感受态细胞为什么要放倒-80度保存

完全可以,我们以前就是放液氮里的～

应该没什么严重问题,不过大肠杆菌被你折腾了,不知道会不会罢工
冰浴过程中,原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合,在低温下形成液晶结构,这样,在42度热激下,这种液晶结构收缩,将细胞膜扯开孔道,使DNA进入细菌细胞中.这就是原理.
你前后物质没损失,只是活性估计收到一点点影响,没大问题

完全可以的,但是操作需要注意污染.因为后面您还有筛选的步骤嘛.反正我做的是电转化,感受态制备要求不是想像中那么高的!

不同的农杆菌对于植物的感染能力不同,用作转基因试验时相应的转化效率也会有差别.但是只要掌握方法都能成功的.常用的有GV3101;LBA4404;EHA105等

细胞类型不同,结构也不同,细菌的感受态是一种非常奇妙的机制,DNA是大分子物质,进入细胞应该很困难,细菌的感受态有利于外源基因进入细胞,进行基因重组,一定意义上讲是有利于其进化的,动植物不同,一是动植物为有性繁殖,这种机制可以完成同源重组,二是为多细胞生物,单个细胞的同源重组没有意义,从这两个角度讲,动植物没有吸收外源基因的必要.

影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：
1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）；
2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3．经 CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
4．化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）；
5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；
7．一定范围内,转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；

影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：
1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）；
2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3．经 CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
4．化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）；
5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；
7．一定范围内,转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；

我用的peay t-3蓝白斑筛选,效果还可以.如果不想麻烦可以在在连接转化时多加一些DNA（一般要求加1微升,可以加2微升）,这样可以保证获得足够的单菌落,多挑几个跑PCR.

父代传给子代,叫垂直方向的基因转移.
水平方向就是不涉及遗传的基因转译,比如说不同物种间基因的转移.

感受态的制备,需要尽量排除杂质的污染,多次离心加CaCl2,只是为了使培养基尽量弃去.
感受态的整个制备过程都要求在冰上操作,CaCl2需要预冷是显然的操作,以最大限度保证细胞活性和转化效率.

1,克隆的基因A要插入到带启动子的表达载体（质粒）里面构建重组质粒A-plasmid.
2,构建好的重组质粒A-plasmid转入到表达菌株（制备成感受态细胞）E.coli.衍生菌株里面.
3,转化成功,挑单克隆诱导表达.

要看你做的是什么了.
大肠杆菌感受态根据用处的不同,也有很多种类,比如比较常见的TOP10、DH5α,质粒保存较为稳定的JM109、STBL3,表达所用的BL21等等.
除此之外,植物基因转化常用土壤农杆菌.
还有,你要在乳酸菌中表达蛋白或基因操作,就要用乳酸菌的感受态,你要在伤寒杆菌里操作,就要做伤寒杆菌的感受态……所以,看实验目的的.

对照组被污染了,或者氨苄有问题,或者在配制培养基的时候在培养基还没冷却的时候就加了氨苄.
其实大肠杆菌感受态可以买的,又不贵.自己做太麻烦了.
我已经说了啊,可能是对照的大肠杆菌被污染了,或者这些大肠杆菌产生了突变,但是突变的频率不会很高啊.

完全可以,我们以前就是放液氮里的～

问题描述不清.“同时做对照：质粒酶切回收的产物电转”?也就是说拿线性的质粒去电转做对照?
如果是这样,你不如用感受态细胞直接做阴性对照,再用原质粒转化做阳性对照,这样更好分析结果.多克隆位点是很小一段,你认为切成2段,但实际可能只切了一刀甚至一刀都没切完
你还是把过程描述清楚些先

hanahan的方法没有问题
一般是两个原因（排除你板子和试剂的原因,当然你也要确认一下）
1.hanahan的方法对OD值的要求特别高（差几分钟就差一个数量级）,如果这个方面出了问题,感受态的效率会呈指数下降.
2.因为测效价的质粒浓度非常低,一般为10pg/ul,这个浓度的质粒反复冻融一两次后,基本上里面的质粒就已经降解了,需要重新稀释.

可能性很多.
1、感受态不好.“待细菌达到对数生长期（OD600为0.5-0.6）”,你测OD了吗?其实很麻烦,建议稍微有点混就好用了；感受态细菌在无抗生素培养基上能否生长?
2、菌株与质粒不兼容.
3、转化体系也很关键.DNA宁可少点,多了影响效率.
4、DNA是否正确,至少是环状的.有无做超螺旋质粒的阳性对照?如果你做的是质粒构建的话,转化效率很低,有个对照会很好判断意外.
5、转化过程的操作.热休克、和复苏是否正确?复苏时不能加抗生素?
6、培养基是否正确?
建议做阳性对照（质粒）和阴性对照（没转化的感受态不能生长）,有了对照结果就好判断了

JM109、HB101,当然DH5a也可以.DH5a可做T克隆的host

感受态不是最适的OD为0.5-0.8么?（转接后培养的）
我是按照1:100转接培养,OD值除了和培养时间有关,转速也有影响.
一般过夜的话,10个小时左右,转速100
如果要早晨转接,下午做,一般5、6个小时,正常的转速（200~）
而且感受态一般是直接培养至0.5-0.8这个区间,这时候的活性才最高,稀释达到这个浓度不好.

以上仅供参考~~~

菌种保存采用甘油种结合超低温（-70℃）保存的方法,即用无菌甘油悬浮工程菌,并使甘油终浓度为30 %（V/V）,所获物即为工程菌的甘油种.低温可使工程菌的生命活动处于非活跃状态而能较长时间保存细胞活力、减少基因变异,而30%的甘油可保护菌种的细胞膜系统在冷冻与解冻循环中不被破坏而起到保护作用.

注意事项：
1．实验中所需氯化钙于冰浴后再使用
2．使用离心机前,要严格保证离心物品充分平衡,以免造成离心机损伤
3．大肠杆菌感受态一定放冰上溶化
4．热激和冰浴时间要科学把握

因为这时候抗抗生素的基因还没有表达出产物,加入抗生素会把细胞杀死.
不过青霉素是个例外,因为青霉素只是阻止细菌细胞壁的合成,而不是直接杀死细胞,所以它只是抑制增殖,细胞还可以存活,然后表达抗青霉素基因,然后就能进行正常的增殖了.

冰浴是为了质粒附着在菌体表面,热击是打开通道让质粒进入,觉得LZ的做法影响不大,不过要实际验证

制备（复制的~）
1.将冻存的菌种1：100接种于3ml的LB液体培养基中,37℃摇床过夜震荡培养.
2.取1ml活化菌种接种于100mlLB培养基中,37℃摇床培养1.5-2h.
3.将菌种在冰上放置10min.4℃、4000rpm下离心10min收集菌体.
4.弃上清,用事先冰浴的0.1mol/Lcacl2重新悬浮细胞,冰浴30min.
5.收集菌体,条件同上.
6.弃上清,在冰浴条件下加入0.1mol/Lcacl2溶液.
7.分装保存（40%甘油与感受态细胞1：1混合,使甘油的终浓度为20%）.
转化
1 连接产物加入感受态中
2 冰上放置30分钟
3 42° 90秒
4 冰上2-5分钟
5 涂板~
细胞转染（这里说的是脂质体转染,以六孔板为例,如果是电转或者病毒侵染的话再问我吧）
对于每一个孔
1 一管200ul OPTI+5ul lipofectin 静置5分钟
2 一管200ul OPTI+4ug 质粒
3 两管混合 静置20分钟
4 加入孔板中
5 4-6小时后换液

能在含Amp的培养基生长而不能在不含Amp的培养基当中生长吗?这好像不太对,做的时候有做好对照?有重复做下?一步步确保实验的正确性,再寻找可能的原因

这是用热激法进行的转化.以大肠杆菌为例,大肠杆菌在0摄氏度的氯化钙低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42摄氏度短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖.所以需要先冰上放置30min.

一般10个小时就能看到菌落.
几种可能原因：
1. 质粒没转进去.
2. 抗生素浓度太高,或者加错了抗生素.
3. 培养箱温度不够.

首先,确保你的连接是成功的,碰到过有师弟没加连接酶,连接失败的情况；
其次,转化过程操作是否正确,看你写的东西,连接液和感受态放在一起培养是个什么情况?
第三,如果要检测感受态是否失活,在第二步确保无误码的情况下,转化时加入阳性对照,拿个纯质粒同时转,如果纯质粒都不长,那感受态必然有问题.

是4度吧..放4度是抑制其生长..若放在-20度,虽然经过转化后复苏,细胞是有些恢复了活性,但是毕竟还是很脆弱,-20度冷冻细胞,然后再解冻使用的话,很容易使细胞死亡的,加之如果本来细胞的转化效率就不是很高的话,可能再次涂板的结果是没有菌落长出...
一般,我们做实验,剩余对的菌液是不会再用的,一是不靠谱,二是若是涂的板没长单菌落的话,那么这个剩余的菌液也就没什么作用了：若是长出了,大可以抽提质粒,下次用时再转,或者摇菌后用甘油保种,下次用时可选择划线,也可以直接摇菌...
个人感觉那个剩余的菌液,不存也罢..不知道你那边存起来时为了?

两个目的：①热激后的大肠杆菌细胞比较脆弱,培养可以恢复细胞的活性；②进一步培养,提高菌液中大肠杆菌的浓度.

LB培养基.
LB培养基的配方如下:
胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化钠(NaCl) 5g/L
pH调至7.4

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
准备：
　　一.材料
　　E.coli DH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA:购买或实验室自制,eppendorf管.
　　二.设备
　　恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪.
　　三.试剂
　　1.LB固体和液体培养基
　　2.Amp母液
　　3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板.
　　4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板.
　　5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌.
　　6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌.
操作步骤：
　　一、 受体菌的培养
　　从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期.将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右.
　　二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
　　1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟.
　　2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟.
　　3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液.
　　4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年.
　　三、 转化
　　1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上.
　　2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后.
　　3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟.
　　4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ).
　　5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时.
　　同时做两个对照:
　　对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同.此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现.
　　对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落.
　　四、 计算转化率
　　统计每个培养皿中的菌落数.
　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下：
　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
　　感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
　　[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化.但它们的转化效率并不一定一样.有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率.

不需要

电击法是利用高压脉冲,去处理细胞,在细胞膜表面形成一个20~40nm的瞬间空洞,这样外源基因就可以扩散进入细胞内；而氯化钙法是将处于对数生长期的细菌置于0℃的cacl2低渗溶液中,使细胞膨胀,同时ca+使细胞膜磷脂层形成...

除了增加细胞通透性之外,第一次还有洗净之前一步残留的LB液体的作用

A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌,最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜,可通过监测培养液的OD600 来控制.DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107 个/mL左右,这时比较合适.密度过高或不足均会影响转化效率.
B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心,悬浮细胞时要轻柔,以免造成菌体破裂,影响转化.
C）经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
D）化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（100-1000倍）；
E）所使用的器皿必须干净.少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每ug 质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA 加入量(ug)
下面以大肠杆菌TG1电转感受态为例给你演示一下：
第一天,上午取大肠杆菌TG1菌液划线平板（一般要48小时以上才能长出单克隆 ）
第三天,在长有单克隆的平板上挑一个生长状态好的单克隆接到4ML新鲜培养基,过夜培养
第四天,如你说的,按1：100扩大培养；OD达到0.5-0.6开始制备感受态细胞
制备好的感受态细胞分装到1.5EP管中,一般为100UL每管
感受态效价的测定：
转0.1ng标准质粒到100ul的感受态细胞中----1.5KV电压电击----37度培养1小时----稀释 涂布
所谓的“稀释倍数”是指这的稀释
一般情况下TG1电转感受态的效价（即转化频率）在10^8--10^9
所以反推预测,我们一般会稀释10^-2---10^-3梯度来涂布.
如果涂布50ul,假设在10^-2板上N个菌落,
套公式：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化子总数＝N×10^2×100/50＝2N×10^2
转化频率（转化子数／每ug 质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA 加入量(ug)
转化频率＝2N×10^2/10^-4(0.1ng=10^-4ug)
＝2N×10^6
你自己推算一遍,如果在10^-3板上Y个菌落的转化频率是否为2Y×10^7.
一样的,只不过是不同方法制备的感受态细胞,一个是电转感受态,你的是化转感受态.计算方法还是相同地.

1、 取大肠杆菌原始菌株（无外源质粒）单菌落接种于5mlLB培养液中,37℃,摇荡过夜；
2、 取1ml过夜培养物接种于100mlLB培养液中,37℃振荡培养1-3小时,待细菌达到对数生长期（OD600为0.5-0.6）即可；
3、 将培养液转移到两只预冷的50ml无菌离心管中,置冰上10分钟,使菌液冷却到0℃,JA-25.5转头（要预冷）5000rpm、4℃离心15min；
4、 弃上清,每只离心管加入10ml冰冷的0.1M无菌CaC12将菌体重悬,冰浴放置30分钟,JA-25.5转头5000rpm、4℃离心5min；
5、 每只离心管加入2ml冰冷保存液（1.7ml 0.1MCaC12和0.3ml无菌甘油）重悬沉淀,将两管混合,按每样200ul分装于无菌1.5ml离心管中；
6、 迅速放置于-80℃保存备用.

注意： 事先准备三个小瓶子,0.1M CaCl2 10ml/瓶 X 2、保存液 4ml X 1.
制备前一天准备好溶液并灭菌.超净台操作时不要用酒精灯或远离之.
楼主核对下~~任何疑问百度我
其实正如楼上所说 cacl2效果真的不咋样

-20可保存一周
-80可长期保存

必须-80℃.
4℃只能是实验过程中的低温保持手段,不能用于储存.

博凌科为生产的DH5а感受态细胞是采用大肠杆菌DH5а菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞,可用于DNA 的化学转化.使用pUC19 质粒检测,转化效率可达108 ,－70 ℃ 保存几个月转化效率不发生改变.每支感受态可以酌情分装使用,降低了实验的成本.质量稳定,使用方便,质优价廉.储存的条件：-70 ℃ 保存,避免反复冻融.我们用了很久了,对于实验室来说还是比较容易储存的,也很方便.