将质粒导入感受态细胞、再转入含Amp的LB固体培养基中培养,这个培养时间是多少?

1,要确定提出来的是不是你的质粒,有条带不一定就是你的质粒.
2,确定你的PCR没有问题,PCR时放阳性对照.
3,你用的是什么载体.考虑你的引物是否正确.

三种,质粒与质粒结合,质粒与运载体结合,运载体与运载体结合

基因工程中 第二步基因表达载体的构建 就是利用 限制酶跟DNA聚合酶将质粒和目的基因切割 构成基因表达载体
第三步将目的基因导入受体细胞中 就是将带有目的基因的质粒导入受体细胞
运载体也可以灭活的病毒或者噬菌体的衍生物 高中选修三课本上都有介绍的
而且是目的基因导入受体细胞而不是动物细胞导入受体细胞（受体细胞可以是植物 动物 微生物）

分别切胶,回收,做pcr,看能否p出标志带.

质粒在基因工程中是一类重要的载体,其作用主要是携带一些基因片段（可以是编码基因,也可以是调控区等）,在细胞内环境中进行表达或参与通路的相互作用,达成人们希望的目的,这些目的一般包括：取得蛋白产物（有直接提取的,也有表达酶进行药物合成的）,探究基因相互作用关系（比如过表达某一特定基因观察表型变化）.
总之质粒的作用一句话,将一段属于或者不属于这个物种的基因片段引入细胞/个体环境中.并进行后续研究.
有问题一起讨论解决哦~

1.质粒和拟核是同一种物质吗?若不是,“细菌DNA复制只发生在拟核”哪错了?
答：质粒和拟核不是同一种物质,拟核是细菌细胞内的大型的DNA,而质粒是中型环状的DNA.因此说细菌的DNA制不只是拟核的复制还有质粒的复制.
2.“分别用含有放射性同位素35s和放射性同位素32P培养噬菌体”怎么错了?
答：噬菌体是病毒的一种,只能在活的细菌中增殖.此句话可改成“用噬菌体去侵染分别用35S和32P培养的大肠杆菌”.
3.多倍体育种为什么不需经过愈伤组织,而单倍体育种要经过?
多倍体育种是一开始先进行染色体加倍,是用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗,不经过组织培养过程.而单倍体育种则是先用某植物的花药进行离体培养,培养到幼苗阶段后再用秋水仙素加倍.在花药离体培养阶段要形成愈伤组织.

你的受体细胞是什么?不同种类的细胞方法是不同的,转化效率也是不同的.所有转化法都需要先把受体细胞制作成感受态细胞.
最好操作的就是大肠杆菌细胞.可选择的方法有：热激法,电穿孔法,化学转化法等.
酵母：氯化锂转化法,电穿孔法,这两种方法一般需要把环形质粒线性化.
真核细胞：原生质体融合,基因枪法,精子介导法,病毒载体介导法,显微注射法,花粉管介导法等等.

题目说将外源目的基因 导入 大肠杆菌的质粒,导入后 放在含四环素的培养基上培养.2,4都是没导入,不合题意.导入大肠杆菌但未成功导入质粒的话,外源基因会被分解掉,相当于没导入.

一般空载扩出片段较小,插入片段的质粒扩增片段较大,具体看载体及插入片段大小来判断是否为阳性克隆,及是否为目标片段.

这个对照不太对,因为加质粒涂板一般那个平板是有抗生素的,而不加质粒涂板一般是需要不加抗生素的,没有对照的意义.一般是找一个以前做过的或者比较有代表性的质粒转化后作为对照,这样才能显示出感受态的好坏,否则不转质粒,“感受态细胞”这个词也无从说起.

不知道你没杂出条带是因为什么原因,还有你杂交的抗体是目的蛋白的抗体吗?你杂杂标签蛋白试试,看看有没有条带啊?我这么说是因为,膜蛋白确实不好提取,而且提取后可能空间构想改变了,你的抗体可能识别不了了,而标签蛋白是多肽,构象不会受影响,只要不被你的目的蛋白档上就行,所以你可以用标签蛋白的抗体杂交下,试试.一般最好把标签和目的蛋白融合表达一下

对质粒,双链DNA:
1 OD(260) = 50 μg/ml

设计一对引物,针对基因两端（覆盖酶切位点）,在上游引物中酶切位点后的一段序列中添加一个碱基,扩增以后,酶切产物和空载体,再连接一遍,转化,小提拿去测序.
最好上游换另一个内切酶位点,这样方便双酶切检测,区别于原来的质粒.

不一定是多个,有标记基因就行了,载体必备的四个条件中有.

转入空载质粒、含有插入的DNA片段、以及少量具有抗性的菌落在选择培养基上受到的选择压不同,生长速率不一致.

简单的说：
溶液一：重悬菌体,提供缓冲环境.
溶液二：氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔,释放细胞内的质粒.
溶液三：中和氢氧化钠、SDS中的钠被钾替换,吸附菌体产生沉淀.
复杂的说：
让我们先来看看溶液I的作用.任何生物化学反应,首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液,是再自然不过的了.那么50 mM葡萄糖是干什么的呢?说起来不可思议,加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部.因此,如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响.所以说溶液I中葡萄糖是可缺的.那么EDTA呢?大家知道EDTA是Ca2+ 和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性,和抑制微生物生长.在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA,无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉.如果不加EDTA,其实也没什么大不了的,只要不磨洋工,只要是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕DNA会迅速被降解,因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA.如果哪天你手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢?实话告诉你,只要用等体积的水,或LB培养基来悬浮菌体就可以了.有一点不能忘的是,菌体一定要悬浮均匀,不能有结块.轮到溶液II了.这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的.要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH,无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性.很多人不知道其实破细胞的主要是碱,而不是SDS,所以才叫碱法抽提.事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂,不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致.用了不新鲜的0.4 N NaOH,即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下）,自然就难高效率抽提得到质粒.如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒,因为SDS也是碱性的,只是弱了点而已.很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性,以便沉淀,这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致.有人不禁要问,既然是NaOH溶解的细胞,那为什么要加SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫.这一步要记住两点：第一,时间不能过长,千万不要这时候去接电话,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二,必须温柔混合（象对待女孩子一样）,不然基因组DNA也会断裂.基因组DNA的断裂会带来麻烦,后面我再详细说明.每个人都知道,溶液III加入后就会有大量的沉淀,但大部分人却不明白这沉淀的本质.最容易产生的误解是,当SDS碰到酸性后发生的沉淀.如果你这样怀疑,往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了.大量沉淀的出现,显然与SDS的加入有关系.如果在溶液II中不加SDS会怎样呢,也会有少量的沉淀,但量上要少得多,显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质.既然SDS不是遇酸发生的沉淀,那会不会是遇盐发生的沉淀呢?在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl,你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的.因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀.但如果你加入的不是NaCl而是KCl,你会发现沉淀的量要多的多.这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇 到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS）,而PDS是水不溶的,因此发生了沉淀.如此看来,溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全.大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所
产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了.这个过程不难想象,因为基因组DNA太长了,长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了,尽管SDS并不与DNA分子结合.那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢?是为了中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和之.基因组DNA一旦发生断裂,只要是50－100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了.所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带.很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了,这是天大的误会,因为变性的也好复性的也好,DNA分子在中性溶液中都是溶解的.NaOH本来是为了溶解细胞而用的,DNA分子的变性其实是个副产物,与它是不是沉淀下来其实没有关系.溶液III加入并混合均匀后在冰上放置,目的是为了PDS沉淀更充分一点.不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了,其实还有很多蛋白质不能被沉淀,
因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提,然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA,不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解.这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的,这里做个全面的介绍.酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿,按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉,但是水饱和酚的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍）,离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收；还有一点,酚与水有很大的互溶性,如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应）,应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除,而用酚/氯仿的混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行.至于异戊醇的添加,其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰,也方便了水相的回收.回收后的水相含有足够多的盐,因此只要加入2倍体积的乙醇,在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来.这时候如果放到－20℃,时间一长反而会导致大量盐的沉淀,这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收,所以不要过分小心了.高浓度的盐会水合大量的水分子,因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀.如果感觉发生了盐的沉淀,就用70％的乙醇多洗几次,每次在室温放置一个小时以上,并用tip将沉淀打碎,就能得到好的样品.得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解,不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的.琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时,多数情况下你能看到三条带,但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带.碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA,不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳,就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样.其实这三条带以电泳速度的快慢而排序,分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）.如果你不小心在溶液II加入后过度振荡,会有第四条带,这条带泳动得较慢,远离这三条带,是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断.非常偶然的是,有时候抽提到的质粒会有7－10条带,这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致.这里暂不深究.想说的,终于说完了.谢谢你的耐心.留下一个思考题,为什么真核生物的基因组DNA不能用碱法抽提?

解题思路：DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体．
限制酶：主要从原核生物中分离纯化出来．特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂．
常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒．作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来．

A、一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，说明酶具有专一性，故A错误；
B、质粒是基因工程中常用的载体，除此之外还有动植物病毒、噬菌体等，故B错误；
C、载体必须具备条件之一是：具有一个或多个限制性核酸内切酶切点，以便与外源基因连接，故C正确；
D、基因治疗是把正常基因导入病人体内有缺陷的细胞中，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，故D错误．
故选：C．

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．

考点点评： 本题考查基因工程的工具，意在考查考生的识记能力和理解能力，属于容易题．

解题思路：据图分析，①表示基因表达载体的构建，②表示将目的基因导入受体细胞，③表示脱分化，④表示再分化．应该选用PstⅠ、SmaⅠ限制酶，分别对鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割．切割下来的鱼抗冻蛋白基因左侧是SmaI的切口，右侧是PstI的切口，粘性末端不同，这样切出的目的基因（鱼抗冻蛋白基因）不会发生自生环化现象，质粒的处理同上．

（1）基因表达载体的构建是基因工程的核心．
（2）在构建基因表达载体中，如果目的基因和载体用同一种限制酶切割，获得的黏性末端相同，将会发生自身环化现象，故应选用不同的限制酶分别对目的基因和载体切割，以获得不同的黏性末端，故应选用PstⅠ和SmaⅠ对含鱼抗冻蛋白基因的DNA、质粒进行切割，PstⅠ和SmaⅠ在鱼抗冻蛋白基因的DNA上共有3个酶切位点，切割后产生4个DNA片段，而环状质粒上有两个酶切位点，切割后产生2个DNA片段．
（3）能在含氨苄青霉素的培养基中细胞具有抗氨苄青霉素基因，故基因表达载体Ⅰ中应含有抗氨苄青霉素基因作为标记基因．
（4）将目的基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法．
（5）检测目的基因是否翻译通常采用抗原-抗体杂交技术，采用低温培养方法在个体生物学水平上检测目的基因是否表达．
（6）图中③④分别指脱分化和再分化；欲获得人工种子应培养到胚状体阶段，植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性．
故答案为：
（1）基因表达载体的构建
（2）PstⅠ、SmaⅠ4、2
（3）抗氨苄青霉素基因（ampr）　
（4）农杆菌转化
（5）抗原-抗体杂交 低温培养
（6）脱分化、再分化 胚状体 植物细胞的全能性

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术；植物培养的条件及过程．

考点点评： 本题考查基因工程、细胞工程的相关知识，相对综合，可以通过理解记忆的方法平时加以训练．

TE为含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)缓冲液：
其中比较关键的成分是EDTA,日常环境中不可避免的存在DNase,而DNase的活性依赖于钙离子,并能被镁离子或二价锰离子激活.镁离子存在条件下,DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下,DNase I可在同一位点剪切DNA双链,形成平末端,或1-2个核苷酸突出的粘末端.
TE中含有的EDTA可以螯合金属离子,从而使DNase失活.
而Tris-HCl的作用主要是维持一定碱性PH值,有助于DNA的溶解和稳定.
一般长期保存需要TE缓冲液比较好,短期应用的可以使用ddH2O,有助于DNA连接等效果.

哎,农杆菌的机理都很清楚了.
不清楚,看以看看这个网页,描述的很好.
根癌农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将Ti质粒上的T-DNA 区域插入到植物基因组中.

解题思路：分析题图：重组质粒1的ori被破坏；重组质粒2的ori、amp、tet均未被破坏；重组质粒3的氨苄青霉素抗性基因被破坏；重组质粒4的四环素抗性基因被破坏．

A、等位基因是位于同源染色体相同位置上控制相对性状的基因，所以基因amp和tet不是一对等位基因，故A错误；
B、重组质粒1的复制原点被破坏，虽然含有氨苄青霉素抗性基因，但仍然不能在含有含氨苄青霉素培养基上生长，故B错误；
C、若要确定目的基因是否表达，可选重组质粒2、3或4导入受体细胞，再进行筛选和检测，故C错误；
D、重组质粒4的四环素抗性基因被破坏，因此导入重组质粒4的大肠杆菌不能在含有四环素的培养基上生存，故D正确．
故选：D．

点评：
本题考点： 基因工程的应用．

考点点评： 本题考查基因表达载体的构建，意在考查考生的识图能力和理解所学知识要点的能力；能运用所学知识作出准确的判断和得出正确的结论．

碱提法：
一、试剂准备
1.溶液Ⅰ:50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0）.1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml,0.5M EDTA（pH 8.0）10ml,葡萄糖4.730g,加ddH2O至500ml.在10 lbf/in2高压灭菌15min ,贮存于4℃.
2.溶液Ⅱ：0.2N NaOH,1% SDS.2N NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加ddH2O至10ml.使用前临时配置.
3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液,pH 4.8.5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,加ddH2O至500ml.4℃保存备用.
4.TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0).1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml,0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml,加ddH2O至100ml.15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用.
5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）
7.5×TBE：Tris 碱54g,硼酸27.5g,EDTA-Na2·2H2O 4.65g,加ddH2O 至1000ml.15 lbf/in2高压湿热灭菌20min,4℃保存备用.
8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml
9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml,TE配制,沸水加热15min,分装后贮存于-20℃.
10.6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,40%（W/V）蔗糖水溶液.
11.1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中,加100ml 0.5×TBE,微波炉加热至完全溶化,冷却至60℃左右,加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂,操作时带手套）,轻轻摇匀.缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE）,即可上样.
二、操作步骤
1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落,接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中,37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）.
2.取1.5ml培养物入微量离心管中,室温离心8000g×1min,弃上清,将离心管倒置,使液体尽可能流尽.
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中,剧烈振荡,使菌体分散混匀.
4.加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ,颠倒数次混匀（不要剧烈振荡）,并将离心管放置于冰上2-3min,使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清）.
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ,将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置3-5min.溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀.
6.加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇,振荡混匀,4℃离心12000g × 10min.
7.小心移出上清于一新微量离心管中,加入2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置2-5min,4℃离心12000g×15min.
8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次,4℃离心8000g×7min,弃上清,将沉淀在室温下晾干.
9.沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml）,37℃水浴30min以降解RNA分子,-20℃保存备用.

解题思路：由题意知，用人工诱变的方法使黄色短杆菌的质粒中脱氧核普酸序列发生CCGCTAACGATC→CCGCGAACGATC的变化，由DNA转录形成的mRNA的密码子变化是：GGC GAU UGC UAG→GGC GCU UGC UAG，因此mRNA编码的氨基酸序列的变化是：甘氨酸-天冬氨酸-半光氨酸→甘氨酸-丙氨酸-半光氨酸．

A、由题意知，该脱氧核苷酸序列编码3个氨基酸，因此含有2个肽键，A错误；
B、由A分析可知，B正确；
C、该黄色杆菌发生了基因突变，C错误；
D、由分析知，突变后基因编码的蛋白质的氨基酸序列发生了变化，因此该黄色短杆菌性状会发生改变，D正确．
故选：BD．

点评：
本题考点： 遗传信息的转录和翻译；蛋白质的合成——氨基酸脱水缩合；基因突变的特征．

考点点评： 对于基因的转录和翻译过程及基因突变与生物性状之间的关系的理解，把握知识的内在联系，并应用相关知识对某些生物学问题进行解释、推理、判断的能力是本题考查的重点．

你需要的是理解:DNA是双链的吧.比如说左边一条是1的,右边的是2的.
1 2
1 2
1 2
1 2
1 2
1 2
那么上下隔开1与1间就要用DNA聚合酶``连接单个链上的DNA片段
左右1和2的就需要DNA连接酶```连接两条DNA片段.
连接酶作用于两个DNA片段,而聚合酶作用于核苷酸间的磷酸二脂键
构建重组质粒就是目的基因与质粒重组
是两个DNA之间的连接,只要用DNA连接酶///
第二题:细胞具有全能性的根本原因是体细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能 很像对的了.
不过要记得要离体的细胞,对吧,呵```书上有.概念问题这是
第三题:
有机物的吸收这里错了,增施农家肥是为了根更好也更多的吸收矿质离子````
回答完毕,就是打字有点儿累``如果我有说错也请你指出,我也是学生物的..可以交流一下.

答案应该是C
阻止基因a的表达可以有很多方法,可以阻止转录,也可以阻止翻译等,所以若利用某药物阻止基因a的表达,基因b、c也有可能表达
另外复制和表达是相对独立的,一般不会出现复制半条就表达的情况
D是正确的,组成基因a、b、c的基本单位都是脱氧核苷酸,都有RNA聚合酶的结合位点

那是他们提取的时候变性时间太长,变性的质粒DNA电泳的时候走在超螺旋DNA的前面,染色较淡.
变形的原因通常是上样量太大,也有可能是凝胶、缓冲液的原因.

是的,可以发生.如S型菌是获得了R型菌的DNA,并且整合到了自己的DNA上,这就是一个重组的过程啊.不要以为重组就只是减数分裂时发生的.
无荚膜的R型细菌有非常重要的“感受态因子”位点,保证了S型细菌的DNA可以进入.S型细菌有荚膜,无“感受态因子”位点,不能作为受体菌直接培养而发生转化.那么S型细菌有可能变成R型细菌吗?当然有!
转化之所以会发生：
一、因为R型与S型的DNA可以同源区段配对,形成杂合细菌,通过分裂生殖形成R型和S型两种后代,不象许多人认为的（R型直接变成S型）；
二、无荚膜的R型有非常重要的感受态,保证了S型的DNA可以进入.反之则不会发生：S型有荚膜,无感受态,不能作为受体菌,若人为除去荚膜,培养出无荚膜的后代,它就同时丧失了毒性,变成R型,当然就会有了感受态.
三、真核生物的细胞膜表面结构与原核生物的大不相同,不会发生转化（转化本身只发生在同种菌株间或近缘菌株间）.我们可以放心去吃想吃的东西,包括被加热杀死的S型肺炎双球菌.
四、S型可以变成R型吗?当然可以!产荚膜细菌由于有黏液物质,菌落表面湿润、有光泽、黏液状,称光滑型—S型（smooth）；无荚膜细菌由于无黏液物质,菌落表面干燥、粗糙,称粗糙型—R型（rough）.自然状态下通过基因突变来完成,不是转化.人工方法是诱变,物理、化学方法都行,变过来的还能再变回.
关于"一个细菌只能诱导机体产生一种抗体.这种说法正确吗?为什么?"的问题：抗原与抗体的关系正如一把钥匙开一把锁,一个细菌只能诱导机体产生一种抗体,但如果细菌变异了,那机体也会相应产生对应的抗体.

D

“难道说目的基因能够激发标记基因表达?”
不是的,2个基因有分别的启动子.而抗药基因的启动子始终是处于激活状态.
标记基因这个名字起的不好,应该是筛选基因,比较好理解.
当目的基因和抗药基因在同一质粒时,抗药基因用来分离成功转染了该质粒的细菌.没有转染的细菌就不能存活.“这样所谓质粒的优越性又在哪里?” 这样很简便.不用一个一个细菌来检测是否有目的基因.

绝大多数情况下可以,但一般要稀释
个别情况下需注意,譬如你的PCR产物纯化后直接做电转,此时要注意你的模板质粒是否会同时发生转化影响筛选

1、这是作为保藏的手段,不然你怎么保存你的基因?
2、这是获得自引物之间完整序列的必要途径,因为测序是无法获得待测序列起始部分和约800-1000bps之后的序列,因此需要连接到质粒上测序,俗称TA克隆.为什么会这样我就不说了,懒得打字.

在质粒导入大肠杆菌的过程中,有两个机制对质粒有影响,第一个是限制性,即新导入的质粒会被限制酶切然后降解,这是微生物抵御外界感染的的机制,另一个机制是修饰机制,会对自身的遗传物质进行修饰,如甲基化等,在质粒在初进入大肠杆菌,度过限制这一过程后,其修饰机制即会发生作用,使外源的质粒与染色体进行同样的修饰.因此,在此之后,质粒将不再被限制酶破坏.

用CACL2来处理,是利用钙离子处理法,使细胞处于感受态,促进质粒进入.如果是导入金茶花细胞,就属于导入植物细胞了,常用花粉管通道法,基因枪法,农杆菌转化法.

质粒也是双链首先,你说的基因双酶切之后,是有两个切口,但应该是两个粘性末端,（当然了,这只是个说法问题）.质料是双链环状,一个切口之后,也是有两个末端,那这两个末端就可以与基因上的末端连接了.另外,在真正的实难...

抗性基因也表达,但是可能质粒中不止一个抗性基因,一个表达,另一个插入失活；或者插入失活的是半乳糖苷酶操纵子,又或者插入失活的是致死基因ccdB.

质粒可以.染色体不可以

农杆菌转化法就是将目的基因整合到植物染色体DNA上,从而实现外源目的基因的表达

第一,细菌没有染色体
第二,别忘了,质粒是从细菌中取得的,因此,质粒在细菌中可以稳定存在并表达
因此,得解

你们是自己测序,还是送公司测序?
如果是送公司的话,可以直接测序,测序引物为M13通用引物.但是测序之前需要把挑出来的克隆,扩繁、PCR检测后再测序.测序公司再提取质粒-测序.
如果是自己测序,酶切应该是检测用,阳性的质粒再测序.
总之,一般情况下,测序都是用质粒.酶切或者PCR只是用来检测阳性克隆,酶切更准确.现在PCR产物也可以直接用来测序.

连接产物有:质粒和质粒连,目的基因和目的基因连,质粒和目的基因连.
至于你说的用两种酶切的产物,需要具体看酶的位置关系再作判断,情况就多了

A、基因治疗是基因工程技术的重要应用之一，而基因工程的原理是基因重组，A正确；
B、天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，B错误；
C、将目的基因与载体结合在一起，首先需要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，其次还需要用DNA连接酶连接目的基因和运载体形成重组质粒，C正确；
D、目的基因成功导入受体细胞后不一定能成功...

如果你是想知道哪个是大的质粒,哪个是小的质粒的话,跑一个琼脂糖凝胶电泳就可以看出来了.

1.细菌的生长状态和密度：OD006=0.0.5 细菌出于对数期或者对数前期
2.质粒DNA：数量：质粒DNA不超过感受态细胞体积的5%
大小：分子量越大转化效率越低,超过30Kb的质粒DNA很难转化成功
构型：超螺旋的DNA具有较高的转化效率,重组DNA效率低一些,环状DNA相比线性DNA转化效率高一些
3.所用试剂纯度、质量、器皿的洁净程度
4.防止杂菌和其他外源DNA的污染

不一定.转化成功的细胞会在选择培养基上生长,但也可能存在T载体自身环化的情况,目的基因未连接到T载体上.

用大肠杆菌表达载体就行啊!问题就是,ORF要正确,表达的蛋白可能被降解,激素基因要把内含子去掉,启动子、终止子都要用大肠杆菌的等等.

生化书里说的 “每个细胞只有一个或少数几个拷贝”是指的：在同一个细胞内有几个完全相同质粒同时存在的数量,而不是复制多少次.
我想你输错了,松弛控制的质粒,每个细胞可以有几十直到几百个拷贝,也就是说,同一个细胞内,有完全相同的质粒几十直到几百个.现在基因工程里常用的大肠杆菌质粒如pUC19等就属于这一类.
严谨型的质粒,才只有一个或少数几个拷,比如大肠杆菌的F质粒,在人类基因组中用得很多的BAC质粒就属于这一类质粒.
严谨型的质粒的复制,受基因组的复制的调控.而松弛型的质粒不受其调控,也就是在细胞不分裂时,松驰型的质粒还会继续复制,而严谨型的则一般会停止.
在适当的宿主细胞内,质粒总是会随着细胞一直不停的复制下去的,所以质粒的复制能力是无限的,因此,生化书里说的是指的在一个细胞内有几个拷贝数,而不是复制多少次.

分别将这两个基因插入到相应的载体中使用酶切,连接,转化,鉴定的方法就可以进行质粒构建了!

一般来说,提取质粒所用的试剂盒已经加入了RNase,所以电泳跑胶不会出现RNA条带.即使是采用的人工方法提取,也不可避免的空气中,汗液,唾液等中丰富的RNase的降解.此外,按照你的问题来看,你应该是再提取质粒,提取质粒然后电泳渴望观察到RNA的条带,殊不知质粒分子一般较大,其所用的琼脂糖胶浓度一般小于1%,这种浓度的胶是检测不出RNA条带的,细胞总RNA条带在跑胶时是以tRNA(约占细胞总RNA的80%)条带形式展现的.而tRNA电泳所用的胶浓度在2%左右,是不可以同质粒电泳同时在一块胶上检测的.

都有可能
你可以多做几个对照,如空载体转化、空细胞涂板等等,帮助缩问题小范围
你可以询问实验室其他人员,看看酶是否有问题,感受态是否有问题,抗生素是否有问题,等等
按你给的线索,菌落很少,很有可能是切开的线性质粒没有连上片段,转不进细胞,少量没有切开的空载体转进细胞,形成阴性菌落.问题可能在片段酶切上,建议连T载体再切,或双酶切换成两步单酶切,或换酶切位点,或重新设计保护碱基