west

1、Western Blot原理 Westernblot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。 Westernblot显色的方法主要有以下几种：（1）放射自显影，（2）底物化学发光ECL，（3）底物荧光ECF，（4）底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Westernblot显色底物是化学发光底物，发表文章通常也是用底物化学发光ECL 2、目的蛋白信号弱或无 在Westernblot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。凝胶太厚，曝光时间短也会使蛋白信号降低，因此，要延长转膜时间和胶片的曝光时间。 3、非特性条带 非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好，纯度高，另外适当稀释一抗/二抗浓度，也是有必要的。如果样本在处理过程中发生降解，则样本处理时加入蛋白抑制剂在冰上操作。 4、显影后膜上条带处变为黄色或白色 可能是HRP过高导致的敏感性或背景太高，应降低抗体浓度。 5、条带内无显影的白点 一般是与转膜和显影的操作有关，转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡，显影时膜与X光片间也应避免气泡。 6、存在散在小圆斑 是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。 7、Western Blot化学发光(ECL)淬灭的原因？ Western Blot“淬灭”的原因主要在两方面：含HRP的抗体和发光试剂。由于长期应用某种发光试剂，人们多注意了抗体，不知道发光试剂其实也会对实验结果造成重大影响。对抗体方面来说，可以采用适当降低抗体的浓度，发光实验时快速操作来解决“淬灭”的问题；对发光试剂来说，可以选用发光稳定的发光试剂来解决“淬灭”的问题。 8、Western Blot背景太高 背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色，有时候膜没有完全均匀的浸润也是原因之一。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。第四，抗体浓度太高也会导致背景高，建议实验前进行检测。 9、Western blot 中Tween-20的作用是什么？应该怎么用？ Tween-20是一种非离子型表面活性剂。用途为水包油乳化剂、可用作溶剂、扩散剂、稳定剂、润滑剂和抗静电剂等。气相色谱固定液(最高使用温度120℃)分离分析挥发油、脂肪酸酯、醇、酮和卤化物。Western blot的操作流程中大部分都用到TBST洗液，而且还是封闭，一抗二抗孵育这种比较关键的步骤。通常Tween-20作为一种非离子型表面活性剂，效果和SDS、BSA作用差不多。由于膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时可使用Tween20清除去污剂，而且浓度不要超过0.3%（0.05%效果最好），如果牛奶封闭效果不好可以提高吐温浓度。在WB洗液里的吐温是和BSA一样，对抗原抗体蛋白提供保护作用，同时因为是表面活性剂（司盘加成亲水的环氧乙烷基团后的化合物），可以减少抗体对抗原的非特异性作用，用于洗脱未结合的抗体、减少非特异性结合。Tween-20是我们用TBST的时候Tween-20得用量是0.5ml/L，不加SDS。 10、出现变形条带 凝胶存在气泡或是杂质、电流不稳定、凝胶冷切不均匀。制胶器具和电泳槽保持干净，换新的电解液，保证材料无污染，制胶过程中清除气泡。如电泳槽老化建议换新。尽量选择中间孔加入样品，避免两端上样。

westerns作电影在句子中需要大写，western用在人名、地名、其他特殊名称以及在句首时需要大写。重点词汇：westerns英释义：n.西部片（western的复数形式）；美国西部地区的人；西部电影或小说。短语：spaghetti westerns意大利西部片；意大利式西部片；通心粉西部片。词语使用变化：adj.（形容词）。1、western的意思是“西方的，西部的，在西方的，在西部的”，指世界或一国之西，也可指某地属于或在西部，有时大写。2、western在句中主要用作定语，偶尔也可用作表语。3、western无比较级和最高级。

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法，建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术，是一种用酶标记抗原或抗体的方法。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来。 ELISA试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来，可敏感地检测体液中微量的特异性抗体或抗原。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 ELISA基本原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。 ELISA基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，基本原理有三条： （1） 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2） 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3） 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。　　免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.观察结果。免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。

1、Tween-20是一种非离子型表面活性剂。用途为水包油乳化剂、可用作溶剂、扩散剂、稳定剂、润滑剂和抗静电剂等。气相色谱固定液(最高使用温度120℃)分离分析挥发油、脂肪酸酯、醇、酮和卤化物。2、Tween-20有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。在做western blot时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的标位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。3、Tween20清除去污剂，而且浓度不要超过0.3%（0.05%效果最好），如果牛奶封闭效果不好可以提高吐温浓度。在WB洗液里的吐温是和BSA一样，对抗原抗体蛋白提供保护作用，同时因为是表面活性剂（司盘加成亲水的环氧乙烷基团后的化合物），可以减少抗体对抗原的非特异性作用，用于洗脱未结合的抗体、减少非特异性结合。Tween-20是我们用TBST的时候Tween-20的用量是0.5ml/L，不加SDS。扩展资料Western Blot一般指蛋白质印迹法它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。参考资料来源：百度百科：蛋白质印迹法（Western Blot）参考资料来源：百度百科：Tween20

一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ：原因分析 解决办法 1.一抗和二抗失效 1. 更换抗体；选择现用现配的工作液2.一抗和二抗不匹配 2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物3.发光液失效 3. 更换新的发光液4.抗体染色不充分 4. 增加抗体浓度；延长孵育时间5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低 5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质；增加样品 的上样量。6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂 6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂7.抗体活力降低 7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配二、WB出现白斑是因为转膜过程有气泡存在；或者抗体的分布不均匀，孵育抗体时要使用摇床。三、剪好的PVDF膜在使用前需要甲醇里泡1-2min，在零度的转膜液中孵育3-5min。四、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。

WESTERN UNION境外汇款程序：1.申请书要用英文准确填写。2.汇款货币及金额（阿拉伯数字）。3.收款人姓名及地址。4.收款人在开户银行的账号。5.收款人开户银行名称、SWIFT代码（SWIFT CODE）或地址。WESTERN UNION：西联汇款是国际汇款公司(Western Union)的简称，是世界上领先的特快汇款公司，迄今已有150年的历史，它拥有全球最大最先进的电子汇兑金融网络，代理网点遍布全球近200个国家和地区。西联公司是美国财富五百强之一的第一数据公司(FDC)的子公司。

互联网上几乎可以搜集到所有WesternBlot的中英文资料，仅供实验参考，可以根据自己实验的实际情况进行调整。 这里提供一种：1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。2）按表7.1配制分离胶液体并脱气，然后加入10%的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。表7.1 聚丙烯酰胺分离胶的配制试剂成分 配制不同浓度分离胶所需试剂(ml)5% 8% 10% 12% 15%Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.504×Tris·Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.7510%过硫酸铵 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10%用于16～70kDa，15%用于12～45kDa。3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。样品体积少于10μl不需灌制积层胶。4）用另一根巴斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。让凝胶在室温聚合30min。聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。5)倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。6)按表7.2配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。表7.2 聚丙烯酰胺积层胶的配制GEL%（3.9%) Total (10.05ml)Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml4×Tris·Cl/SDS, pH6.8 2.50 mlH2O 6.10 ml10%过硫酸铵 0.05 mlTEMED 0.01 ml7)将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30min。8)在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。如样品是蛋白质沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸5-10min。按供应商的使用指南用2×SDS加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。对于0.3cm宽的加样孔，推荐加样体积以不超过20μl 为宜。用考马斯亮蓝染色法显迹，成分很复杂的蛋白质混合物需加25～50μg，而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话，只需1～10μg蛋白量。采用银染显迹时，样品用量可减小10～100倍（按样品的复杂程度在小于20μl的体积溶有0.01～0.5ng蛋白样品不等）。2×SDS加样缓冲液(loading buffer)配制：成　分 体积 (ml)0.5M Tris·Cl (pH6.8) 12.520%SDS 11.5Glycerin 102% Blue-Bromo-phenol 2.5β-mercaptoethanol * 5.0加H2O至总体积50 ml，分装*β-mercaptoethanol 在临用前加入。9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔，并以此缓冲液充满之。10）按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入推荐量的1×SDS电泳缓冲液。11）将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。12）用带平嘴针头的50μl注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。13)再往上槽加入余下的1×SDS电泳缓冲液。此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。14）连接电源，对于0.75mm厚的垂直板电泳，先在60V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。15）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。16）将凝胶定位以便识别加样的顺序，将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾上。17）小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测。19)转膜将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。英文1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations20)、清洗将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。（这步忘了！）21)、封闭1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃.22)、一抗孵育一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.23)、清洗将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。24)、二抗孵育二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。25)、清洗同22，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。26)、显色按如下配方配制显色液：1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。

western用在人名、地名、其他特殊名称以及在句首时需要大写。 western：adj.西方的;向西的;西部的； n.(描写19世纪美国西部，尤指有关牛仔生活的)西部电影，西部小说 扩展资料 　　White has always been a symbol of purity in Western cultures. 　　在西方文化中，白色一向象征纯洁。 　　The music was a hybrid of Western pop and traditional folk song. 　　这种音乐融合了西方流行音乐和传统民歌。 　　A fence divides off the western side of the grounds. 　　篱笆把庭院的西面隔开。

大鼠灌注取脑；用途：；1.用于常规HE染色，免疫组化分析；2.冰冻切片可以不做脑组织固定；3.不可用于westernblot和PCR；4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作；原理：；心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织；必要性：；1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易；2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤；3.脑内血液大鼠灌注取脑用途：用于常规HE染色，免疫组化分析。2.冰冻切片可以不做脑组织固定。3.不可用于western blot和PCR。4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1) 麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔麻醉动物。4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排液的有效观察指标。6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。7.后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。补充：还有一种省时省剂的方法。夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。

小梅

一张膜上可以分别贴不同的抗体～一次一种抗体然后二抗显色～显色后PBST／TBST清洗～然后可以贴下一种抗体～之所以不能同时贴多种抗体是因为：1、不同抗体必须不同种属～否则不知道二抗识别的是哪个～2、一抗一般昂贵需要回收～掺入其他抗体没办法再次利用～

跑westernblot时电泳时的条带呈斜行原因很多主要可能是电泳凝胶配制时未搅拌均匀，造成条带未能直线跑完电泳凝胶中混入气泡，造成条带被挤压倾斜也可能是样品缓冲液有干扰，造成条带迁移率不统一另外上样量过大，被其他泳道挤压也有可能

这就好比你把鸡蛋放到98度的水里放了一个小时，而且鸡蛋还加了LOADING BUFFER。当然我个人没做过WESTERN，也不知道PROTOCOL是怎么写的，不过我想，这个蛋白你只能碰碰运气了。蛋白可能已经断了，不知道抗体还能不能找到蛋白。GOOD LUCK。

blotting转膜一般采用“滤纸-凝胶-膜-滤纸”夹心法，凝胶靠近负极，膜靠近正极。因为蛋白上结合有sds，因而带负电，在电流的作用下会从负极向正极运动，从而转移到膜上。

1. western blot每孔上样总量15-50ug大部分蛋白能做出来，跟蛋白质表达量、分子量、抗体效价都密切相关。2. 组织一般取200mg，匀浆后蛋白常能得到几百ug，跑十块胶足够。

荧光western blot注意事项抗体浓度应当优化，在几种不同稀释度的抗体中孵育膜。选择信噪比最高的稀释度。从化学发光转到荧光检测时，一抗浓度应当增加许多封闭液都成功用于荧光检测。建议使用5% 酪蛋白、最多5%的脱脂奶粉，或最多3% BSA，溶于TBST中。缓冲液中的颗粒可能停留在膜上，并造成荧光假象。只使用高质量的试剂，并对所有缓冲液过滤灭菌。使用钝的镊子从边缘操作。避免划破膜或弄皱，这会在荧光检测时造成假象。使用铅笔来标记膜，因为许多墨水都会发出荧光。溴酚蓝会发出荧光。确保染料与样品已分开，切掉凝胶上包含染料的部分，或省掉样品缓冲液中的溴酚蓝。无需在暗处开展免疫检测；正常的室内灯光不会使荧光标记的抗体发生光漂白。在处理膜时，使用无粉末的手套，以避免膜上出现假象或指纹。

封闭非特异性结合位点，让一抗、二抗只跟特异性位点结合，最终才不失实验的意义啊！实验利用一抗特异性结合我们所需半定量测定的蛋白，二抗带显影（荧光、ECL、放射性核素等)根据条带的粗细判断异性蛋白的含量，故只能称作半定量。

vector那一列是对照，Flag-那一列是样品。随着时间的变化，在对照和样品间蛋白表达量的变化。其中alpha-tublin是内参，表示在样品和对照间，其他无关蛋白的量并不随着时间点不同产生变化，所以如果有不同，就是由于时间造成的。

免疫组化利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。所以免疫组化在组织定位和定性上比较准确，但是在定量上不够准确。western blot也是利用抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应。western blot因为有内参标定，所以在定量上要更加准确。但是在组织定位上不如免疫组化

条带分析最好使用其它更为专业的软件（比如nebular提供的Labworks，Quantity one等），但是对于Western这种简单的条带，IPP完全可以分析，只是复杂一点：1 选用指标为IOD，故首先将系统的灰度设定改过来，（改为0 白，255黑） 2 确定背景的灰度（在背景区域选择一个AOI） 3 Histogram显示，平均灰度为66；所以，要通过Operation的功能，将待分析的所有膜照片的背景均加或减到某一固定值（由自己确定，方法见以前的介绍） 4 通过Operation处理后，在Segmentation下，确定阳性区域的范围（所有的图像都应该统一；我选择的是0-98） 5 选择Transparent on white,Create preview image 6 注意新生成的图片不是灰度图，还要经过转换 7 自由AOI，勾画出大概的轮廓即可 8 Histogram，Sum值即为需要的阳性区域IOD 9 改变区域大小，Sum值变化不大（原因为白色背景的IOD均为0） 10 其他条带也通过类似的方法分析；最后求出阳性区域IOD与内参IOD的比值，用于统计学分析。整个分析的关键在于背景灰度的统一与分割时的一点小技巧；如果没有经过Segmentation而直接用自由AOI主观地确定条带的边界，是不可取的。

推荐用TBST进行稀释获得5%的牛奶封闭液（5g/100mL）。拓展：一、牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent;在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。二、用途说明1、 在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。2 、ELISA中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用BSA。3、生化研究，遗传工程和药物研究。

western blot湿转时，恒压和恒流都是可以的恒流的话可以250~270mA，100分钟恒压的话可以100V， 60分钟遇到分子量较大的蛋白，可以适当提高电压和电流，或者转膜时间

需要加beta-actin的一抗，beta-actin分子量42，如果您的蛋白也是差不多大小，那么需要上两次样品，分别做您的目的蛋白和beta-actin，当然您如果做熟练了也可以上一次样，先做目的抗体，压片后strip膜再做beta-actin。如果您的目的蛋白在其他位置，那更方便，上一次样，封闭后把膜裁开，分别加您的目的蛋白一抗和beta-actin的一抗。

western blot实验都需要的基础仪器有：电泳仪，制胶板，电泳槽，湿转的转膜槽或者半干转仪，脱色摇床，暗室，X光片，红外灯，成像仪，一些基础耗材和试剂等基本上生化实验室要做western blot还是很容易的

句首时，w大写

印迹的解释[print] 痕迹;踪迹 成长 道路上留下的印迹 详细解释 痕迹，踪迹。 老舍 《 骆驼 祥子》 二十：“看着这些印迹，他想起 东西 ，想起人，梦似的都不见了。” 李瑛 《＜诗选＞自序》 ：“现在所编的这个选本，我也有意识地 尽量 保留了……我成长的道路的印迹。” 词语分解 印的解释 印 ì 图章，戳记：印章。印玺。 印记 。印把子（亦喻政权）。 痕迹：手印。指印。印子（a.痕迹；b． * 的一种，全称“印印钱”）。 用油墨、染料之类把文字或图画留在纸、布、 器皿 等材料上：印刷。排印。印 迹的解释 迹 ì 脚印：踪迹。 足迹 。血迹。笔迹。 物体遗留下的印痕：印迹。 前人遗留下的事物：古迹。实迹。 追寻踪迹：“汉求 将军 急，迹且至臣家”。 据实迹考知：“迹汉 功臣 ，亦皆割符世爵”。 笔画数：； 部首 ：

western读音：英 ["westu0259n]美 ["westu0259rn]。adj. 西方的；西洋的；西部的。n. 西方人；西部片；西部小说。1、How does Chinese chess differ from western chess?象棋和西洋棋有什么不同?2、I"d love to,but I don"t know much about Western music.我倒想去，但我对西洋音乐了解不多。3、The Western Hemisphere refers to North and South America.西半球是指南北美洲。用法：western的意思是“西方的,西部的,在西方的,在西部的”,指世界或一国之西,也可指某地属于或在西部,有时大写。western在句中主要用作定语,偶尔也可用作表语。western无比较级和最高级。western, west这两个词都可作“在西方的,西部的”解。其区别在于:west重点在于形容方位或指从西方来的; western则指从某一固定点看西方,也可指从某物、某地朝西方看。

转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。 在做Western blot实验中，会用到固相载体(如NC膜，PVDF膜)，在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。 蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。 扩展资料： 封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合，以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上，填补和覆盖蛋白结合位点以避免非特异性结合。同样，这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。 封闭液应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白，不结合靶蛋白表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。 转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。

一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性，也就是5－6个氨基酸吧,变性后，蛋白质的空间结构改变了，但其一级结构是不会改变的；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以最好是根据抗体说明书来确定。SDS在WB中除了上述所说的外，另外一项就是低浓度的SDS有蛋白促溶的作用，能够稳定抗体，并且作为表面活性剂能够使NC膜充分的浸润，这根洗衣粉的道理差不多。

southern：用DNA作为探针杂交DNA。检测目标DNA的存在与否northern：用DNA或RNA探针杂交RNA。检测目标RNA的存在与否western：用抗体和目的蛋白结合进行杂交。检测目标蛋白的存在与否。没有eastern杂交。少数人提议将IEF胶(即等电聚焦电泳)中的蛋白质转印到膜上的技术称为Eastern-blotting，但这一建议并未被广泛接受。

1、丙烯酰胺和N，N"-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N"-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris-CL。5、TEMED原溶液N，N，N"N"四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.6、SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。9、丽春红染液储存液：丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。10、脱脂奶粉5%(w/v)。11、NaN30.02%叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、过氧化物酶标记的第二抗体。15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、100mmol/LNaCl。19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/LEDTA。

SDS-PAGE主要是依据蛋白质分子量的大小对其进行区分的。条带很多条。而蛋白质印记则往往一条泳道上只有一条。有空再给你好好看看。。。

western 确实是形容词，不过，英语可以用形容词来充当名词，表示那一类的人或物。the Western 可以表示整个西方国家，也可以表示 西方人。其他例子： the young 年轻人 the old 老年人。western 和 young， old 一样，有大写和不大写的时候。也不是什么时候都大写的。 大写，是因为专指西方人，或西方国家。

因为转膜的时候时间比较长，在电场的作用下，系统会发热，发热以后会造成样品的降解，导致后续实验当中检测失败。所以不光转膜，有很多过夜的抗体孵育工作，都是在4c条件下进行的，最大限度的保证样品的完整性。

WESTERN UNION是一种近乎实时到帐的快速汇款方式。在中国，只有农业银行和邮局与西联公司签订了合作协议，也就是说，在中国，想要办理此项业务，只可以去这两个地方办理。在国外，比如加拿大，美国，在超级市场里面就设有兑付地点，很方便。如果你想往国外汇钱，你只需要拿着你的身份证（最好带一份复印件，否则排半天队，叫你去复印，很麻烦的）和美金就可以了。（西联只可以汇美金）当然，你要让对方告诉你它的收款地点，和与他的身份证件相符的名字的正确拼法。地点有的国家要求很详细，有的国家，比如美国，只要具体到州就可以。当然，由于中国现在是外汇管制国家，不允许不受限制的汇出汇款，故一般以2000美元为限。如果是学费，境外援助等有证明的，可以要求西联公司给与授权。需要用美元缴纳手续费，由于速度较快，手续费较高。但不是以汇款金额作为费率的正比，当工作人员入机后，机器会自动反显手续费得金额。完成后，工作人员会返回你一联汇款单，上面有一个十位数的监控号，把它提供给收款人，提示收款就可以了。

西方的餐馆

处理western blot 照片和其他照片没什么不一样主要就是要把一些过深的背景去除掉，仅仅保留条带就可以了（千万不要伪造条带，学术造假很容易被查出来的）photoshop中有图像选项，其下拉菜单中有调整选项，由该选项可以拉出数个选项，其中一项是曲线，会出现一个对话框，该对话框的下部有三个并排的图标，分别表示将图像背景加深、适中、及变浅。将鼠标点击一下变浅的图标，再到图像的空白区域点一下就行了

west[英] [west][美] [wu025bst]n.西，西部，西方adj.在西方的；西部的；朝西的；（风）来自西面的adv.向西，朝西；自西方；向西方western[英] [u02c8westu0259n][美] [u02c8wu025bstu0259n]adj.西方的；欧美的n.西部电影，西部小说；西方人为你解答，敬请采纳，如果本题还有疑问请追问，Good luck!

能。根据查询中国科学网站得知，westerngard规则可以通过单值质控图进行简单的数据分析和显示，具有低的假失控或假报警概率(1%或更小)，且联合规则的假失控概率也很低，可以显示多批号的质控图。

Best Western是世界上最大的酒店品牌之一，拥有超过4000家酒店和度假村。该品牌在全球范围内拥有广泛的覆盖率，但是在美国是最受欢迎的。据统计，Best Western在美国有超过2000家酒店，遍布全国各地。其中最多的城市是拉斯维加斯，该城市拥有30多家Best Western酒店，这些酒店位于市中心、赌场区和机场附近。其次是洛杉矶，这个大城市拥有超过20家Best Western酒店，分布在市中心、好莱坞和圣塔莫妮卡等地。此外，纽约市、芝加哥和迈阿密等大城市也拥有不少Best Western酒店。总的来说，Best Western在美国的覆盖范围非常广泛，无论是商务旅行还是休闲旅行，都可以找到适合自己的酒店。

跑westernblot时电泳时的条带呈斜行原因很多主要可能是电泳凝胶配制时未搅拌均匀，造成条带未能直线跑完电泳凝胶中混入气泡，造成条带被挤压倾斜也可能是样品缓冲液有干扰，造成条带迁移率不统一另外上样量过大，被其他泳道挤压也有可能

Western Blot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。它是将电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。Western Blot的应用检测材料或药物对某个信号通路上蛋白靶点的影响：肝癌是最常见的原发性癌症之一，仍是全球第六大癌症相关死亡原因。多靶点药物，如索拉非尼(SOR)，是肝癌治疗的主要抑制剂；然而较差的水溶性、缺乏选择性和明显的耐药性，使其应用受到限制。上海理工大学李钰皓副教授研究团队用铋基介孔纳米材料(NBOF)负载SOR，然后用聚乙二醇和叶酸偶联物(P-FA)包覆，形成了NBOF@SOR-P-FA纳米载体体系。该系统通过将化疗和放射治疗相结合，实现了显著增强的抗癌效果。

变为west，南方。

膜上有蛋白缺损点，不用蛋白封蛋白缺损点容易出现非特异染色。也可用BSA封，效果并不比脱脂奶粉好。脱脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去封闭膜，避免标记抗体固定在膜上引起背景增高。

western转膜胶的方向是向上转移。Western转膜胶在使用时需要注意其转移方向，转移方向是从胶膜底部向上转移。原因是Western转膜胶的背面覆盖有一层底纸，用于保护胶膜和保持其粘性。在使用时，需要将底纸撕下，将Western转膜胶贴在待转印的蛋白质膜上，然后用适当的条件进行转印。转移过程中，蛋白质会被吸附在Western转膜胶上，并随着胶膜的剥离而转移到目标膜上。因此，转移的方向应该是从胶膜底部向上，以保证转印的效果和成功率。

做western条带老是出现反白可能的原因是化学发光是个耗能过程，局部能量消耗过大，导致能量不足，也就发不出光了，所以条带反白。降低一抗、二抗浓度，蛋白上样量也可以降低。

western读音：英 ["westu0259n]美 ["westu0259rn]。adj. 西方的；西洋的；西部的。n. 西方人；西部片；西部小说。How does Chinese chess differ from western chess?象棋和西洋棋有什么不同?I"d love to,but I don"t know much about Western music.我倒想去，但我对西洋音乐了解不多。用法：western的意思是“西方的,西部的,在西方的,在西部的”,指世界或一国之西,也可指某地属于或在西部,有时大写。western在句中主要用作定语,偶尔也可用作表语。western无比较级和最高级。western, west这两个词都可作“在西方的,西部的”解。其区别在于:west重点在于形容方位或指从西方来的; western则指从某一固定点看西方,也可指从某物、某地朝西方看。

I"m cold, I"m cold, I"m cold我好冷 我好冷 我好冷Yeah, yeah, yeahI got the right to put up a fight我本有权利去四处寻衅But not quite "cause you cut off my light但我不能 因为你带走了我的光芒But my sight is better tonight and I might但是今晚 我的视力出奇的好 也许我会在我今晚的梦中见到你，可是 你是怎么进入我的梦里的呢？See you in my nightmare, oh, how did you get there?在我的梦中见到你 哦 你到底是如何进入我的梦呢？"Cause we were once a fairytale but this is farewell也许是因为我们曾经如神话一般在一起 但是 现在 是时候后告别了I got my life and it"s my only one我有我的生活 我唯一的生活I got the night, I"m running from the sun我属于夜晚， 我逃避阳光So goodnight, I made it out the door那么 晚安吧 ，我把它拒之门外So goodnight, I made it out the doorSo goodnight, I made it out the doorSo goodnight, I made it out the doorAfter tonight there will be no return过了今晚 将无法回头After tonight I"m taking off on the road过了今晚，我将踏上旅途I"m taking off on the road我踏上了旅途And that you know你知道Tell every one that you know That I don"t love you no more告诉所有人 告诉他们 你知道 我再也不爱你了And that"s one thing that you know, that you know你也只是知道这一件事情罢了Okay, I"m back up on my grind好吧 我会远离那辛苦的工作You do, you and I"m just gone do mine你会吧， 就让你我远走高飞 You do you "cause I"m just gone be fine你会的，因为我会好好地Okay, I got you out my mind好吧 我会忘记你的The night is young, the drinks is cold淡淡的夜，冰冷的酒The stars is out, I"m ready to go星光闪烁，我已准备好了踏上旅途You always thought I was always wrong你总是认为我是错的Well, know you know唉 你知道的 你知道的Tell everybody, everybody that you knowTell everybody that you knowThat I don"t love you no moreAnd that"s one thing that you know, that you knowI got the right to put up a fightBut not quite "cause you cut off my lightBut my sight is better tonight and I mightSee you in my nightmare, oh but how did you get there"Cause we were once a fairytale but this is farewellBaby girl I"m finished宝贝，就这样吧I thought we were committed我本以为我们曾许下承诺I thought we were cementedI really thought we meant it我当初真的以为我们会携手到老But now we just repentin"但是 现在 我们却在And now we just resentin"The clouds is in my vision 我看到的只有阴霾Look how high I be gettin"瞧瞧我现在的样子And it"s all because of you这都是为了你Girl we through我们一起经历了风风雨雨You think your shit don"t stank你自以为了不起But you are Mrs. P. U.其实你一文不值And I don"t see you with me no more我再也不想再见到你Now tell everybody that you know, that you know告诉所有人 你知道 你了解That you knowTell everybody that you knowThat I don"t love you no moreAnd that"s one thing that you know, that you knowThat you knowTell everyone that you knowThat I don"t love you no moreAnd thats one thing that you know, that you knowYou think your shit don"t stank But you are Mrs. P. U这句话不太确定 去国外的网站查了半天还是不太懂 不好意思啊

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Two very different people Too scared to get along Till two hearts beat together Underneath one sun One very special momentCan turn a destiny And what some would sayCould never change Has changed for you and me "Cause it"s all in the way you look through your eyes And when all is said and done All of the fear and all of the lies are not hard to overcome It"s all in the way you look at it That makes you strong We were two (we were two) Now we are one We are two different people So much to overcome So why care for one another When there"s so much to be done "Cause sometimes it"s necessary Just look how far we"ve come You could say my friend that it"s the end Or a new tale has begun "Cause it"s all in the way you look through your eyes And when all is said and done All of the fear and all of the lies are not hard to overcome It"s all in the way you look at it That makes you strong We were two (we were two) Now we are one And one moment in the time Is all the time we need Just to make a difference To make it better for you and me If you just believe Oh yeah Just open your eyes "Cause its all in the way you look through your eyes And when all is said and done All of the fear and all of the lies are not hard to overcome It"s all in the way you look at it That makes you strong We were two (we were two) Now we are one Oh yeah, Oh yeah We were two Now we are one 完全不同的两个人 害怕相处的差异 直到两颗心相属 在温暖的阳光下 在这个特别的瞬间 可以改变命运 有人曾说 不可改变的事物 都已为你我而改变 都因你深情的双眼 所有的过去都已造成 所有的恐惧与所有的诺言 都不是难以克服 都在于你如何看待一切 这让你更加强壮 我们原来本是两人 现在我们是一体的 我们原来本是两个人 要克服的太多 无须在意别人 我们需要继续努力 有时我们必须 看看我们曾经克服的一切 我的好朋友 你可以说 一切已到了尽头 或者是说新的一页已经开始 真爱的时光 是我们最美的回忆 改变生命 为你我开创更好的未来 如果你深信 喔 张开你的双眼 喔 是的 我们原来是两个人 现在我们是一体的

Two very different people Too scared to get along Till two hearts beat together Underneath one sun One very special momentCan turn a destiny And what some would sayCould never change Has changed for you and me "Cause it"s all in the way you look through your eyes And when all is said and done All of the fear and all of the lies are not hard to overcome It"s all in the way you look at it That makes you strong We were two (we were two) Now we are one We are two different people So much to overcome So why care for one another When there"s so much to be done "Cause sometimes it"s necessary Just look how far we"ve come You could say my friend that it"s the end Or a new tale has begun "Cause it"s all in the way you look through your eyes And when all is said and done All of the fear and all of the lies are not hard to overcome It"s all in the way you look at it That makes you strong We were two (we were two) Now we are one And one moment in the time Is all the time we need Just to make a difference To make it better for you and me If you just believe Oh yeah Just open your eyes "Cause its all in the way you look through your eyes And when all is said and done All of the fear and all of the lies are not hard to overcome It"s all in the way you look at it That makes you strong We were two (we were two) Now we are one Oh yeah, Oh yeah We were two Now we are one 完全不同的两个人 害怕相处的差异 直到两颗心相属 在温暖的阳光下 在这个特别的瞬间 可以改变命运 有人曾说 不可改变的事物 都已为你我而改变 都因你深情的双眼 所有的过去都已造成 所有的恐惧与所有的诺言 都不是难以克服 都在于你如何看待一切 这让你更加强壮 我们原来本是两人 现在我们是一体的 我们原来本是两个人 要克服的太多 无须在意别人 我们需要继续努力 有时我们必须 看看我们曾经克服的一切 我的好朋友 你可以说 一切已到了尽头 或者是说新的一页已经开始 真爱的时光 是我们最美的回忆 改变生命 为你我开创更好的未来 如果你深信 喔 张开你的双眼 喔 是的 我们原来是两个人 现在我们是一体的

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你好 歌词如下:Westlife - Where We AreLrc by taTu @ 369 Lyrics Group ☆QQ:417288035Stay, stay where you areI don"t let me go, don"t let me goWe made it this farOh baby stop, stop right thereI don"t walk away, don"t walk awayInto thin air We survived a crashMade it through the wreckageStanding here at lastSo perfectly written Now where we areIs where we"re suppose to beWhere we are Keeps the breath in meWhere we"ve beenWe"ve risen from the deepWhere we"re now No one can tear us apartThat"s where we are Don"t, don"t turn aroundWe gotta let, we got to letGo of the past nowOh feel me by your sideWe"re out of dangerNo reason to hide We survived the stormMade it through the hurricaneStanding here at lastDry despite the rain And now where we areIs where we"re suppose to beWhere we are Keeps the breath in meWhere we"ve beenWe"ve risen from the deepWhere we"re now No one can tear us apartThat"s where we are That"s where we areStay, stay where you are Where we areIs where we"re suppose to beWhere we are Keeps the breath in meWhere we"ve beenWe"ve risen from the deepWhere we"re now No one can tear us apartThat"s where we are That"s where we are留，留你在哪里我不想让我走，不要让我走我们成功了这么远噢婴儿停止，停在那儿我不走开，不走开进入空气稀薄我们生存崩溃通过它的残骸终于站在这里如此完美的书面现在我们在哪里我们就是在假定为我们在哪里保持对我的呼吸我们一直在哪里我们已经增加，由深我们现在在哪里没有人能阿英这就是我们的不这样做，无法转身我们得让，我们应让过去转到现在哦觉得我就在身边我们正在脱离生命危险没有理由隐藏我们幸存下来的风暴通过它的飓风终于站在这里干冒雨现在我们在哪里我们就是在假定为我们在哪里保持对我的呼吸我们一直在哪里我们已经增加，由深我们现在在哪里没有人能阿英这就是我们的这就是我们的留，留你在哪里我们在哪里我们就是在假定为我们在哪里保持对我的呼吸我们一直在哪里我们已经增加，由深我们现在在哪里没有人能阿英这就是我们的这就是我们的

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As Long As You Love Me ?

which do you prefer western food or chinese food?why 翻译：你更喜欢西方食物还是中国的食物?为什么? 我的回答：I prefer chinese food China is very famous for its food in the world.In the north of China,people eat a lot of noodles and dumplings.In the south of China,people eat a lot of rice and seafood.Chinese food is good in color,flavor and taste.They are very delicious .So I like it very much. 翻译如下： 我更喜欢中国食物 中国的食物在世界上很出名.在中国的北方,人们吃大量的面条和饺子.在中国的南方,人吃了大量的大米和海鲜.中国食品的色、 香、 味俱全.他们非常可口.所以我很喜欢它. 科技英语强手团

Chinese food: noodles, milk, dumplings, tea Western food: hamburger, donut, French fries, pizza, milk

"Never Let Me Down"从不让我失望(feat. Jay-Z, J-Ivy)[Intro:]Yeah Grandmama是的奶~奶Told you I won"t let you down告诉过你我不会让你失望Told you I won"t let this rap game change me, right?告诉过你这个饶舌的游戏不会让我迷失，对吧？[Chorus:]When it comes to being true, at least true to me当他们成为现实时，最终会证明我是对的One thing I found,one thing I found我从中发现的就是，就是Oh no you"ll neva let me down,oh，不，你从不会让我失望Get up I get （down)我开始认真起来 X6Get up I get(down)Get up I get(down)Get up I get(down)Get up I get(down)Get up I get(down)[Jay-Z:]Yo, yo first I snatched the street then I snatched the charts,yo，yo我第一次占据这个街道后紧接着占据了排行榜First had they ear now I hav they"re heart,我的歌先吸引了他们现在他们成为我的死忠Rappers came and went,不知有多少饶舌歌手出现离开 I"ve been hear from the start,我已经从一开始就听到了Seen them put it togetherWatch them take it apart,看过他们的聚聚散散See the Rovers roll up wit ribbons看见被丝带缠绕的的Rover汽车I"ve seen them re-poed, re-sold and re-driven我已见到了他们的重组，重新出售，被重新推出So when I reload, he holds #1 position所以当我重新出发，他保持着第一的位置When u hot I"m hot你红我也红And when your feet cold, mines is sizzelin当你双足冰凉时我的还火热It"s plain to see而且显而易见Nigga"s can"t f*** wit me那哥们怎么比得上我Cuz ima be that nigga for life因为我就是我This is not an image这不是想象This is God given是毛主席给的This is hard liven Mixed wit crystal sipping生活在珠光宝气中真的很难保持的It"s the most consistent就是始终如一Hov对，就是我（jay-z的别名）Give you the most hits you can fit inside a whole disc and跟着我一起摇摆你也会享受我唱片的魅力Nigga I"m home on these charts, y"all niggaz visitin哥们我可是唱片榜的常客，而你们就是群过客It"s Hov tradition, Jeff Gordan of rap这是jay-z的惯例，Jeff Gordan 为我featI"m back to claim pole position, holla at ya boy现在我回来了，我宣布我就是rap界的中流砥柱，大声跟我喊出来！[Chorus][Kanye West:]I get down for my grandfather who took my momma我为养育母亲的外公深深鞠躬Made her sit that seat where white folks ain"t wanna us to eat他让我妈在被白人歧视的的餐馆找到座位坐下At the tender age of 6 she was arrested for the sit in年幼的6岁母亲就因此被逮捕With that in my blood I was born to be different就是这层血缘，我就是一个生来不平凡的人Now niggas can"t make it to ballots to choose leadership现在黑兄弟们不能参与投票选领导But we can make it to Jacob and to the dealership但我们能让Jacob代表我们行使权力That"s why I hear new music所以我才会有新创作And I just don"t be feeling it而我只是不觉得它是Racism still alive they just be concealing it种族偏见始终悄悄存在But I know they don"t want me in the damn club我知道他们觉得我想club里的苍蝇They even made me show I.D to get inside of Sam"s club他们甚至要求我出示身份证才能进Sam"s clubI did dirt and went to church to get my hands scrubbed我心灵纯洁常常去教堂擦洗双手Swear I"ve been baptised at least 3 or 4 times发誓我都受过了3到4次的洗礼But in the land where nigga"s praise Yukons and getting paid但在米国我们称赞下加拿大的育空省都会被罚款It gona take a lot more than coupons to get us saved他会发出很多优惠券来让我们得救Like it take a lot more than do-rags to get your waves就像吸食很多的K粉让你爽Noting sadder than that day my girl father past away没有比我女友父亲去世更伤心的日子了So I promised to Mr Rany I"m gonna marry your daughter所以岳父大人我答应你一定会娶你女儿的And u know I gotta thank u for the way that she was brought up你知道我好感激你培养出了如此佳人And I know that u were smiling when u see that car I bought her我也知道你看见我买给她的车时露出欣慰的微笑And u sent tears from heaven when u seen my car get balled up在天堂看见我出车祸为我担忧，我都知道But I can"t complaint what the accident did to my Left Eye但我不能抱怨这场车祸让我左眼受了多大的伤害Cuz look what a accident did to Left Eye因为看看这场车祸对左眼的伤害First Aaliyah and now romeove must die？Aaliyah飞机失事现在要移除我的左眼难道就要死？I know a got angels watching me from the other side我知道身边一直有天使的保佑[Chorus x2][J.Ivy:]We are all here for a reason on a particular path我们都是这里的道路上的一个特定的原因You don"t need a curriculum to know that you are part of the math你不需要学习才知道你在数学中是哪个部分Cats think I"m delirious, but I"m so damn serious爵士乐演奏者（美国俚语）认为我精神混乱，其实我是很严肃对待音乐（KW之前有很多歌采样的jazz作为rap，引起很多人不满，个人意见）That"s why I expose my soul to the globe, the world所以我才敢将自己的内心向世界展现I"m trying to make it better for these little boys and girls为了支持我的粉丝们我一直努力着I"m not just another individual, my spirit is a part of this我从来不是一个孤体，我的精神和粉丝们长在That"s why I get spiritual, but I get my hymns from Him所以为何我如此充满热情，但我的圣歌来自于“他”So it"s not me, it"s He that"s lyrical所以这不是我，这是“他”的热情I"m not a miracle, I"m a heaven-sent instrument我不是奇迹只是上天派来的乐器My rhythmatic regimen navigates melodic notes for your soul and your mental我的旋律引领你的身心走向正道That"s why I"m instrumental这就是我这个乐器的作用Vibrations is what I"m into让你们和我共鸣Yeah, I need my loot by rent day是的，我需要抢劫赚钱来租用每一天But that is not what gives me the heart of Kunte Kinte但这不是给我Kunte Kinte的思想I"m tryina give us "us free" like Cinque我尝试着像Cinque一样给大家“我们自由”的歌曲I can"t stop, that"s why I"m hot我不能停止创造，所以我一直红着Determination, dedication, motivation决心，奉献精神，积极性一个也不能少I"m talking to you, my many inspirations我在告诉你们，我的精神支柱们When I say I can"t, let you or self down当我说“我不行”，就会让你们和自己失望If I were of the highest cliff, on the highest riff如果我站在最高的悬崖边And you slipped off the side and clinched on to your life in my grip当你不告而别，我也会紧紧抓牢你的人生I would never, ever let you down我不会，绝不让你失望And when these words are found当这些文字被发现时Let it been known that God"s penmanship has been signed with a language called love让大家知道上帝已经同意了爱的语言That"s why my breath is felt by the deaf这就是为什么我的呼吸能被聋子感觉到And why my words are heard and confined to the ears of the blind也是为什么我的文字能被盲人感受到I, too, dream in color and in rhyme我也是，我的梦想是彩色的押韵诗So I guess I"m one of a kind in a full house所以我猜我是浪漫满屋的一员Cuz whenever I open my heart, my soul, or my mouth因为无论何时我敞开心扉，倾诉灵魂，张开嘴A touch of God reigns out能感到上帝的统治[Chorus][Jay-Z (Kanye West)]Who else you know been hot this long,无论谁你知道已经红了很久(Oh Ya, you know we ain"t finished)（是的，你知道咱们是常青树）Started from nothing but he got this strong,刚开始的一无所有但他现在很茁壮(The ROC is in the building)（Roc-A-Fella来了！（jay-z的厂牌））Built the ROC from a pebble, pedalled rock before I met you,将Roc王朝从小卵石，在我遇见你之前将它踏响Pedalled bikes, got my nephews pedal bikes because they special,有踏板的自行车，让我侄子有这自行车因为他们很特别Let you tell that man I"m falling,让我告诉你兄弟我在坠落中Well somebody must"ve caught him,那么肯定有人会抓牢他Cause every fourth quarter, I like to Mike Jordan "em,因为每第四个四分之一，我喜欢MJ他们Number one albums, what I got like four of dem,第一张专辑，我受到4个谴责More of dem on the way,音乐之路受到了更多的谴责The Eight Wonder on the way,这个EW还在路上Clear the way, I"m here to stay,一路清晰，我还呆在这儿Y"all can save the chitter chat, this and that, this and Jay,你们都能节约闲聊时间，这和那，这和jay-zDissin" Jay "ill get you mased,亲爱的jay-z会让你们痴迷的发狂When I start spitting them lyrics, niggas get very religious,让我开始说唱时，兄弟们会变得很认真Six Hail Maries, please Father forgive us,Six Hail Maries（无法翻译），神父请原谅我Young, the Archbishop, the Pope John Paul of y"all niggas,年轻人们，这个大主教，Pope John Paul，都是咱们黑哥们哦~The way y"all all follow Jigga,我们跟着jay-z走（Jigga也是jay-z别名）Hov"s a living legend and I tell you why,jay-z正走向传奇之路，让我告诉你原因Everybody wanna be Hov and Hov still alive.人人都爱jay-z，jay-z万岁！[Thanks to freestile_kween@blackplanet.com, ishotjfk19@hotmail.com, urban_girl_1@hotmail.com, tdoyle@clunet.edu for correcting these lyrics] translate by：fy400051尽力了，有地方确实自己都不满意

country road 吧

一个是西弗吉尼亚州 一个是弗吉尼亚州

　　PERFORMER "Westlife"　　TITLE "Turnaround"　　FILE "[APE]Westlife《Turnaround》.ape" WAVE　　TRACK 01 AUDIO　　TITLE "Mandy"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 01 00:00:00　　TRACK 02 AUDIO　　TITLE "Hey Whatever"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 03:18:57　　INDEX 01 03:20:33　　TRACK 03 AUDIO　　TITLE "Heal"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 06:48:71　　INDEX 01 06:50:47　　TRACK 04 AUDIO　　TITLE "Obvious"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 09:57:12　　INDEX 01 09:58:63　　TRACK 05 AUDIO　　TITLE "When A Woman Loves A Man"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 13:28:36　　INDEX 01 13:30:12　　TRACK 06 AUDIO　　TITLE "On My Shoulder"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 17:07:48　　INDEX 01 17:09:24　　TRACK 07 AUDIO　　TITLE "Turn Around"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 21:05:62　　INDEX 01 21:07:38　　TRACK 08 AUDIO　　TITLE "I Did It For You"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 25:28:55　　INDEX 01 25:30:31　　TRACK 09 AUDIO　　TITLE "Thank You"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 29:00:29　　INDEX 01 29:02:05　　TRACK 10 AUDIO　　TITLE "To Be With You"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 33:04:17　　INDEX 01 33:05:67　　TRACK 11 AUDIO　　TITLE "Home"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 36:25:62　　INDEX 01 36:27:38　　TRACK 12 AUDIO　　TITLE "What Do They Know?"　　PERFORMER "Westlife"　　INDEX 00 40:32:03　　INDEX 01 40:33:54

leaving 是Westlife 在专辑Where We Are中的一首歌，听起来很催泪。我是西米啊

他们翻得太诗意，我来个具体点的版本吧，希望你喜欢Watching the clock on the wall看着墙上的时钟Been a while since you called还无法从你的电话中回神I can"t help but wait而我只能在此等待It"s late and I can"t get no sleep虽然夜已深，依然无法入眠Something"s different this time我能感觉你的语气与以往不同了It just doesn"t feel right我是在无法释怀Have we broken in two?难道我们真的要分开？Am I really gonna lose you tonight?今夜 我就要失去你了吗？You come walking in你轻轻推门而入Tears in your eyes泪水在你眼眶打转Pretending like it"s alright努力装作若无其事 But I know you"re leaving但我知道你将离开I know that smile我知道你牵强的笑容I can tell you"ve been crying我知道你哭过You"re gonna say goodbye“再见”二字即将脱口而出I wish I could stop you我多么希望能使你回心转意But you"ve made up your mind 但是你别心已决I beg you don"t go只能哀求挽你不要走But I already know you"re leaving但是，我知道哀求没有用Where does the time go?时间流往何方？Between goodbye and hello在离别和重逢之间How did we come to this 我们怎么会走到这个地步Is there something we missed along the way还是一路上我们错过了什么With your bags at the door你的行李躺在门口I wanna pull you in close 多想拥你入怀And hold you once more even though 用尽力气抱住你But I know you"re leaving但我知道你将离开I know that smile我知道你牵强的笑容I can tell you"ve been crying我知道你哭过You"re gonna say goodbye“再见”二字即将脱口而出I wish I could stop you我多么希望能使你回心转意But you"ve made up your mind 但是你别心已决I beg you don"t go只能哀求挽你不要走But I already know you"re leaving但是，我知道哀求没有用Here come the sleepless nights你走后只有不眠的夜Here come the tears I"m gonna cry你走后只有无尽的泪Here comes the last goodbye leaving us behind只是记得那句再见Oh this can"t be right我无所适从But I know you"re leaving但我知道你将离开I know that smile我知道你牵强的笑容I can tell you"ve been crying我知道你哭过You"re gonna say goodbye“再见”二字即将脱口而出I wish I could stop you我多么希望能使你回心转意But you"ve made up your mind 但是你别心已决I beg you don"t go只能哀求挽你不要走But I already know you"re leaving但是，我知道哀求没有用

歌曲名:Leaving歌手:Westlife专辑:Where We AreLeavingWestlifeWatching the clock on the wallBeen a while since you calledI can"t help but waitIt"s late and I can"t get no sleepSomething"s different this timeIt just doesn"t feel rightHave we broken in two?Am I really gonna lose you tonight?You come walking inTears in your eyesPretending like it"s alrightBut I know you"re leavingI know that smileI can tell you"ve been cryingYou"re gonna say goodbyeI wish I could stop youBut you"ve made up your mindI beg you don"t goBut I already knowYou"re leavingWhere does the time go?Between goodbye and helloHow did we come to thisIs there something we missed along the wayWith your bags at the doorI wanna pull you in closeAnd hold you once more even thoughI know you"re leavingI know that smileI can tell you"ve been cryingYou"re gonna say goodbyeI wish I could stop youBut you"ve made up your mindI beg you don"t goBut I already knowI know you"re leavingHere come the sleepless nightsHere come the tears I"m gonna cryHere comes the last goodbye leaving us behindOh this can"t be rightI know you"re leavingI know that smileI can tell you"ve been cryingYou"re gonna say goodbyeI wish I could stop youBut you"ve made up your mindI beg you don"t goBut I already knowI know you"re leavinghttp://music.baidu.com/song/540782

Westlife - Leaving 　　Watching the clock on the wall 透过黑暗，我看着墙上走动的时钟 　　Been a while since you called 自从搁下电话，沉默一直延续 　　I can"t help but wait 我不得不继续等待，等待你的回应 　　It"s late and I can"t get no sleep 直到深夜，我依然无法入眠 　　Something"s different this time 这一回，我们之间变得微妙 　　It just doesn"t feel right 我只是感觉，爱已经破裂 　　Have we broken in two? 这一次，我们真的要隔岸天涯吗？ 　　Am I really gonna lose you tonight? 这一夜，我真的就要这样失去你吗？ 　　You come walking in 你一步步靠近了我 　　Tears in your eyes 你的眼中，充满了泪水 　　Pretending like it"s alright 却还在努力掩饰，好像一切都不曾发生过一样 　　But I know you"re leaving 但我知道，你选择了离开 　　I know that smile 我理解了你努力一笑的心情 　　I can tell you"ve been crying 我可以读懂，那掩藏不住的泪水 　　You"re gonna say goodbye 因为我们，将要说“再见” 　　I wish I could stop you 我只是希望，我能停下你离开的脚步 　　But you"ve made up your mind 但你决心已定 　　I beg you don"t go 我只想求你不要离开 　　But I already know 可我早已明白 　　You"re leaving 你已经离开 　　Where does the time go? 记忆里相处的日子，被我们埋藏在哪里？ 　　Between goodbye and hello 为什么我只记得，相遇与再见的瞬间 　　How did we come to this 我们怎么会走到今天这步？ 　　Is there something we missed along the way 　　是不是因为，在爱的路上，我们迷失了彼此？ 　　With your bags at the door 你的行李依旧在门边 　　I wanna pull you in close 可这个时候，我只想靠近你 　　And hold you once more even though 然后，再次抱紧你，即使你会转身 　　I know you"re leaving 不过，我知道，你即将离开 　　I know that smile 我读懂了你浅浅一笑的心情 　　I can tell you"ve been crying 我会明白，你曾流下的泪水 　　You"re gonna say goodbye 因为，你将要面对我离开 　　I wish I could stop you 我祈求上天给我一个机会 　　But you"ve made up your mind 但你的决心是那么坚定 　　I beg you don"t go 我想请求你，不要就这样离去 　　But I already know 但我早已深深明白 　　I know you"re leaving 你的心已经不再回来 　　Here come the sleepless nights 你走后的每个夜里，失眠每每光顾 　　Here come the tears I"m gonna cry 你走后的每个日子，泪水每每袭来 　　Here comes the last goodbye leaving us behind 　　你走后，只剩再见，成我们最后的句点 　　Oh this can"t be right 求你，我们不能就这样 　　I know you"re leaving 我却知道，你的心早已不再 　　I know that smile 我也能体会，你最后一笑时的心情 　　I can tell you"ve been crying 你心碎的泪水，在努力诠释 　　You"re gonna say goodbye 我们之间，只能说句“再见” 　　I wish I could stop you 我依旧想拉住你的手 　　But you"ve made up your mind 但，你其实早就下了决心 　　I beg you don"t go 我还在梦想着你再次的停留 　　But I already know 但我，真的已经明白一切 　　I know you"re leaving 我知道，你已经转身离开

歌曲名:Ego歌手:Beyonce Featuring Kanye West专辑:I Am...Sasha Fierce - Platinum EditionBeyoncé - EgoHey baby how you doing?You know Im gonna cut right to the chaseSome women were madeBut me, myselfI like to think I was createdFor a special purposeYou know, whats more special than you, you feel me?Its on, baby lets get lostYou dont need to call into work, cuz youre the bossFor real want you to show me how you feelI consider myself lucky thats a big dealWhy, well, you got the key to my heartBut you aint gonna need itId rather you open up my bodyAnd show me secretsYou didnt know was inside,No need for me to lieIts too bigIts too wideIts too strongIt wont fitIts too muchIts too toughHe talks like thisCuz he can back it upHe got a big egoSuch a huge egoI love his big egoIts too muchHe walks like thisCuz he can back it upUsually Im humbleRight now I dont chooseYou can leave with meOr you could have the bluesSome call it arrogantI call it confidantYou decide when you findOn what Im working withDamn I know, Im killing you with them legsBetter yet them thighsMatter a fact its my smileOr maybe my eyesBoy you a site to seeKind of something like meIts too bigIts too wideIts too strongIt wont fitIts too muchIts too toughI talk like thisCuz I can back it upI got a big egoSuch a huge egoBut he love my big egoIts too muchI walk like thisCuz I can back it upI, I walk like thisCuz I can back it upI, I talk like thisCuz I can back it upI, I can back it upI can back it upI walk like thisCuz I can back it upIts too bigIts too wideIts too strongIt wont fitIts too muchIts too toughHe talks like thisCuz he can back it upHe got a big egoSuch a huge egoI love his big egoIts too muchHe walks like thisCuz he can back it upEgo so bigYou must admitI got every reason to feel like Im that bitchEgo so strong, if you aint knowI dont need no beat, I can sing it with pianohttp://music.baidu.com/song/8853241

歌曲名:Heartless歌手:Kanye West专辑:my story (live)Kanye West - HeartlessIn the night, I hear them talkThe coldest story ever toldSomewhere far along this road, he lost his soulTo a woman so heartlessHow could you be so heartless? OhHow could you be so heartless?How could you be soCold as the winter wind, when it breeze yo?Just remember that you talkin to me hoeYou need to watch the way you talkin to me hoeI mean after all the things that we"ve been throughI mean after all the things we got intoAyo I know there"s some things that you aint told meAyo I did some things but that"s the old meAnd now you wanna get me back and you gonna show meSo you walk around like you don"t know meYou got a new friend, but I got homiesBut in the end, still so lonelyIn the night, I hear them talkThe coldest story ever toldSomewhere far along this road, he lost his soulTo a woman so heartlessHow could you be so heartless? OhHow could you be so heartless?How could you be so doctor evil?You bring out a side of me that I don"t knowI decided we weren"t gonna speak soWhy we up 3am on the phoneWhy would you be so mad at me forHomie I don"t know, she"s hot and coldI won"t stop, won"t mess my groove upCause I already know how this thing goesYou run and tell your friends that you leavin meThey said they don"t see what you see in meYou wait a couple months, then you gonna seeYou never find nobody better than meIn the night, I hear them talkThe coldest story ever toldSomewhere far along this road, he lost his soulTo a woman so heartlessHow could you be so heartless? OhHow could you be so heartless?Talkin, talkin, talkin, talkBaby let"s just knock it offThey don"t know what we"ve been throughThey don"t know about me and youSo I got something new to seeAnd you just gonna keep hatin" meAnd we just gonna be enemiesI know you can"t believeI could just leave it wrongAnd you can"t make it rightI"m gonna take off tonightInto the nightIn the night, I hear them talkThe coldest story ever toldSomewhere far along this road, he lost his soulTo a woman so heartlessHow could you be so heartless? OhHow could you be so heartless?http://music.baidu.com/song/28685635

歌曲名:Heartless歌手:Kanye West专辑:R&B Love Songs 2010Kanye West - HeartlessIn the night, I hear them talkThe coldest story ever toldSomewhere far along this road, he lost his soulTo a woman so heartlessHow could you be so heartless? OhHow could you be so heartless?How could you be soCold as the winter wind, when it breeze yo?Just remember that you talkin to me hoeYou need to watch the way you talkin to me hoeI mean after all the things that we"ve been throughI mean after all the things we got intoAyo I know there"s some things that you aint told meAyo I did some things but that"s the old meAnd now you wanna get me back and you gonna show meSo you walk around like you don"t know meYou got a new friend, but I got homiesBut in the end, still so lonelyIn the night, I hear them talkThe coldest story ever toldSomewhere far along this road, he lost his soulTo a woman so heartlessHow could you be so heartless? OhHow could you be so heartless?How could you be so doctor evil?You bring out a side of me that I don"t knowI decided we weren"t gonna speak soWhy we up 3am on the phoneWhy would you be so mad at me forHomie I don"t know, she"s hot and coldI won"t stop, won"t mess my groove upCause I already know how this thing goesYou run and tell your friends that you leavin meThey said they don"t see what you see in meYou wait a couple months, then you gonna seeYou never find nobody better than meIn the night, I hear them talkThe coldest story ever toldSomewhere far along this road, he lost his soulTo a woman so heartlessHow could you be so heartless? OhHow could you be so heartless?Talkin, talkin, talkin, talkBaby let"s just knock it offThey don"t know what we"ve been throughThey don"t know about me and youSo I got something new to seeAnd you just gonna keep hatin" meAnd we just gonna be enemiesI know you can"t believeI could just leave it wrongAnd you can"t make it rightI"m gonna take off tonightInto the nightIn the night, I hear them talkThe coldest story ever toldSomewhere far along this road, he lost his soulTo a woman so heartlessHow could you be so heartless? OhHow could you be so heartless?http://music.baidu.com/song/59318088

L/C:信用证付款;D/A:承兑交单;D/P:见单付款;T/T:电汇;下面两个具体就不清楚了,应该不是付款方式.

Western Union是西联汇款，MoneyGram是速汇金。都是国际汇款服务商，区别在于西联汇款支持网点较多、手续费稍高，但是可以在线查看汇款状态；速汇金不能在线查看汇款状态，网上查询合作银行网点也不方便（都是英文）。其实区别不大，到账速度都很快，基本是即时到账。纯手工，望采纳。

需要自己制作支付插件。如果westernunion和moneygram和银行汇款一样，那么把那个插件改造一下就可以了

西部数据，硬盘品牌，还可以

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How Dose It Feel How Does It Feel你的感觉 True lovers never take it slowly真正的恋人总是迟疑不决 When they"ve found the one and only 当他们找到唯一的真爱 Nothing can replace this feeling没有事物能够取代这种感觉 Knowing someone loves you那种知道有人爱你的感觉 It"s painted with the pain and glory它以痛苦与荣光绘制而成 Taking from a known sad story取材于古老悲伤的故事 Laying out my life before me在我面前展示我的一生 Fearing the unknown害怕未知的事物 Sharing never showed me much appeal而分享从未吸引过我 And now I"m only praying it"s for real但是如今我却真心的祈祷 So how does it feel 所以你有什么感觉 When I hold you in my arms当我拥你入怀 And you"re lying next to me 当你躺在我身边 Never wanting you to leave 我不想让你离开 Until I"ll tell you how it feels直到我告诉你 To be cradled like my dreams我如梦境般被抚慰 And to know that you love me被你所爱的感觉 No more wasting time in asking other people不愿再浪费时间询问别人 How does it feel你的感觉如何 How does it feel你的感觉究竟如何 Forever taken you for granted我不曾视你为理所当然 You give me everything I wanted 你给了我想要的一切 I"m so afraid that I might lose you我好害怕失去你 But time will let us see但是时间会让我们看见 If everything is real I"m feeling如果我的感觉属实 Well maybe we"ve been only dreaming或者我们只是做梦 And if it"s gonna die to save it如果它必须付出生命来维护 Cos baby I believe因为宝贝我相信 Nothing in the world could make it right世上没有什么可以做对 Cos baby loving you brings me to life因为宝贝爱你使我获得重生 Woah, woah, woah喔，喔，喔 Nothing in the world could feel this right世界上再没有东西使我感觉如此美好 Cos baby you"re the best thing in my life因为宝贝你是我生命中最好的礼物 How does it feel你的感觉如何 When I hold you in my arms当我拥你入怀 And you"re lying next to me 当你躺在我身边 Never wanting you to leave 我不想让你离开 Until I"ll tell you how it feels直到我告诉你 To be cradled like my dreams我如梦境般被抚慰 And to know that you love me被你所爱的感觉 No more wasting time in asking other people不愿再浪费时间询问别人 How does it feel你的感觉如何

How Does It Feel 打印此页 歌手：Westlife 专辑：Unbreakable Vol 1 Greatest Hits Westlife - How Does It Feel[Shane：]True lovers never take it slowlyWhen they"ve found the one and onlyNothing can replace this feelingKnowing someone loves youIt"s painted with the pain and gloryTaking from a known sad storyLaying out my life before meFearing the unknownSharing never showed me much appealAnd now I"m only praying it"s for real[All：]So how does it feel When I hold you in my armsAnd you"re lying next to me Never wanting you to leave Until I"ll tell you how it feelsTo be cradled like my dreamsAnd to know that you love meNo more wasting time in asking other peopleHow does it feel[Shane：]How does it feel[Bryan：]Forever taken you for grantedYou give me everything I wanted I"m so afraid that I might lose youBut time will let us seeIf everything is real I"m feelingWell maybe we"ve been only dreamingAnd if it"s gonna die to save itCos baby I believeNothing in the world could make it rightCos baby loving you brings me to life[Bryan：]Woah, woah, woah[Shane：]Nothing in the world could feel this rightCos baby you"re the best thing in my life[All：]How does it feel When I hold you in my armsAnd you"re lying next to me Never wanting you to leave Until I"ll tell you how it feelsTo be cradled like my dreamsAnd to know that you love meNo more wasting time in asking other people[Shane：]How does it feelEND不难翻译，但是不想翻译，英语原版很精彩，翻译是多余

According to a Reuters reporter, West was aggrieved that Radiohead singer Thom Yorke had allegedly snubbed him backstage at the Grammys five days earlier. That hurt, West told the audience, because he idolizes the British band, and considers it one of his few creative rivals."So when he performed at the Grammys, I sat the f--- down," West said我也是刚刚GOOGLE到的 还真不知道他们之间还有这档子事儿 不过遥想当年EMINEM跟ELTON JOHN也曾由互相看不顺眼最后发展成GRAMMY同台飙歌末了痞子还用了首老JOHN的名歌做自己一首歌的歌名 所以 接着看热闹就是大致翻译过来就是这个意思 据传在今年格莱美的后台Radiohead的主唱Thom Yorke说了Kanye的坏话 这让Kanye觉得很受伤害 因为他一直把rh“当做自己的偶像来看” 并觉得那是“少数几个他承认的竞争对手” 所以觉得很不爽的Kanye就在Thom和Johnny演出时一屁股坐下来冷冰冰的看着了 然后几天后Kanye在录制<Storytellers>的时候便对Radiohead进行了反击 大致就是这样

During a depression in the East, jobless men asked what they could do to support themselves. Said Greeley: "Go West, young man, go West!"

国外的DEBIT CARD要是带有visa或者mastercard 等国际通用标示的，可以在带有同样标示的各个银行atm机子上就可以取款。但是有的卡上有信用卡帐户，一定不要用那个帐户，因为取不出来，要用选项里面的活期帐户。取款是人民币。1.输入网址 myhappipay.com 进入MyHappiPay网站。2.注册，输入个人资料。3.成功开通MyHappipay Card进入网站，登入账户ID和密码。4.选择要记名卡或不记名卡。5.使用此卡于各种国内外消费，如欲充值，请登入个人账户进行操作。

这是英语。 意思是 西方人