石榴叶绿体DNA提取的具体步骤?

这里的论文有,但是要RMB
http://www.***.com.cn/Article/CJFD2005-NNXB200502014.htm
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石榴(Punica granatum L．)为石榴科石榴属植物,作为栽培的只有一个种,即石榴．目前石榴的科研工
作还比较薄弱,各地品种混杂,同物异名、同名异物现象十分严重_I],给生产和科研带来极大的不便,所以
对各地品种进行系统分类鉴定有很大的生产和科研价值．传统的鉴定方法如形态鉴定、花粉鉴定、同工酶
鉴定等都有一定的局限性[ ,随着分子生物学的发展,从DNA水平上进行分子鉴定显示出巨大的优
越性．石榴是多年生果树,育种周期较长,从 DNA水平上进行遗传标记的分析研究,可以对遗传性状进行
预先选择,缩短育种年限．而这些工作的前提是提取高质量的DNA．DNA的提取方法_3 6_在苹果和梨、桃
等方面研究较多,石榴DNA的提取方法研究目前还少见报道,作者对此进行了初步的探讨研究．
1 材料和方法
1．1 材料
试验材料分别来源于四川攀枝花市农科所、云南会理、山东果树研究所、陕西石榴研究所等,选择‘青
皮软籽’、‘甜绿子’、‘泰山红’、‘净皮甜’石榴品种为试验材料．
收稿日期：2005—03一【)8
基金项目：河南省科技攻关项目(0422050013)
作者简介：陈延惠(1963一),女,河南南阳人,副教授,硕士,主要从事果树遗传育种和教学工作．通讯作者：朱道圩
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第2期 陈延惠等：不同方法对石榴叶片DNA提取效果的影响
1．2 仪器与设备
Hettich D-78532低温高速离心机,Bekaman核酸蛋白分析仪,DYY一8B型电泳仪等,由河南省农科院分
子生物学重点试验室提供．
1．3 试剂
(1)2 X CTAB缓冲液：100 mmol·L 晡s．HCl(pH 8．0),1．4 tool·L～ NaCl,80 mmol·L～ EDTA,质量分数为
2％ CTAB,体积分数为2％ BME；(2)CTAB沉淀缓冲液：50 mmol·L～Tns—HC1(pH 8．0),10 mmol·L一1 EDTA(pH
8．0),质量分数为1％ CTAB(3)质量分数为10％ CTAB／NaC1：质量分数为10％ CTAB,0．7 mo1．L’ Nacl；(4)高
盐TE缓冲液：10 mmol·L 瞄s—HCl(pH 8．0),0．1 mmol·L EDTA(pH 8．0),l tool·L～NaC1；(5)TE缓冲液：l0
mmol·L 1hs—HC1(pH 8．0),0．1 mmol·L.EDTA；(6)SDS提取缓冲液：10 mmol·L 瞄s—HC1(pH 8．0),100
mmol·L～NaC1,50 mmol·L EDTA(pH 8．0),质量分数为2％ SDS,体积分数为2％ BME；(7)PmaseA贮液：l0
mg·mL～；(购于上海生工生物工程公司)(8)5 mol·L～KAC；(9)液氮；(10)I,(氯仿)：I,(异戊醇)=24：l：(11)
3 mo!·L NaAC(pH 5．2)；(12)异丙醇；(13) (苯酚)： (氯仿)=l：l；(14)琼脂糖、Taq酶及引物S 473
(GGAGTGCCTC)(购于上海生物工程公司)(15)体积分数为70％ 乙醇；(16)无水乙醇．
1．4 DNA的提取方法
1．4．1 DNA的提取和纯化取2 g石榴叶片放人预冷的研钵中,加人适量石英砂,液氮快速研磨成粉末．
在粉末融化之前分装于4支I．5 mL离心管中,立即分别加人65 c【=预热的4种提取缓冲液．其中2管分别
加人50OraL 2 X CTAB提取缓冲液,管上分别标记CTAB I,CTABⅡ．另2管分别加人500 gL SDS提取缓冲
液,管上分别标记SDS I,SDSⅡ,轻轻震荡几下,使粉末均匀分布在提取液中,放人水浴锅65℃水浴．CTAB
法保温l h,SDS法保温30 min,其问混匀几次．然后按以下方法分别提取、纯化．
1．4．1．1 SDS I法 (1)加人等体积 (氯仿)： (异戊醇)=24：l,12 000 r·min.,4℃条件下,离心10 min,
抽提两次．(2)取上清,加人2／3体积冷异丙醇(一20℃),室温沉淀30 min．(3)10 000 r·min～ ,4℃条件下
离心10rain,沉淀分别用体积分数为70％乙醇和无水乙醇各清洗1次,放在超净工作台上吹干.(4)沉淀溶
于适量高盐TE中,如不能完全溶解,65℃水浴10 min．(5)加人2倍体积无水乙醇,～20℃沉淀30 min．
(6)勾出DNA沉淀,放在超净工作台上吹干沉淀．
1．4．1．2 SDSⅡ法 (1)加人1／3体积冷KAC溶液,立即冰上放置30 min．(2)12 000 r·min～ ,4℃ 条件
下,离心10 rain,取上清,加人等体积的l,(氯仿)：I,(异戊醇)=24：l,12 000 r·min～,4℃条件下,抽提2次．
(3)加入2／3体积(一20℃)冷异丙醇,室温沉淀30 min,10 000 r·min～,4℃条件下,离心10 min,沉淀分别
用体积分数为70％ 乙醇和无水乙醇各清洗1次,放在超净工作台上吹干．
1．4．1．3 CTAB I法 (1)加人等体积I,(氯仿)：l,(异戊醇)：24：l,12 000 r·min～,4℃ 条件下,离心10
fnjn,抽提2次．(2)取上清,加人2／3体积一20％冷异丙醇,室温沉淀30 min．(3)10 000 r·min～,4℃条件
下,离心10 min,分别用体积分数为70％ 乙醇和无水乙醇清洗1次．(4)放在超净工作台上吹干沉淀．
1．4．1．4 CTABⅡ (1)加人等体积l,(氯仿)：l,(异戊醇)=24：l,12 000 r·min.,4℃条件下,离心10 min
抽提2次．(2)取上清,加人1／10体积65℃ 预热的质量分数为10％ CTAB／NaC1溶’液,加人等体积l,(氯
仿)： (异戊醇)=24：l抽提1次．(3)重复步骤(2),吸上清加人等体积CTAB沉淀液,65qC,水浴30 min．
(4)用适量高盐TE溶解沉淀,65℃,水浴30 min．(5)加人2／3体积一20℃冷异丙醇,混匀后10 000 r.
mi ～,4℃条件下,离心10 min．(6)加人体积分数为70％ 乙醇和无水乙醇各清洗沉淀1次,在超净工作
台上吹干．
以上各方法所得4种DNA分别溶于100 TE中,各加人3 RNaseA,37℃保温30 min．加人20o TE,加
人等体积l,(氯仿)：I,(异戊醇)=24：l,10(100 r·min～,4c【=条件下,离心10 min．取上清,各加人1／10体积冷
NaAc,再加人2倍体积无水乙醇,一20℃沉淀30 min,用枪头勾出沉淀,用体积分数为70％ 乙醇和无水乙醇各清
洗1次,超净工作台吹干,溶于l00 TE中,一20％长期保存．统计时取4次试验结果的平均值．
1．4．2 DNA的检测方法
1．4．2．1 DNA的纯度和得率检测4种方法所得DNA用核酸蛋白分析仪进行测定,取l L DNA溶液,用
rE稀释50倍,TE作为空白对照,测得相应的OD值,若0D值介于1．8～2．0,则DNA纯度较好,有
DNA得率／( g·g )=A260 x 50 X稀释倍数／叶片质量．
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河南农业大学学报 第39卷
1．4．2．2 DNA的电泳检测 取3～5 tzL DNA混合1／10 loading bufer点样,琼脂糖质量分数1％ ,电解缓冲
液为1XTAE,琼脂加热后冷却到50～60~C时加入3 L EB,电压为96、 ,电泳大约1 h后,在紫外凝胶成像
系统下观察摄像,并检测其分f量．
1．4．2．3 RAPD检测 RAPD反应条件为：94~C 预变性4 min；94~C 变性1 min,37~C退火1 min,72℃延伸2
min,共45个循环,72℃ 总延伸7 min；RAPD反应体系为：反应体系为25 ,内含：模板DNA(60 ng" L一 )1
tzL,引物S 473 l ,10×Reaction Buffer 2．5 ,dNTP混合液2 tzL,Taq酶0．2 tzL,ddH20 18．3 ．
1．4．3 比较不同EDTA浓度的提取效果 分别用20,30,50,80 mmol·L EDTA浓度比较提取效果,DNA的
点样量为2 f』L．
1．4．4 比较不同取材时期对DNA的提取效果 用CTAB I法对甜绿籽扦插幼叶和大田幼叶提取效果进
行比较,以研究本试验是否受材料来源和生长季节的限制．