考马斯亮蓝测蛋白时 考马斯亮蓝主要与蛋白质中的碱性氨基酸结合 那么考马斯亮蓝会与游离的碱性氨基酸结合吗

台盼兰染色,死细胞蓝色,活细胞无色

目的是让溶液中的蛋白质和考马斯亮蓝进行充分的反应，使你的测定更加准确
《复旦生命学院》为您解答，希望您能采纳

几种可能
1.作标准曲线的时候,标准蛋白样品的浓度不准,或是加入试剂的量有偏差,结果标准曲线的零点吸光度都比你待测的高.
2.每种蛋白定量法都有自己的试用范围,如果你的蛋白样品含去垢剂或盐浓度偏高,就会影响结果准确性.
3.你的蛋白浓度太低,落到了标准曲线的线性范围之外.

双缩脲反应
蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用形成紫蓝色络合物的呈色反应.在540nm 波长处有最大吸收.可用于蛋白质的定性和定量检测.
是肽和蛋白质所特有的,而为氨基酸所没有的一种颜色反应.一般分子中含有两个氨基甲酪基（即肽键：-CO-NH-）的化合物,就会形成紫色或蓝紫色络合物.除-CO-NH-有此反应外,（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应.
茚三酮反应
茚三酮与氨基酸、肽类或蛋白质的自由α氨基或其他氨基化合物所产生的一种可定量的显色反应.所呈现的颜色随反应的条件(酸度、温度、盐浓度、铜、镉离子等)不同而异.用于氨基酸和肽的层析及定量测定.
反应十分灵敏,根据反应所生成的蓝紫色的深浅,在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量,也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析.
主要是定性分析.
考马斯亮蓝反应
属于三苯甲烷类染料,可与蛋白质形成较强的非共价复合体,可用于蛋白质的定量测定.用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不适用于小分子碱性多肽的定量.

可溶性蛋白质含量的测定
——考马斯亮蓝法
一、原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种.考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收.其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定.蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定.该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法.
二、材料、主要仪器和试剂
1、实验材料：植物叶片.
2、主要仪器
（1）分析天平、台式天平；（2）刻度吸管；（3）具塞试管、试管架；（4）研钵；（5）离心机、离心管；（6）烧杯、量筒；（7）微量取样器；（8）分光光度计.
3、试剂
（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白,溶于100mL蒸馏水中,即为1000μg／mL的原液.
（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90％乙醇中,加入85％（W／V）的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL.此溶液在常温下可放置1个月.
（3）乙醇；
（4）磷酸（85％）.
四、操作步骤
1、标准曲线制作
（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管,按表1取样.盖塞后,将各试管中溶液纵向倒转混合,放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色,记录各管测定的光密度OD595nm,并做标准曲线.
表1 低浓度标准曲线制作
管号 1 2 3 4 5 6
1000μg／mL标准蛋白液（mL） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
蒸馏水（mL） 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90
考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100
OD595nm
（2）0~1000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管,按表2取样.其余步骤同（1）操作,做出蛋白质浓度为0~1000μg／mL的标准曲线.
表2 高浓度标准曲线制作
管号 7 8 9 10 11 12
1000μg／mL标准蛋白液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水（mL） 1.00 0.8 0.6 0.4 0.2 0
考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg） 0 200 400 600 800 1000
OD595nm
2、样品提取液中蛋白质浓度的测定
（1）待测样品制备：称取样品2g放入研钵中,加2mL蒸馏水研磨成匀浆,转移到离心管中,再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵,洗涤液收集于同一离心管中,放置0.1h以充分提取,然后在4000r/min离心20min,弃去沉淀,上清液转入10mL容量瓶,并以蒸馏水定容至刻度,即得待测样品提取液.
（2）测定：另取2支10mL具塞试管,按下表取样.吸取提取液0.1mL（做一重复）,放入具塞刻度试管中,加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,充分混合,放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）.以标准曲线1号试管做空白.
表3 待测液蛋白质浓度测定
管号 13 14
蛋白质待测样品提取液（mL） 0.1 0.1
蒸馏水（mL） 0.9 0.9
考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5
OD595nm
蛋白质含量（μg）
五、结果计算
样品蛋白质含量（mg∕g鲜重）=(C×V/a)/W
式中：C为查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；
V为提取液总体积（ml）；
A为测定所取提取液体积（ml）；
W为取样量（g）.

1．大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定.
2．蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速,在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定.因此测定时,不可放置太长时间,否则将使测定结果偏低.

WB的胶用考马斯亮蓝染色,有为了确定你的目的条带电泳情况目的,还有一个目的,就是跟用丽春红染摸一样的作用,看转膜的效率.也就是看你的目的条带是否都转移到你的膜上了.
这步染色完全可以省略,一般都可以用预染Marker来进行转膜观察,另外考马斯亮蓝与蛋白结合后,很难再去除.

就是你取的材料用多少体积的蛋白提取液溶解的,这个体积就是提取液总体积.比如你取了1g鲜重的材料,用1mL蛋白提取液溶解,那么这里的提取液总体积就是1mL（一般不定容）.然后你取了0.1mL去测浓度,这个就是测定所取提取液体积.

你这个有可能是
1脱色不全 建议再脱色一会
2如果跑的是总蛋白的话,有可能会出现连续的蓝色条带.
3 蓝白相间的竖条纹?我猜这是横条纹吧……

有影响 考马斯亮蓝测定蛋白质的原理：考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种.考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465nm,后者在595nm.在一定蛋白...

不用固定,染色液中乙酸就有固定的作用,
染色液配方：
甲醇：水：乙酸=4.5:4.5:1或5:4:1