在结构和复制上与反转录病毒(retrovirus)类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成mRNA,再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座，每转座1次拷贝数就会增加1份。RNA干扰是抑制破坏基因结构的一种DNA片段转座子活性的重要方式。转座子通常以逆转座的方式在基因组中扩增。在逆转座过程中产生的双链RNA分子可以被Dicer识别，从而被降解。

你是南通大学预防的吧~~　通过灭活基因确定未知基因功能采用实验技术在分子水平上灭活特定基因,然后从整体上观察表型改变,可以推测相应基因的功能。灭活特定基因的方法有以下几种。1. 1. 1 　基因敲除(gene knockout)早期,人们用基因敲除将一个结构已知但功能未知的基因剔除,或用其他顺序相近基因取代,然后从表型改变推测相应基因的功能。比如Mota 等通过基因敲除技术研究TRA P 基因在伯氏与约氏疟原虫中的功能及其差异[2 ] 。传统的基因敲除方法虽然可以确定一些基因的功能,但存在技术要求高、操作过程烦琐、花费大等方面的弱点,在一定程度上限制了它的广泛应用。1. 1. 2 　反义RNA(antisense RNA)反义RNA 作为反向遗传学的另一种方法,曾广泛应用于研究基因功能,至今在基因功能鉴定上仍发挥着作用。Yao 等利用反义RNA 下调基因表达,分析了利什曼原虫表面蛋白水解酶的重要作用[3 ] 。但是用反义RNA 关闭基因表达具有作用较弱等缺点。1. 1. 3 　RNA 干扰(RNA interference ,RNAi)外源和内源性双链RNA ( double2st randedRNA ,dsRNA) 在细胞内诱导同源序列的基因表达受到抑制的现象称为RNA 干扰,是1998 年由Fire首次发现并命名的转录后水平的基因沉默,是《Sci2ence》和《Nature》评出的2002 年度最重要的科技成果之一,以其简单有效的特点正成为替代其他基因灭活方法的重要的反向遗传学研究工具。1. 2 　基因过表达( gene overexpression)Simonet 等利用此技术研究小鼠,用含有仅在肝细胞中表达的高活性启动子使小鼠过表达OPG(osteoprotegerin) 基因,得到的转基因小鼠的骨密度明显高于正常小鼠,说明该基因参与骨质合成[4 ] 。1. 3 　其他研究基因功能的方法定点诱变( site2directed mutagenesis) 或体外诱变( in vit ro mutagenesis) 可以用来探索基因的具体功能。使用各种定点诱变或体外诱变可以缺失或改变基因中的部分序列,而大部分序列不改变,这样仍可合成蛋白质,并保留主要活性。通过这种方法可以研究基因中某些序列编码的氨基酸在整个蛋白质中所起的作用,如可能是控制蛋白质在细胞中的定位或者负责蛋白质对化学信号的反应等;利用定点诱变还可以产生基因的突变体,比较突变体与原基因的功能差异,可进一步认识基因的功能。如黄长晖等通过体外定点诱变生成抑癌基因P16 的P48L和D74N 突变体来研究该基因的功能[5 ]此外,基因功能的线索可以通过研究基因表达的时间和空间来获得。如果基因的表达限制在多细胞生物的特定器官或组织,或者器官或组织中的某类细胞,那么这种定位信息就可以用来推测基因产物的一般功能。2 　以RNAi 为基础的反向遗传学在寄生虫研究中的应用2. 1 　概述RNAi 作为反向遗传学的一种方法,为后基因组时代的基因功能分析提供了一个可靠而又快速的应用平台。RNAi 克服了传统的基因剔除、转基因等方法的弱点,以其快速、可靠、经济的特点受到越来越多生物学家的重视。RNAi 正广泛应用于基因功能研究。Kiehl 等将在秀丽隐杆线虫( Caenorhabditis ele2gans) 肌肉和神经组织中高度表达的未知功能的at x22 基因和f ox21 基因的双链RNA 分别导入L4期幼虫体内触发产生RNAi ,发现at x22 基因表达被干扰后,幼虫的下一代胚胎发育受到抑制;当f ox21基因表达受到干扰时,成虫的产卵率明显下降。从而得知at x22 基因和f ox21 基因的表达分别与胚胎发育和成虫生殖有关[6 ] 。Fraser 和Conczy 等合成了大量与开放读框相对应的特异性的dsRNA 以及表达这些dsRNA 的细菌克隆,结合子代分析和时间推移差异干扰比较显微分析( time2lapse differentialinterference cont rast microscopy assay) 的方法,成功地在基因组水平上大规模地筛选了功能基因,证明了秀丽隐杆线虫一号、三号染色体上与早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等相关基因的功能[7 ,8 ] 。Vayssie等在溶组织内阿米巴中通过RNAi 证明了γ2微管蛋白对于微管成核作用(microtubule nucleation) 的重要性[9 ] 。Levashina 等用dsRNA 敲除蚊虫的一种补体样蛋白基因,证明了它在昆虫与脊椎动物免疫吞噬作用中的功能具有保守性[10 ] 。Blandin 等用dsRNA直接注射敲除蚊虫的防御素基因( defensingene) ,证明了它的功能[11 ] 。Bettencourt 等通过注射dsRNA 到cecropia pupae 来沉默其Hemolin 基因揭示了它对下一代的胚胎正常生长具重要作用[12 ] 。第二个和第三个书上《基因表达与调控》有的。

RNA干扰是用和目标mRNA互补的小片段RNA（siRNA）降解mRNA的过程.siRNA是合成的22nt左右的双链的RNA. RNA干扰主要是通过降解mRNA来实验抑制基因的表达. siRNA不是必须的,在实验过程中,可以用二型启动子转录shRNA的表达,这个过程可以通过转染质粒来完成.

作者单位:215003江苏省苏州大学附属儿童医院中心实验室u30fb综述u30fb基因敲除的新技术———RNAi金美芳综述 朱雪明审校 【摘要】 RNA干扰(RNAi)是一种新兴的基因阻断技术,它通过双链RNA分予介导,特异降解相应序列的mRNA,从而导致转录后水平的基因沉默,自1995年首次报道以来已取得了重大研究进展。近8年来,研究者对RNAi现象进行了广泛、深入的探索研究,预示RNAi有望成为今后分析人类基因功能的有力工具,并将在人类疾病的基因表达显像和治疗方面发挥重要作用。【关键词】 RNA干扰; 基因敲除; 基因沉默中图分类号:R457.4文献标识码:A文章编号:167324130(2007)1121016204 基因敲除是一种反向的遗传学研究方法,是八十年代后发展起来的一种新型的分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,但此技术较复杂且成功率不高。随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和RNA干扰(RNAinterference,RNAi),它们同样可以达到基因敲除的目的。其中RNAi由于方法简便,周期较短,因此近几年来越来越多的基因敲除采用了RNAi方法[1～3]。RNAi是指双链RNA诱导同源mRNA降解导致基因表达抑制的现象,又称基因沉默.是一种转录后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)现象,是生物体在进化过程中抵御病毒感染及防御重复序列和突变引起基因组不稳定的保护机制。RNAi现象的发现1995年,Ouo等发现注射正义RNA和反义RNA均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par21基因的表达,该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年,Fire等证实Guo等发现正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量内源或外源双链RNA(double2strandedRNA,dsRNA),而引发并将这一现象命名为RNAi。此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马壁等多种真核生物中,并逐渐证实植物中的转录后基因沉默、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑带(quelling)现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。RNAi阻断基因表达的机理双链RNA进入细胞后,能够在Dicer酶的作用下被裂解成小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),而另一方面双链RNA还能在RdRP(以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNA2di2rectedRNApotyraerase,RdRP)的作用下自身扩增后,再被Dicer酶裂解成siRNA。siRNA的双链解开变成单链,并与某些蛋白形成复合物,Argonaute2是目前唯一己知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合,一方面使mRNA被RNA酶裂解,另一方面以siRNA作为引物,以mRNA为模板,在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA,它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siR2NA也具有诱发RNAi的作用,通过这个聚台酶链式反应,细胞内的siRNA大大增加,显著增加了对基因表达的抑制。从21～23个核昔酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi,但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。RNAi基因敲除的优点1.比同源重组法更加简便,周期大大缩短。2.对于哺乳动物,如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因,可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。3.由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达,它成为研究信号传导通路的良好工具。4.RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因,如可用RNAi来阻断某些基因的表达,来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中起着关键作用。siRNAs的制备方法目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括:化学合成、体外转录、长片段dsRNAs经RNaseⅢ类降解(如Dicer,E.coli,RNaseⅢ)、siRNA表达载体或病毒载体在细胞中表达siRNAs、PCR制备的siRNA

RNAi技术是一种利用RNA干扰的技术，可以用来研究基因的功能。要利用RNAi技术研究基因的功能，首先要构建RNA载体。首先，根据已知的DNA序列，对其进行反式转录，得到目标基因的mRNA序列，然后将mRNA序列进行剪切，得到短的RNA片段（siRNA），最后将这些siRNA片段结合到RNA载体上，就可以构建RNA载体。构建完成后，将RNA载体输入到细胞中，就可以进行RNA干扰，从而研究基因的功能。

没什么区别 不过RNAi的话就有很多种啦 可以是siRNA 可以是miRNA 反义表达载体就相当于siRNA了吧 效果都是降低目的基因的表达量

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，(长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性)所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。RNAi具有的特征①RNAi是转录后水平的基因沉默机制;②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA;③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的;④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点;⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡;⑥ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。

在RNA干扰实验中 首先需要构建dsRNA表达载体 将这种载体导入受体细胞中后 表达产生的dsRNA在DICER酶作用下形成siRNA 引起具有相同序列的mRNA发生讲解 导致细胞或个体不能合成相应的蛋白质 所以个体会表现出功能缺失表型 构建表达载体通常选用dsRNA需要注意的一些方面是dsRNA序列中GC的含量要小于50% 高GC含量会降低RNAi的效果 选定的dsRNA序列应通过搜索数据库确保与其他基因无同源性 以避免对其他同源性基因表达的抑制 不同区域的dsRNA具有不同的基因沉默效果 可同时构建两个以上针对同一基因不同靶区域的dsRNA表达载体 还要充分考虑siRNA的结构特征 siRNA与mRNA的同源程度对RNAi有明显影响 启动子区或者编码区与siRNA同源的基因受siRNA抑制 但siRNA在动物细胞中对mRNA的前体没有影响 所以含非编码区序列的dsRNA不会引起RNAi 而且在构建表达载体时 经常使用U6启动子等RNA聚合酶Ⅲ能够识别的启动子序列最后将其转入到质粒中 这里说的只是一个简单的过程 总的来说构建表达载体是个比较复杂的过程 如果要知道详细的技术 建议还是去看书吧 这里是说不清的

rnaiRNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi的定义目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。 如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。 各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。原理最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA（见图）。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3"末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰（6、7）。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的组分H1 RNA（11）转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来（6、12、13）。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象（11）。另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷（14）。一个5"端为两个2"-O-甲基RNA、3"端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉（15、16）。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验（17）。注射siRNA之后，小鼠肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。应用siRNA可用于研究基因的功能，可是后基因组时代的今天，研究人员已经不满足于一个一个基因沉默这样的研究节奏了，功能基因组学的研究更需要一个能站在全局高度研究多个基因之间关系的工具，因此，用作大规模RNA干扰用的shRNA/siRNA文库应运而生。 shRNA/siRNA文库联合使用高通量筛选技术和高内涵图像分析技术，使得RNAi筛选在反向基因组学、功能基因研究、药物发现等多个领域成为了一个 强大的应用工具。北京赛诺亚生物技术有限责任公司（http://www.sirnoa.com/）是一家拥有独立自主产权的、以RNAi筛选的相关产品和技术服务为重点生物高新技术企业。公司专业从事各种高通量miRNA检测、RNA干扰筛选、药物筛选、文库筛选及相关产品的研发和销售，同时提供进行各种RNAi相关的载体构建、病毒包装 服务和细胞生物学试剂。公司致力于为从事生命科学研究和早期药物研发的科研人员提供一站式的RNA干扰相关服务。总结经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA（这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。

RNAi（RNA interference）是一种重要的基因沉默技术，可以通过抑制特定基因的表达来研究基因功能。shRNA和siRNA是两种RNAi的具体实现方式。shRNA（short hairpin RNA）是由DNA合成的RNA分子，形态类似于头发针。shRNA通过转染等方式进入细胞质，被核酸酶Dicer切割成小分子siRNA，再进一步介导RNAi。siRNA（small interfering RNA）是由外源合成的双链RNA分子，长约20-25个核苷酸。siRNA通过RNA诱导寄生抑制（RNA-induced silencing complex，RISC）复合物与靶基因mRNA结合，介导RNAi。因此，shRNA和siRNA都是介导RNAi的分子。它们的主要区别在于来源和形态。shRNA是由DNA合成的RNA分子，形态类似于头发针，而siRNA是由外源合成的双链RNA分子。shRNA需要被核酸酶Dicer切割成小分子siRNA才能介导RNAi，而siRNA可以直接介导RNAi。此外，shRNA通常需要长时间的表达才能达到较好的沉默效果，而siRNA具有较短的沉默时效性

RNAi是把这个基因沉默掉,其主要目的还是验证这个基因的功能 过表达,如果是在野生型中表达这个基因,其目的还是验证基因功能的,可以和RNAi同步做 但是如果是在其他突变体中过量表达该基因,则是研究这两个基因的依赖关系~

1.RNAi起作用的是siRNA,可以直接合成siRNA或者构建shRNA质粒或者包装shRNA的慢病毒2.rnai的起作用是单链的片段，可以mimic 或者inhibitor 来实现这个microRNA的上调或者下调 or mic up/mic down 的质粒 or mic up/mic down 的慢病毒

相同点：都是针对某个基因，来消除该基因的产物不同点：敲除是在基因组水平，破坏目的基因的序列，出来导致转录出来的基因产物没有活性。而RNAi不影响目的基因的DNA，目的基因也可以正常表达。表达后mRNA被RNAi作用而降解，导致该基因的最终产物减少。基因敲除可以100%消除目的基因的作用，而RNAi会多少有残留。基因敲除的技术比较复杂，而RNAi简单易行。

写作素材翻译整理收集 May 20, 2002 转录后基因沉默（PTGS）最初被认为是一种仅限于矮牵牛和其他几种植物的奇异现象，现在已成为分子生物学中最热门的话题之一。 近几年已经清楚的是，PTGS在植物和动物中都存在，并且在病毒防御和转座子沉默机制中起作用。 然而，也许最令人兴奋的是PTGS的新兴应用，尤其是RNA干扰（RNAi）——通过引入双链RNA（dsRNA）引发的PTGS-作为敲除多种特定基因表达的工具生物。 RNAi是如何发现的？它是如何工作的？也许更重要的是，如何将其用于功能基因组学实验？本文将简要回答这些问题，并为您提供有关PTGS和RNAi研究的深入信息。 发现一个奇怪的现象：植物共抑制和PTGS 十多年前，在矮牵牛中进行了令人惊讶的观察。在尝试加深这些花的紫色时，Rich Jorgensen及其同事在强大的启动子控制下引入了色素生成基因。与其预期的深紫色不同，许多花朵似乎杂色甚至是白色。乔根森称观察到的现象为“共抑制/cosuppression”，因为导入基因和同源内源基因的表达均被抑制。 最初被认为是矮牵牛的怪癖，后来发现共抑制在许多植物物种中都发生。还已经在真菌中观察到了它，并且在克雷索氏菌中被特别好地表征，在那儿它被称为“抑制/quelling”。 但是什么原因导致这种基因沉默呢？尽管在某些植物中转基因诱导的沉默似乎涉及基因特异性甲基化（转录基因沉默或TGS），但在另一些植物中，沉默发生在转录后水平（转录后基因沉默或PTGS）。在后一种情况下的核运行实验表明，产生了同源转录本，但是它在细胞质中迅速降解并且没有积累。 转基因的引入可以触发PTGS，但是也可以通过引入某些病毒来诱导沉默。触发后，PTGS由可扩散的反式作用分子介导。这首先在Neurospora中得到证实，当时Cogoni及其同事证明了基因沉默可以在异核生物株的核之间转移。后来在Palauqui及其同事通过将沉默的，含转基因的来源植物嫁接到未沉默的宿主中而在宿主植物中诱导PTGS时在植物中得到证实。从线虫和苍蝇的工作中，我们现在知道负责植物中PTGS的反式作用因子是dsRNA。 dsRNA基因沉默：RNA干扰 RNAi在线虫中被发现 dsRNA可能导致基因沉默的第一个证据来自线虫秀丽隐杆线虫的工作。七年前，研究人员Guo和Kemphues试图使用反义RNA来关闭par-1基因的表达，以评估其功能。正如预期的那样，反义RNA的注入破坏了par-1的表达，但令人困惑的是，正义链控制的注入也确实如此。 直到三年后，这个结果还是一个谜。然后，Fire和Mello首先将dsRNA（正义链和反义链的混合物）注入到秀丽隐杆线虫中。与仅注射有义或反义链相比，这种注射导致沉默效率更高。实际上，每个细胞仅注射几个分子的dsRNA就足以完全沉默同源基因的表达。此外，将dsRNA注入蠕虫的肠道不仅导致整个蠕虫的基因沉默，而且还导致其第一代后代的基因沉默。 RNAi的效力激发了Fire和Timmons尝试喂养线虫细菌，这种细菌经过改造后可以表达与秀丽隐杆线虫unc-22基因同源的dsRNA。令人惊讶的是，这些蠕虫形成了unc-22 null-like表型。进一步的研究表明，将蠕虫浸入dsRNA中也能够诱导沉默。这些策略使大量线虫暴露于dsRNA，从而使大规模筛选能够选择RNAi缺陷的秀丽隐杆线虫突变体，并导致对该生物体内的大量基因敲除研究。 果蝇中的RNAi 在果蝇中也观察到了RNAi。尽管将酵母工程化以产生dsRNA然后喂给果蝇的策略无法奏效，但用dsRNA显微注射果蝇胚胎确实会产生沉默（2）。也可以通过用“基因枪”将dsRNA“射击”到果蝇胚胎中，或通过工程蝇携带带有待沉默基因的反向重复序列的DNA来诱导沉默。在过去的几年中，这些RNAi策略已被用作果蝇生物，胚胎裂解液和细胞中的逆向遗传学工具，以表征各种功能丧失的表型。 RNAi的生化机制 那么注射dsRNA如何导致基因沉默呢？在过去的几年中，许多研究小组都在努力地回答这一重要问题。鲍尔科姆和汉密尔顿的一项重要发现提供了第一个线索。他们鉴定出在非沉默植物中共抑制的植物中约25个核苷酸的RNA。这些RNA与被沉默基因的有义和反义链都是互补的。 在果蝇中的进一步工作-使用胚胎裂解液和源自S2细胞的体外系统-为受试者提供了更多的信息。在一系列值得注意的实验中，Zamore及其同事发现，添加到果蝇胚胎裂解物中的dsRNA被加工成21-23个核苷酸。他们还发现，同源内源性mRNA仅在与导入的dsRNA相对应的区域被切割，并且切割以21-23个核苷酸的间隔发生。迅速地，RNAi的机制变得清晰起来。 RNAi机制的当前模型 生化和遗传方法（请参阅下面的“ PTGS和RNAi涉及的基因和酶”中有关用于理解RNAi的遗传方法的讨论）都形成了RNAi机制的当前模型。在这些模型中，RNAi包括启动步骤和效应器步骤（另请参见参考文献3的Flash动画“ RNAi如何工作？”）。 在起始步骤中，将输入的dsRNA消化成21-23个核苷酸的小干扰RNA（siRNA），也称为“引导RNA”。有证据表明，dscer酶是dsRNA特异性核糖核酸酶RNase III家族的一员，Dicer酶以ATP依赖性，加工方式连续切割dsRNA（直接或通过转基因或病毒引入）。连续的切割事件将RNA降解为19-21 bp的双链体（siRNA），每个双链体都带有2个核苷酸的3"突出端。 在效应子步骤中，siRNA双链体与核酸酶复合物结合形成所谓的RNA诱导的沉默复合物或RISC。激活RISC时，需要依赖ATP的siRNA双链体展开。然后，活性RISC通过碱基配对相互作用靶向同源转录本，并从siRNA的3"末端切割u301c12个核苷酸的mRNA。尽管目前尚不清楚切割的机理，但研究表明，每个RISC都包含单个siRNA和一个与Dicer不同的RNase。 由于RNAi在某些生物体中的显着效力，因此还提出了RNAi途径内的扩增步骤。扩增可通过复制输入的dsRNA（可产生更多的siRNA）或通过siRNA自身的复制来进行（请参见下面的“ RNA依赖性RNA聚合酶的可能作用”）。替代地或另外，可以通过RISC的多个周转事件来实现扩增。 PTGS和RNAi涉及的基因和酶 RNA依赖的RNA聚合酶的可能作用 Neurospora，秀丽隐杆线虫和拟南芥的遗传筛选已鉴定出一些基因，这些基因似乎对PTGS和RNAi至关重要。其中一些，包括Neurospora qde-1，拟南芥SDE-1 / SGS-2和秀丽隐杆线虫ego-1，似乎编码RNA依赖性RNA聚合酶（RdRPs）。乍一看，可以假设这证明RNAi需要RdRP活性。如果RdRP在切割前直接扩增dsRNA或直接扩增siRNA，RdRP的存在当然可以解释dsRNA诱导的沉默的显着效率。但是这些基因的突变体具有不同的表型，这使得RdRP在RNAi中的作用难以辨别。 在秀丽隐杆线虫ego-1突变体（“ ego”代表“ glp-1增强剂”）中，RNAi在体细胞中正常运行，但在主要表达ego-1的种系细胞中有缺陷。在拟南芥SDE-1 / SGS-2突变体中（“ SGS”代表基因沉默的抑制物），当通过内源复制的RNA病毒引入dsRNA时，会产生siRNA，而通过转基因引入时则不会产生siRNA。已经提出在这些突变体中病毒RdRP可能替代了拟南芥酶。尽管在果蝇或人类中均未发现RdRP的同源物，但最近在果蝇胚胎裂解液中报道了RdRP的活性。一种称为“随机降解PCR”模型的扩增模型表明，RdRP使用siRNA的导链作为目标mRNA的引物，从而为Dicer生成了dsRNA底物，从而产生了更多的siRNA。在蠕虫中发现了支持该模型的证据，而从果蝇胚胎裂解物中获得了反驳该模型的实验结果。 RNAi引发剂 两种秀丽隐杆线虫基因rde-1和rde-4（“ rde”代表“ RNAi缺陷”）被认为与RNAi的起始步骤有关。这些基因的突变体产生的动物通过注射dsRNA可以抵抗沉默，但是沉默可以通过从没有沉默缺陷的杂合子亲本中传递siRNA来实现。秀丽隐杆线虫的rde-1基因是一个大家族基因的成员，与Neurospora qde-2（“ qde”代表“抑制缺乏”）和拟南芥AGO1基因（“ AGO”代表“ argonaute”）同源。 ”；以前已确定AGO1与拟南芥的发育有关。尽管这些基因在PTGS中的功能尚不清楚，但已将RDE-1家族的哺乳动物成员鉴定为翻译起始因子。有趣的是，对共抑制有缺陷的AGO1拟南芥突变体在叶片发育中也表现出缺陷。因此，PTGS中涉及的某些过程或酶也可能参与发育。 RNAi效应子 PTGS的效应子步骤的重要基因包括秀丽隐杆线虫rde-2和mut-7基因。这些基因最初是从不能将RNAi传递给其纯合后代的杂合突变蠕虫中鉴定出来的。带有突变的rde-2或mut-7基因的蠕虫表现出有缺陷的RNAi，但是有趣的是，它们还证明了转座子活性水平的提高。因此，转座子的沉默似乎是通过与RNAi和PTGS相关的机制发生的。尽管尚未鉴定出rde-2基因产物，但mut-7基因编码的蛋白与RNase D的核酸酶结构域具有同源性，并且与人的Werner综合征（一种快速衰老疾病）有关（。也许这种蛋白质是目标RNA降解所需的核酸酶活性的候选者。 PTGS具有悠久的历史 遗传和生物化学方法的发现都表明PTGS具有深厚的进化根源。有人提出，PTGS可能是抵御转座子或RNA病毒的防御机制，也许是在动植物分化之前发展的。 有趣的是，许多研究人员指出，RNAi所需基因的破坏通常会导致严重的发育缺陷。该观察结果提示RNAi与至少一个发育途径之间存在联系。 一组称为小时序RNA（stRNA）的小RNA分子通过翻译靶标转录物来调控秀丽隐杆线虫的发育时间。研究表明，将秀丽隐杆线虫lin-4和let-7 stRNA从这些较长的转录本折叠成茎环结构后，由70个核苷酸的转录本生成。折叠的RNA分子被切酶切割（产生秀丽隐杆线虫中的DCR-1），以产生22 nt stRNA。因此，Dicer既生成siRNA，也生成stRNA，并代表RNAi和stRNA途径的交点。 最近，在果蝇，秀丽隐杆线虫和HeLa细胞中发现了近100个另外的u301c22 nt RNA分子，称为microRNA（miRNA）。这些miRNA与lin-4和let-7非常相似，它们是由折叠成茎环二级结构的前体RNA分子形成的。据信，新发现的约22 nt的miRNA在调节基因表达中起作用，并且已知其中至少有两个需要Dicer来生产。似乎在整个进化过程中，将小RNA用于基因调控和RNAi是一个共同的主题。 在哺乳动物细胞中诱导RNAi-从机理到应用 长dsRNA导致的非特异性基因沉默 尽管已经在多种生物（植物，原生动物，昆虫和线虫）中观察到了RNAi的天然存在，但哺乳动物细胞中存在RNAi的证据需要花费更长的时间才能建立。将长dsRNA分子（> 30 nt）转染到大多数哺乳动物细胞中会导致基因表达的非特异性抑制，这与其他生物体中看到的基因特异性抑制相反。这种抑制作用归因于抗病毒反应，它通过两种途径之一发生。 在一种途径中，长dsRNA激活蛋白激酶PKR。活化的PKR进而磷酸化并使翻译起始因子eIF2a失活，从而导致翻译受阻。在另一种途径中，长dsRNA激活RNase L，导致非特异性RNA降解。 许多研究小组表明，小鼠胚胎干（ES）细胞和至少一种胚胎来源的细胞系不存在dsRNA诱导的抗病毒反应。因此，可以使用长dsRNA沉默这些特定哺乳动物细胞中的特定基因。但是，抗病毒反应无法在大多数其他哺乳动物细胞类型中使用长dsRNA诱导RNAi。 siRNA绕过抗病毒反应 有趣的是，长度小于30 nt的dsRNA不会激活PKR激酶途径。这一观察结果以及对长dsRNA会在蠕虫和果蝇中裂解形成siRNA以及siRNA能够在果蝇胚胎裂解液中诱导RNAi的认识促使研究人员测试引入siRNA是否会在哺乳动物细胞中诱导基因特异性沉默。实际上，发现通过瞬时转染引入的siRNA以序列特异性方式有效地诱导了哺乳动物培养细胞中的RNAi。 siRNA的有效性各不相同-最有效的siRNA可使靶RNA和蛋白质水平降低> 90％。事实证明，最有效的siRNA是21 nt dsRNA，带有2 nt 3"突出端。 siRNA的序列特异性非常严格，因为siRNA及其靶mRNA之间的单碱基对错配会显着降低沉默。不幸的是，并非所有具有这些特征的siRNA都是有效的。其原因尚不清楚，但可能是位置效应的结果。有关设计siRNA的最新建议，请参见“ siRNA设计”。 RNAi作为功能基因组学的工具 尽管RNAi和PTGS的历史和机理令人着迷，但许多研究人员对RNAi作为功能基因组学工具的潜在用途感到最为兴奋。 RNAi已经被用于确定果蝇，秀丽隐杆线虫和几种植物中许多基因的功能。知道可以通过转染siRNA在哺乳动物细胞中诱导RNAi，因此许多研究人员开始将RNAi用作人类，小鼠和其他哺乳动物细胞培养系统的工具。 在哺乳动物细胞的早期实验中，siRNA是化学合成的（Ambion是提供定制siRNA合成的多家公司之一）。最近，Ambion推出了一种通过体外转录生产siRNA的试剂盒（Silenceru2122siRNA构建试剂盒），这是化学合成的廉价替代品，特别是在需要合成多种不同siRNA的情况下。制备完成后，可通过瞬时转染将siRNA引入细胞。由于功效的差异，大多数研究人员会将3–4个siRNA合成为靶基因，并进行先导实验以确定最有效的一种。用这种方法已经观察到超过90％的瞬态沉默。 到目前为止，将dsRNA注射并转染到细胞和生物中已经成为传递siRNA的主要方法。尽管沉默效果持续了几天，而且似乎确实转移到了子细胞上，但最终确实减弱了。但是，最近，许多研究小组已经开发出表达载体，以在瞬时和稳定转染的哺乳动物细胞中连续表达siRNA。这些载体中的某些已被工程化以表达小发夹RNA（shRNA），该小发夹RNA在体内被加工成能够进行基因特异性沉默的siRNA样分子。载体包含在聚合酶III（pol III）启动子和4-5胸腺嘧啶核苷转录终止位点之间的shRNA序列。转录物终止于终止位点的第2位（pol III转录物自然缺少poly（A）尾巴），然后折叠成具有3"UU突出端的茎环结构。 shRNA的末端在体内进行加工，将shRNA转化为约21 nt siRNA样分子，从而启动RNAi。后一个发现与秀丽隐杆线虫，果蝇，植物和锥虫中的最新实验有关，其中折叠成茎环结构的RNA分子诱导了RNAi（在3中进行了综述）。 由另一个研究小组开发的另一种siRNA表达载体在独立的pol III启动子的控制下编码有义和反义siRNA链。该载体的siRNA链与其他载体的shRNA一样，具有5个胸苷终止信号。两种类型的表达载体的沉默功效均与瞬时转染siRNA所诱导的沉默功效相当。 最近有关RNAi的研究席卷了整个研究领域。快速，轻松地创建功能丧失表型的能力使研究人员急于尽可能多地了解RNAi和有效siRNA的特征。将来，RNAi甚至有望有望开发出基因特异性疗法。人们已经学到了很多有关这种强大技术的知识，但是几乎每天都可以获得其他信息（请参阅RNA干扰资源以了解最新的RNAi研究和工具）。可以肯定地说，RNAi正在改变功能基因组学领域。 专业术语 共抑制-由于引入转基因或被病毒感染而导致的内源基因沉默。这个术语可以指转录后（PTGS）或转录（TGS）级别的沉默，已被植物研究人员广泛采用。 转录后基因沉默（PTGS）-通过引入同源dsRNA，转基因或病毒引起的内源基因沉默。在PTGS中，沉默基因的转录物是合成的，但不会积累，因为它会迅速降解。这是一个比RNAi更通用的术语，因为它可以通过几种不同的方式触发。 抑制-引入转基因诱导的神经孢菌中的PTGS。 RISC-RNA诱导的沉默复合物。核酸酶复合物，由蛋白质和siRNA组成（见下文），靶向并破坏与复合物中siRNA互补的内源性mRNA。 RNA干扰（RNAi）-直接引入dsRNA诱导的转录后基因沉默（PTGS）。研究人员首先对秀丽隐杆线虫使用“ RNA干扰”一词。 siRNA-小干扰RNA。 PTGS的当前模型表明，这些21-23个核苷酸的dsRNA介导PTGS。 siRNA的引入可以在哺乳动物细胞中诱导PTGS。 siRNA显然是通过直接或通过转基因或病毒导入的dsRNA裂解体内产生的。 RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的扩增可能发生在某些生物中。将siRNA掺入RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，将复合物引导至同源内源性mRNA，其中复合物切割转录物。

我们构建稳定或瞬时表达的干扰细胞系的，设计方案就是这样的!

1 RNAi的机制 RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成-22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponent nuclease，RISC)并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达. RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员. Dicer酶广泛存在于蠕虫、真菌、物及哺乳动物体内. 他的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点. 在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21-23个核苷酸的siRNA，他启动了细胞内的RNAi反应. 因少量双链RNA即能阻断基因表达，且此效应可传至子代细胞，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统. 研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP). 在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增. 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成小片段siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA. 小片段siRNA生成后与核酸酶形成复合物，随后mRNA与小片段的正义链置换，被mRNA替代. mRNA的位置与最初正义链的位置相同，从而被核酸酶在相同的位点降解. 更有意义的是mRNA的降解使核酸酶得以再生，这样周而复始，mRNA得以降解，因此RNAi呈酶解动态. 由于mRNA也以21-23 nt的特定间隔降解，因此认为降解dsRNA与mRNA的核酸酶相同. 另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链. 结果mRNA也变成了双链RNA，他在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA. 这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制. RNAi不同于其他基因阻断技术，他是转录后水平的基因静默机制，因此注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应. RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果. dsRNA小片段如小于21-23 nt (如10-15 nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21-23 nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围. RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代2 双链RNA的构建 双链RNA可先在体外构建好，用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差，转化到细胞内的双链RNA半衰期短. 而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用. 构建双链RNA表达载体，使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成. 因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，他指导的转录就会终止，且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，因此合成的RNA无polyA尾. U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别，合成出RNA. Sui et al 用Bluescript作为载体，RNA多聚酶Ⅲ可识别的U6作为启动子，从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1)，将其插入到Bluescript载体中. 然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2. 他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA. 片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止. 而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3"端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而有利于双链RNA诱发RNAi. RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA. T7也可作为启动子合成dsRNA. 将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体. 用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA. 在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶. 腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al 用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA，并成功的阻断了基因的表达.RNA interference (RNAi) is a mechanism in molecular biology where the presence of certain fragments of double-stranded RNA (dsRNA) interferes with the expression of a particular gene which shares a homologous sequence with the dsRNA. RNAi is distinct from other gene silencing phenomena in that silencing can spread from cell to cell and generate heritable phenotypes in first generation progeny when used in Caenorhabditis elegans.Before RNAi was well characterized, it was called by other names, including post transcriptional gene silencing and transgene silencing. Only after these phenomena were characterized at the molecular level was it obvious that they were the same phenomenon.The use of RNA to reduce expression in plants has been a common procedure for many years. Single-stranded antisense RNA was introduced into plant cells that hybridized to the cognate, single-stranded, sense messenger RNA. While scientists first believed that the resulting dsRNA helix could not be translated into a protein, it is now clear that the dsRNA triggered the RNAi response. The use of dsRNA became more widespread after the discovery of the RNAi machinery, first in petunias and later in roundworms (C. elegans).RNAi原理图解http://lddljf.stedu.net/Article_Show.asp?ArticleID=1974RNAi知识介绍powerpoint1 http://www.biox.cn/content/20050519/13420.htm2 http://www.biox.cn/content/20050519/13422.htm3 http://www.biox.cn/content/20050519/13423.htm4 http://www.biox.cn/content/20050519/13425.htm5 http://www.biox.cn/content/20050519/13426.htm6 http://www.biox.cn/content/20050519/13429.htm7 http://www.biox.cn/content/20050519/13431.htm8 http://www.biox.cn/content/20050519/13433.htm9 http://www.biox.cn/content/20050519/13434.htm

RNAi (RNA interference) 即RNA干涉,是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中.同时作为一项新兴生物技术,RNAi有着广泛的应用前景.本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景. 1.RNAi的定义目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种,不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果将RNAi看作一种生物学现象,可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.② RNAi是有dsRNA参与指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象.具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后,细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象. 如果将其作为一门生物技术,则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的.② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段,使相应的基因沉默.③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence ,PTGS). 各种不同定义虽然说法不同,但所描述事实是大体相同的,简单地可以说,RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象.

RNAi (RNA interference) 即RNA干涉,是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中.同时作为一项新兴生物技术,RNAi有着广泛的应用前景.本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景.1.RNAi的定义目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种,不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果将RNAi看作一种生物学现象,可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.② RNAi是有dsRNA参与指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象.具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后,细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象.如果将其作为一门生物技术,则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的.② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段,使相应的基因沉默.③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence ,PTGS).各种不同定义虽然说法不同,但所描述事实是大体相同的,简单地可以说,RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象.

http://www.biooo.cn/bbs/dispbbs.asp?BoardID=56&id=611

RNAi技术是指利用体外合成的短双链RNA（21-23个核苷酸）抑制细胞内特定基因表达的技术，是转录后基因沉默的一种研究基因功能的有力工具。

rnai技术瞬时转染是临时性的干扰目的基因的表达，而稳转存在干扰序列随机整合到基因组，整合的位置对细胞的影响不确定，且对照较难控制。talen技术是靶向定位敲出，特异性高，可以针对某个基因进行敲出，不会对基因组的其他位置产生影响。

RNA干扰科技名词定义中文名称：RNA干扰英文名称：RNA interference;RNAi定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科）定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）直接度娘

rnai技术的基本原理如下：1、RNAi即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。2、RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中。3、同时作为一项新兴生物技术，RNAi有着广泛的应用前景。4、本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景。5、RNAi的定义目前对RNAi的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。6、RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。7、具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。

RNAi (RNA interference) 即RNA干涉,是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中.同时作为一项新兴生物技术,RNAi有着广泛的应用前景.本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景. 1.RNAi的定义 目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种,不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果将RNAi看作一种生物学现象,可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.② RNAi是有dsRNA参与指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象.具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后,细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象. 如果将其作为一门生物技术,则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的.② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段,使相应的基因沉默.③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence ,PTGS). 各种不同定义虽然说法不同,但所描述事实是大体相同的,简单地可以说,RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象.

共抑制是指转基因在抑制内源同源基因的同时也抑制自身的表达。共抑制是指转基因方面的。真是由于共抑制现象的发现才引出了后面RNAi的发现。RNAi的机制：1：dsRNA（double　strands　RNA）剪切产生siRNA（short　interfering　RNA）2：RISC（RNA　incluced　silencing　complex）与siRNA识别结合，并介导靶基因的mRNA降解。sdRNA作为RNAi的起始物已经被证实。dsRNA主要是由邻近的启动子或转基因本身的反向重复拷贝导致了dsRNA的产生。

RNAi的可扩散性：Fire等观察到将dsRNA注射于线虫体内，这些dsRNA可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞，引起其他细胞的基因沉默。此外许多研究还显示RNAi信号可以越过胞间屏障向其他细胞和组织扩散，在植物中，RNAi信号可以通过两种途径在细胞间传递：①短距离的相邻细胞之间的传递，植物细胞之间有着非常丰富的连接，即胞间连丝，沉默信号（如siRNA分子）可以通过胞间连丝在细胞间传递；②沉默信号还可以通过植物里纵横交错的脉管系统进行长距离的传送。而在动物中，RNAi信号的扩散需要特殊的蛋白参与，最近Hunter等在线虫中鉴定出了一种与沉默信号传播相关的蛋白，它是由sid-1基因编码的一种跨膜蛋白，能在膜上形成跨膜通道供沉默信号通过，SID-1蛋白同源物在果蝇中不存在，但有研究表明在哺乳动物中存在SID21蛋白同源物。

RNAi的特异性：众多实验结果表明导入生物体的siRNA只能引起同源基因表达的抑制，而无关基因不受影响。而且，在siRNA序列中配对的1921nt中如果只改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶mRNA起作用，证明RNAi有明显的特异性。科学家可以通过制备外源性的siRNA并导入细胞内，特异性地抑制某些基因的过度表达和抑制突变基因的表达，研究基因的功能。

通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。关键词：干扰分子机制RNAisiRNAsRISCRNA干扰分子机制起始阶段效应阶段RNA诱导沉默复合物通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3"端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3"端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.

RNAi的可遗传性：初期的实验观察到，在秀丽新小杆线虫、果蝇和小鼠的实验可以看到，细胞增殖50100倍仍可保持RNAi效应。这说明RNAi有放大的效应，或者有高效的催化机制。然而，虽然RNAi的效应是长效的，甚至在受注射的秀丽新小杆线虫的子一代的整个生活周期里都能持续，但是由于它并不能产生DNA的修饰，随着细胞的不断分裂，dsRNA逐渐被稀释，最终不能持续地遗传下去。

UAS/GAL4系统：是果蝇遗传学中一种常用的异位表达系统。与原核生物乳糖操纵子相似，在酵母中GAL4与UAS结合可以调节与半乳糖代谢相关基因的表达。1988年，Fischer等将GAL4在果蝇的特定组织中表达，发现GAL4能以组织特异性的方式激活与UAS相连接的下游基因的转录。该工作为Brand等1993年的经典之作提供了理论基础。rk RNAi全称应该是UAS-rk rnai。例如Act5C-GAL4处女果蝇和UAS-rk rnai雄果蝇杂交，后代的基因型表示是：Act5C>rk RNAi，意思是在全身表达rk rnai基因干扰的果蝇

shRNA是形成发卡结构的，有配对形成双链的区域siRNA是单链的，可以有各种途径产生，也有成熟的产品可以订购RNAi是一种效应的名称，比如shRNA、siRNA、miRNA等都能产生RNAi

siRNA的结构和功能之间存在相关性：dsRNA经过切割形成2025nt的siRNA，它们具有5′末端的磷酸基，3′末端的羟基和2个突出的单链核苷酸。这种结构对于RNAi是十分必要的，Nykanen等的研究表明平末端的siRNA或失去5′-P基团的siRNA不具有RNAi的功能。所以，siRNA的三大结构特征是：长度为2123nt、双链两端各有两个突出的3′端有羟基、5′端有磷酸基团。这些特征使得siRNA有别于其他的dsRNA，这也是细胞能够区分出真正的siRNA和其他dsRNA的分子基础。基于RNAi的这一特性，细胞可以自行监控异常的mRNA，并封闭该基因的表达。

什么是CRISPR/Cas9？ CRISPR----Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。 07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的 CRIS

VIGS 病毒诱导的基因沉默。 原理都是一样的，只不过是利用病毒诱导的RNA干扰。病毒做为载体（插入你靶基因的片段）去侵染寄主，引起靶基因沉默。

RNAi是把这个基因沉默掉，其主要目的还是验证这个基因的功能 过表达,如果是在野生型中表达这个基因，其目的还是验证基因功能的，可以和RNAi同步做但是如果是在其他突变体中过量表达该基因，则是研究这两个基因的依赖关系~~

　　1 RNAi的机制　　RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成-22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponent nuclease，RISC)并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达.　　RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员. Dicer酶广泛存在于蠕虫、真菌、物及哺乳动物体内. 他的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点. 在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21-23个核苷酸的siRNA，他启动了细胞内的RNAi反应. 因少量双链RNA即能阻断基因表达，且此效应可传至子代细胞，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统. 研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP). 在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增. 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成小片段siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA. 小片段siRNA生成后与核酸酶形成复合物，随后mRNA与小片段的正义链置换，被mRNA替代. mRNA的位置与最初正义链的位置相同，从而被核酸酶在相同的位点降解. 更有意义的是mRNA的降解使核酸酶得以再生，这样周而复始，mRNA得以降解，因此RNAi呈酶解动态.　　由于mRNA也以21-23 nt的特定间隔降解，因此认为降解dsRNA与mRNA的核酸酶相同. 另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链. 结果mRNA也变成了双链RNA，他在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA. 这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制. RNAi不同于其他基因阻断技术，他是转录后水平的基因静默机制，因此注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应. RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果. dsRNA小片段如小于21-23 nt (如10-15 nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21-23 nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围. RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代　　2 双链RNA的构建　　双链RNA可先在体外构建好，用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差，转化到细胞内的双链RNA半衰期短. 而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用. 构建双链RNA表达载体，使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成. 因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，他指导的转录就会终止，且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，因此合成的RNA无polyA尾. U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别，合成出RNA. Sui et al 用Bluescript作为载体，RNA多聚酶Ⅲ可识别的U6作为启动子，从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1)，将其插入到Bluescript载体中. 然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2. 他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA. 片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止. 而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3"端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而有利于双链RNA诱发RNAi. RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA. T7也可作为启动子合成dsRNA. 将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体. 用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA. 在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶. 腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al 用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA，并成功的阻断了基因的表达.　　RNA interference (RNAi) is a mechanism in molecular biology where the presence of certain fragments of double-stranded RNA (dsRNA) interferes with the expression of a particular gene which shares a homologous sequence with the dsRNA. RNAi is distinct from other gene silencing phenomena in that silencing can spread from cell to cell and generate heritable phenotypes in first generation progeny when used in Caenorhabditis elegans.　　Before RNAi was well characterized, it was called by other names, including post transcriptional gene silencing and transgene silencing. Only after these phenomena were characterized at the molecular level was it obvious that they were the same phenomenon.　　The use of RNA to reduce expression in plants has been a common procedure for many years. Single-stranded antisense RNA was introduced into plant cells that hybridized to the cognate, single-stranded, sense messenger RNA. While scientists first believed that the resulting dsRNA helix could not be translated into a protein, it is now clear that the dsRNA triggered the RNAi response. The use of dsRNA became more widespread after the discovery of the RNAi machinery, first in petunias and later in roundworms (C. elegans).　　RNAi原理图解　　http://lddljf.stedu.net/Article_Show.asp?ArticleID=1974　　RNAi知识介绍powerpoint　　1 http://www.biox.cn/content/20050519/13420.htm　　2 http://www.biox.cn/content/20050519/13422.htm　　3 http://www.biox.cn/content/20050519/13423.htm　　4 http://www.biox.cn/content/20050519/13425.htm　　5 http://www.biox.cn/content/20050519/13426.htm　　6 http://www.biox.cn/content/20050519/13429.htm　　7 http://www.biox.cn/content/20050519/13431.htm　　8 http://www.biox.cn/content/20050519/13433.htm　　9 http://www.biox.cn/content/20050519/13434.htm参考资料：任玥欣, 宋于刚, 陈学清. RNAi研究进展. 世界华人消化杂志 2004;12(3):748-750 http://www.wjgnet.com/1009-3079/12/748.asp

RNA干扰科技名词定义中文名称：RNA干扰英文名称：RNAinterference;RNAi定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科）定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）直接度娘

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RNAi首先由Fire等1998年发现于秀丽新小杆线虫（emphasis：role=italicCaenorhabditis：elegansemphasis），他们将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达，并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又称RNAi为转录后基因沉默（postt：ranscriptional：gene：silencing，PTGS）。随后人们陆续在果蝇emphasis：role=italic（Drosophila）emphasis、锥虫（emphasis：role=italicTrypanosomesemphasis）、涡虫（emphasis：role=italicPlanariaemphasis）、斑马鱼（emphasis：role=italicZebrafishemphasis）、拟南芥（emphasis：role=italicArabidopsis：thalianaemphasis）、大小鼠和人体内发现了RNAi现象，遗传学研究表明RNAi是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制，与真核细胞中许多重要生物学过程密切相关。随后，RNAi技术被成功地应用到某些哺乳动物细胞中，展示了此项研究更为广阔的应用前景。

其简单过程是，双链RNA分子被一类成为Dicer的酶剪切成小RNA分子（~35nt），然后与若干蛋白结合形成复合体，经过活化，能特异性结合目标mRNA使其降解。 表观遗传学又称为后遗传学，是近来很热门的研究领域。与经典的遗传学研究不同，研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因功能的改变。简单来说，就是研究从DNA到蛋白过程中可逆的、可遗传的变化。最典型的就是DNA的修饰和组蛋白的修饰，因为这些不同修饰会导致基因的沉默或表达的变化。 RNAi可以看成是一种表观遗传学的一部分。RNAi是对mRNA水平上的调控，没有DNA序列的变化，存在很多内源性的RNAi，很多还在研究中。

虽然对RNAi的研究只有短短几年时间，但RNAi技术已经快速被应用于多个领域，目前在植物上主要用于基因功能研究。随着基因组测序技术的快速发展，科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAi技术已成为解决这些问题的重要手段。与其他方法相比，RNAi技术在基因功能研究上有其独特的优点：①简单易行，容易开展；②与基因敲除（gene：knockout）相比实验周期短，成本低；③与反义技术相比具有高度特异性和高效性；④可进行高通量（high-throughout）基因功能分析。因此，RNAi技术的诸多优点使它很快便被作为研究基因功能的主要方法。在临床应用上，RNAi机制可抑制外源和内源有害基因的表达，如利用RNAi技术把与病毒基因具同源性的siRNA引入感染细胞将会抑制病毒的增殖，这为相关疾病的治疗提供了新的思路。另外，利用RNAi技术还可以高效、特异、快速的抑制细胞内癌基因的表达。可以预测，RNAi技术将会为癌症和病毒疾病治疗带来突破。

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RNAi发挥作用的过程可分为两个阶段，即起始阶段和效应阶段。在起始阶段，双链RNA分子进入细胞后被称为Dicer的核酸酶切割为2123个核苷酸长的小分子干扰RNA片段（small：interfering：RNA，siRNA）。Dicer核酸酶属于RNaseⅢ家族，能够特异识别双链RNA，产生的小片段RNA的3′端都有2个突出碱基。然后双链siRNA与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced：silencing：complex，RISC），随后进入RNA干扰效应阶段，即siRNAs打开双链从而激活RISC，激活的RISC通过碱基配对与具同源序列的mRNA识别并结合，并在距离siRNA：3′端12个碱基的位置切割mRNA。同时，siRNA可作为引物并以mRNA为模板合成新的dsRNA。这样又可进入上述循环，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。确切切割机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的核酸酶。

RNAi技术是指利用体外合成的短双链RNA（21-23个核苷酸）抑制细胞内特定基因表达的技术，是转录后基因沉默的一种研究基因功能的有力工具。

RNAi(RNA干扰)现象是指，当与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA导入细胞后 ，该mRNA发生特异性的降解 ，而导致该基因表达的沉寂 。 从理论上讲 ，分子生物学家只要知道某种基因的DNA序列 ，就可以设计出序列特异性的双链RNA分子 ，作为这种基因的特异性抑制物而影响此基因的表达 。任何植物、线虫、果蝇、脊椎动物的基因都可以通过RNAi技术使其发生表达沉寂，所以RNAi技术已成为后基因组时代生命科学研究的有力工具 。在水稻中利用RNAi技术来验证定位的基因 。如根据定位的矮秆或多蘖基因所在的BAC设计引物 ，获得小片段cDNA ，再将其连到载体中通过农杆菌介导法导入正常的植物体内 ，让其在植物体内表达 。 RNAi的发现 首次发现dsRNA 能够导致基因沉默，来源于线虫的研究 。1995年科研人员尝试用反义RNA去阻断par-1基因的表达以探讨该基因的功能 ，经过反义RNA的确能够阻断par-1基因的表达 。 在1990年 ，科学家们试图相矮牵牛花转导色素合成基因 ，用于增加花瓣的色彩 ，其结果出乎预料 ，转基因植株不仅没有新基因的表达 ，反而自身的色素合成也减弱了 ，一些转基因花出现了全白色或部分白色 。1996年，有人在真菌研究中也发现了类似现象 。在粗糙脉孢菌中 ，导入合成胡萝卜素的基因后 ，引起了约30%被转化细胞的脉孢菌自身基因的失活 。RNAi发现以后 ，人们相继在烟草和拟南芥等植物中证明dsRNA可以引起植物的RNAi现象 。 到1998年，有科学家将dsRNA注入到优美新小杆线虫体内 ，发现虫体内与dsRNA同源的内源性基因表达沉默 ，称此现象为RNAi。随后 ，RNAi现象被广泛的发现存在于真菌 、拟南芥、水蛭、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中 ，并且线虫和果蝇成为研究RNAi的两个最常见的模式生物 。随后在培养的哺乳动物细胞中成功进行了RNAi。由此可见 ，RNAi是生物界中广泛存在的一种现象 。 RNAi技术具有高效性和高度特异性 ，作为关闭基因的新技术 ，已成为基因功能研究中的一种快速、简便的方法 。由于可以作为代替基因敲除的基因工具 ，RNAi技术正在改变着功能基因组学领域的研究步伐 。 随着RNAi技术的不断完善 ，它将为生命科学的研究发挥越来越重要的作用 。

【答案】：RNAi指内源性或外源性双链RNA((tsRNA)介导的细胞内mRNA特异性降解，导致靶基因表达沉默的现象。dsRNA首先被内切核酸酶(dicer)切成长度为19～25个核苷酸的小的RNA干扰(siRNA)片段。然后siRNA与RNA诱发的沉默复合物(RISC)结合，形成siRNA-RISC。RISC-siRNA复合物与一个mRNA分子结合并将其降解后，该复合物还可以作用于另一个mRNA分子，因此一个RISC-siRNA复合物可以降解多个mRNA分子。

rnai技术的基本原理如下：RNA干涉(RNA interference，简称RNAi)是指一些小的双链RNA (double strand RNA,dsRNA)可以高效、 特异的阻断体内 特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术。可以快速分析靶基因的功能，RNAi发展迅速，已成为功能基因组研究和反向遗传学研究的有力工具。RNAi技术被《Science》杂志评为2002年度的十大科技突破。u200dRNAi的分子机制①外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，产生一些dsRNA。胞质中的核酸内切酶Dicer将这些dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的短双链RNA(大约21~25 bp)，即siRNA。②siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，然后反义siRNA再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。③RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，被切割后的断裂mRNA随即降解。④RNAi信号的放大：siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在依赖RNA的RNA聚合酶(RNdependent RNA polymerase, RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

RNAi=RNA interference RNA干预或者干涉(RNA=核糖核酸)

近年研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（double：stranded：RNA，dsRNA）导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，从而导致相应的基因沉默，这种转录后基因沉默机制（post-transcriptional：gene：silencing，PTGS）被称为RNA干扰（RNA：interference，RNAi）。RNAi是真核生物中一种非常保守的机制，它与协同抑制（cosuppression）、转座子沉默（transposon：silencing）以及发育等许多重要的生物学过程密切相关。RNA干扰依赖于小干扰RNA（small：interference：RNA，siRNA）与靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性，涉及众多基因和蛋白复合物，构成了一个以小RNA为核心的真核基因表达调控系统，它可以在染色质水平、转录水平、转录后水平和翻译水平参与基因表达的调节。RNA干扰技术为人们迅速、准确地剖析基因的功能，分析基因之间错综复杂的联系和相互作用提供了极为有用的工具，同时也为人们预防和治疗癌症和病毒疾病提供了新的思路。RNAi是由双链RNA分子在mRNA水平关闭相应基因表达或使其发生沉默的过程，可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质，因此，RNAi技术又被形象地称为基因敲除（knock-down）或基因沉默（gene：silencing），是一种典型的转录后基因调控方法，因此又称转录后基因沉默（PTGS）。RNAi现象广泛存在于生物界中，它在真菌中被称为quelling，在拟南芥、烟草等植物中被称为PTGS或共抑制（co-suppression），在无脊椎动物如果蝇、水螅、线虫以及脊椎动物斑马鱼、小鼠等动物界中被称为RNAi，它可能是生物界，包括植物和动物等普遍存在的一种古老、保守而又极其重要的遗传行为。

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歌曲名:Perfidia歌手:Dorothy Claire&Glenn Miller & His Orchestra&The Modernaires专辑:The Essential Glenn MillerPerfidiaLaura FygiThe Latin TouchAmor sí puedes tú con Díos hablarPregunta le si alguna vezTe dejado de adorarY el mar espejo de mi corazónLas veces que me ha visto llorarLa perfidia de tu amorTe buscado adonde quiera que yo voyY no te puedo ajar(Y no te puedo ajar)Para que quiero otros besosSi tus labios no me quierenYa besarY tú quien sabe por donde andarásQuien sabe que aventura tendrásQue lejos estás de míTe buscado adonde quiera que yo voyY no te puedo ajar(Y no te puedo ajar)Para que quiero otros besosSi tus labios no me quierenYa besarY tú quien sabe por donde andarásQuien sabe que aventura tendrásQue lejos estás de míde míde míhttp://music.baidu.com/song/8813784