反转录合成的目的基因是否含“内含子”?

你按照买的反转录试剂盒来做就行.
（1）、从细胞中提取细胞总RNA
用GIBCO公司的Trizol试剂提取细胞总RNA.按试剂使用说明操作:离心收集细胞,倾去细胞液,向沉淀中加1 ml Trizo1(每106-107细胞),混匀至室温5分钟,用1 ml加样器反复吹打,直至细胞完全裂解成均一溶液,不粘稠时为止.随后加入200ul氯仿,剧烈振荡15秒钟,室温放置5分钟,然后,4 0C ,12000rpm离心5分钟,将上层水相转移至一Eppendorf管中,加入500ul异丙醇后混匀.4 0C , 1 5000rpm离心15分钟,倾出异丙醇.用70%乙醇洗涤沉淀一次,置冰上,让残余乙醇挥发殆尽.溶于适量的DEPC水中,紫外分光仪测定RNA的纯度及含量,分装冻存于一700C保存.
（2）、反转录成cDNA第一链(参照产品说明)
在20ul体系中,加入1ug总RNA, 1 ul oligo dT12_l8 ( 500ug/ml ). RNase-Free水,70 0C温育10分钟后立即冰浴冷却,继续加入4ul 5 x Buffer, 2ul 0.1 M DTT, 1ul IOMm dNTPs ( IOMm/种),混匀后于42℃保温2分钟,加入1ul( 200U)的反转录酶,42℃继续温育50分钟.700C 15分钟灭活反转录酶.
（3）、 引物设计
(4)过程: 以1ulcDNA为模板,在50ul体系中含有Taq酶为2单位,dNTPs浓度为200uM,引物各为0.2uM.扩增22个循环.取8ul电泳.

情况比较复杂,你得确认1.你的RNA没问题,没有被降解,cDNA合成没问题.可以用该材料的actin引物做PCR检测试试.2你P的基因如果是已知序列,那么设计引物应该很简单,如果是未知的,那么兼并引物没P出东西来是有可能的.若是根据已知序列设计的引物而没有P出产物那就是你PCR体系或者Tm有问题了,试试TOUCHDOWN程序.若是兼并引物,采用touchdown程序,没有P出来的话,要么是引物不行,要么是你的材料取材时间不对,你要扩增的基因没有表达出来.问题比较多,一个一个排除,确保你实验的科学性.祝实验成功.

理论应该用CDNA进行因为设计,但要保证你提取的mRNA的质量,尽量减少降解.可以在原序列基础上先写出互补序列再进行引物设计.

解题思路：本题是考查DNA分子的复制．DNA分子是由两条脱氧核苷酸链组成的规则的双螺旋结构，磷酸与脱氧核糖交替排列分布在外侧构成基本骨架，碱基排列在内侧，通过氢键连接成碱基对排列在内侧碱基对之间的连接遵循碱基互补配对原则，A与T配对，G与C配对．DNA的复制方式为半保留复制．

mRNA 含有a个碱基，其中C、G 之和为b，则1个DNA 分子中碱基总数为2a，G+C=2b，每个DNA分子中含有碱基T=[2a−2b/2]=a-b，故合成n个双链DNA 分子需要n（a-b）个胸腺嘧啶脱氧核苷酸．
故选：D．

点评：
本题考点： DNA分子结构的主要特点．

考点点评： 本题的知识点是根据DNA分子的复制，根据碱基互补配对原则进行简单的碱基计算．对碱基互补配对原则的理解是解题的关键．

询问卖试剂盒的公司 效果比较好.其次是查文献和上论坛提问 同种材料 同种试剂盒 别人做过的 可比性较高.如果是直接说明针对某种样品 说明了取多大样品量的 往往就是取样了一路按说明做.成功与否与样品本身和试剂盒质量有关.如果是已经提了RNA的,只反转录 若试剂盒上说明了可收拾的模板的量的范围的 取其内的一个值 除以浓度（ 溶解提取的RNA后 比色法测定 用核酸蛋白微量测定仪 或者紫外分光光度计 记录od值 换算出以微克每毫升表示的浓度值 这一步也得到衡量提取物的品质的od值比 一般要求在一个范围之中 才认为后续使用比较保险 说不定还需纯化或 直接要重提以保质保量的） 计算好取样的体积 取了上样 使用试剂盒转录.

逆转录和反转录一样的意思,反转录其实分为两步,以RNA为模板合成第一链cDNA,然后用核酸酶消化RNA-DNA中的部分RNA,之后以RNA为引物合成cDNA第二条链

反转录是指从RNA转录为DNA,但是分两步,因为rna是单链的,所以第一步得到是是单链DNA,而第二步则是以上步合成的单链DNA为模板,合成双链DNA.前一步就是一链反转录,而第二步叫做cdna双链的合成!

重复一遍再来发帖.自己先尽量剔除操作失误别人才能更好的帮你.x0d1.PCR一个亮一个不亮,如果每次都这样,那说明模板量少,或是目标条带短（条带短自然结合EB少）.其他像扩增效率,试剂污染等因素概率比较少.x0d2,没产物：一来引物有没有问题,二,模板有没有问题,三,你的PCR条件是否合适你的引物.
打字不易,

非定量,所以你大可不必什么都计算准确.建议参考文献上Oligo dT的使用量,如果RNA加得少,你就用2ulOligo dT,20ul体系.

那只能说是你手法问题了.这种细胞系RNA很好提的 别用试剂盒了 买个TRIZOL直接提吧 6孔板的一个孔就够了

两种反转录的方法,一种是用oligoT作为引物,把所有的mRNA都反转录了,这个应该是有用的.另一种方法,是用特异性的引物去反转录,这个的话,你要看这种基因的转录后剪切有没有把最后一个外显子切掉的情况,如果没有的话,也是可以用Reverse primer去反转录的.
mRNA的选择方面,只要你提取mRNA的细胞是有这种基因表达,且存在可变剪切的机制,这样提取的mRNA就可以做下一步实验的.

影响不大,不用考虑.TRIZOL等常用方法提出来的总RNA都有一些蛋白质污染.

DNA啊!PCR是以脱氧核糖核苷酸为原料的 而MRNA的组成是核糖核苷酸 原料都不同
而且PCR技术的原理是利用DNA双链的原理.以MRNA为原料会得到双链的RNA

答：反转录称逆转录,它是指某些病毒由mRNA逆转录成DNA的过程.如果HIV病毒（艾滋病毒）就是由RNA逆转录成DNA,又由DNA转录成RNA,进而指导蛋白质的合成.

第一次70度水浴5min为让RNA二级结构打开,便于引物结合.
第一次冰浴1min为了退火,让引物能够结合RNA.
37度水域是让cDNA聚合.
第二次70℃水浴是再变性,让引物脱离模板RNA和cDNA第一链.
第二次冰浴是为了让cDNA-RNA复性成为cDNA-RNA杂合双链.
明白没有?

建议你先找一现成的DNA模板及相应的引物,然后做PCR,如果做出来了说明PCR体系没有问题.那问题就可能是出在反转录上了,RNA提取好之后可以跑个电泳或者检测OD值,以确认RNA提取是否成功.另外,检查是否用错反转录引物?针对不同的RNA样本类型要使用不用的反转录引物,病毒细菌之类的用随机引物作反转录引物,动植物RNA用OligodT（我们实验室用17个T的引物）作为反转录引物.

一样的,逆转录更标准,建议用后者.（以教科书为准）

好像是总RNA提取后,蛋白质都抽提出去了,应该含有rRNA~你可以看看相关的文献~

北京基诺莱普实时荧光定量PCR检测专家.
普通的RT反应跟QPCR的RT反应是一样的,没有区别,只要你在后续试验中加入含SYBR的MIX就可以了.

根据书上的内容 拣主要的写 联立成笔记 就可以了

我不知道你的题目环境是怎么样.是不是一条,还是多条,如PCR会有多条
保险点答 单链cDNA

RNA有可能再转录之后再修饰,可能会去掉一部分DNA再连起来,这时候得到的cDNA就和基因组上的cDNA有区别,突变要是发生在这部分（是不是外显子我还真不知道,好像还就不是）你提取逆转录的cDNA就没用呗