做LIC时,感受态热击温度太高会怎么样?

至少从来没有听说过这种事情.你可以试试.
不过质粒的拷贝数是质粒自身特性,由载体选用的origin,以及质粒的稳定性和表达产物来决定.一般与感受态无关.当然epicentre的EPI400除外；不过它是用来降低拷贝数来维持质粒稳定性的.

如果转化率够高的话问题不大,肯定能挑到阳性克隆.

氯化钙法（Calcium Chloride）
本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞,所得感受态细胞可以获得5 x 106 到 2x 107 转化克隆/微克超螺旋质粒DNA
材料（MATERIALS）
缓冲液和溶液（Buffers and Solutions）
（冰冷的）CaCl2•2H2O (1 M)
冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution, ice cold)
培养基（Media）
用于初始培养物培养的LB肉汤（L-broth for initial growth of culture）
LB agar plates containing appropriate antibiotic
核酸（Nucleic Acids）
质粒DNA （Plasmid DNA）
或经过重组的质粒（recombinant plasmid）
方法
1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落.把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中,于37°C下振荡培养过夜.2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）.
3. 室温下,4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞. 弃培养基,保留细胞沉淀.
5. 加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2 溶液,并轻微打匀.
6. 4°C下,4000 rpm离心10分钟收集细胞.
7. 弃MgCl2-CaCl2 溶液,保留细胞沉淀.
8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液,并轻微打匀.冰浴放置若干小时为最好.
9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作,也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏.
10. 向事先灭菌,并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液.向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克).细心混匀管中成份.于冰浴放置30到40分钟.
11. 把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上,准确计时90秒.（此时不能摇动转化管）
12. 把试管迅速转移至冰浴2到3分钟.
13. 向每只试管中加入500微升LB肉汤.37°C放置45到90分钟,以使细菌复原,并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达.
14. 转移适量体积（如果使用90毫米平板,一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有 相应抗生素的LB-琼脂平板上.
15. 室温放置平板直到其上液体被吸收.
16. 于37°C倒置平板培养.转化克隆应该于12-16 小时区间出现.

恩 就是质粒 感受态的大肠杆菌 把T载体转进去 然后摇菌培养 这样载体就会随着菌的扩增而扩增 然后就可以提质粒拿去测序或者别的后续实验 因为连接完的载体浓度是很小的

氯化钙法（Calcium Chloride）
本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞,所得感受态细胞可以获得5 x 106 到 2x 107 转化克隆/微克超螺旋质粒DNA
材料（MATERIALS）
缓冲液和溶液（Buffers and Solutions）
（冰冷的）CaCl2•2H2O (1 M)
冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution,ice cold)
培养基（Media）
用于初始培养物培养的LB肉汤（L-broth for initial growth of culture）
LB agar plates containing appropriate antibiotic
核酸（Nucleic Acids）
质粒DNA （Plasmid DNA）
或经过重组的质粒（recombinant plasmid）
方法
1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落.把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中,于37°C下振荡培养过夜.2.转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中.于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）.
3.室温下,4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞.弃培养基,保留细胞沉淀.
5.加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2 溶液,并轻微打匀.
6.4°C下,4000 rpm离心10分钟收集细胞.
7.弃MgCl2-CaCl2 溶液,保留细胞沉淀.
8.加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液,并轻微打匀.冰浴放置若干小时为最好.
9.此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作,也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏.
10.向事先灭菌,并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液.向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克).细心混匀管中成份.于冰浴放置30到40分钟.
11.把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上,准确计时90秒.（此时不能摇动转化管）
12.把试管迅速转移至冰浴2到3分钟.
13.向每只试管中加入500微升LB肉汤.37°C放置45到90分钟,以使细菌复原,并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达.
14.转移适量体积（如果使用90毫米平板,一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有 相应抗生素的LB-琼脂平板上.
15.室温放置平板直到其上液体被吸收.
16.于37°C倒置平板培养.转化克隆应该于12-16 小时区间出现.

低温有助于核酸的吸附,只要30min内冰浴不要完全融化就行,也不要晃动,静置最好.

首要问题就是操作是防止污染,因为这个是最容易影响感受态制作的因素.
其次,就是悬浮沉淀的过程,一定要轻轻悬浮,最好轻摇悬浮,如果用移液器,把枪头前面剪掉一部分,然后再吹,这样吹的比较柔和.
其他的,应该没什么了.

如果两种质粒同时转入细菌效率低的话,可以分两步转化：先转化一种质粒,然后把转化该质粒的细菌做成感受态,再转入另一种质粒,这样的效率会高很多.
转化效率低的一个原因是,制备感受态时细菌超过生长对数期了,变老了,这样对转化效率有很大的影响,尤其是在做双杂交的实验.

目的一样,但两次可以充分达到制备感受态细胞的效果,造成一个低渗的环境.有条件当然需要超净工作台,但一个酒精灯也够了.
注意事项嘛：保持低温；据分子克隆介绍,做好的感受态细胞在4度冰箱过夜可提高转化效率；分装保存在低温冰箱,以后还可以用.

质粒转化应该比较容易,要检查一下引物对不对.其次是你的模板够不够,因为农杆菌中质粒拷贝数很低.可以提出质粒后再来PCR

你做的是电转还是液氮转的,电转的话主要是要洗干净培养基等那些东西.液氮的话我没怎么做过.不过所有的都要到菌状态好,可以在做之前先划几次板,挑好的菌来接种,活化一下菌.

楼上别扯了,那是为了让细胞膜流动性降低,利于DNA的结合,同时使细胞暂停生长,维持在对数生长期的高活性!

应该是保持内的渗透压,保持细胞的正常形态,因为na和cl是细胞物质运输的重要离子

这个对照不太对,因为加质粒涂板一般那个平板是有抗生素的,而不加质粒涂板一般是需要不加抗生素的,没有对照的意义.一般是找一个以前做过的或者比较有代表性的质粒转化后作为对照,这样才能显示出感受态的好坏,否则不转质粒,“感受态细胞”这个词也无从说起.

菌种,离心管,氯化钙,LB培养基,水浴锅,冰水混合物,离心机,差不多了吧

我以前做感受态的时候,实验室的操作手册上写“具体离子在其中起的作用尚不清楚”……现在只知道不同的离子有在感受态细胞表面造成能够让质粒进入的小孔的能力.至于不同离子分别起了什么作用,我不是很清楚呀.期待其他达人回答.

经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细菌.如大肠杆菌经CaCl2处理,就成为容易受质粒DNA转化的细胞.