蛋白质分离纯化常用方法

蛋白质分离纯化常用方法有：
1、沉淀,
2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的,在电场中能向电场的正极或负极移动.根据支撑物不同,有薄膜电泳、凝胶电泳等.
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法.
4、层析：
a.离子交换层析,利用蛋白质的两性游离性质,在某一特定PH时,各蛋白质的电荷量及性质不同,故可以通过离子交换层析得以分离.如阴离子交换层析,含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来.
b.分子筛,又称凝胶过滤.小分子蛋白质进入孔内,滞留时间长,大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出.
5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量.不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开.

In protein isolation and purification,ion exchange chromatography is a key technique compared with other techniques.

聚丙烯酰胺分辨率高,可将分子量不同的蛋白进行分离.
流程：
上样——电泳——脱色——切胶——回收
可得到纯度极高的蛋白质.

这个就是盐析法.各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及pH不同,故可用于对混和蛋白质组分的分离.例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白,饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来,盐析沉淀的蛋白质,经透析除盐,仍保证蛋白质的活性.调节蛋白质溶液的pH至等电点后,再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好
饱和度就是100g水中能溶解的溶质的质量啊.这个可以查到.40%就是饱和度乘以0.4就好了.

主要有：
等电聚焦：使电泳的介质中形成一定范围的pH梯度,电泳时待分离的两性分子可以在这种pH梯度中迁移,直到聚集于与其等电点相同的区域.该技术特别适用于分子量相近而等电点不同的蛋白质分离和分析.
等电点沉淀：利用两性电解质在等电点时溶解度最低,以及不同两性电解质等电点不同的特性,通过调节溶液PH,使蛋白质或杂志沉淀析出,从而使蛋白质与杂质分离.
层析聚焦：将蛋白质等两性电解质的等电点的特性和层析的特性结合在一起,实现分离的技术.
等电点结晶：通过缓慢改变蛋白质溶液的PH,使之逐渐达到等电点,而使蛋白质结晶析出,从而得到纯化.

楼主,方法很多,我就挑几个比较有代表的吧
1.亲和层析：利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术.
原理：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中,当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时,与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中.那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附,直接流出,从而与被分离的蛋白质分开,然后选用适当的洗脱液,改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来.
2.凝胶过滤：利用一定大小孔隙的具有网状结构的凝胶作层析介质（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）,根据被分离物质的分子大小、形状不同扩散到凝胶孔隙内的速度不同,因而通过层析柱的快慢不同而分离的一种层析法.
原理：凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法,主要是根据蛋白质的大小和形状,即蛋白质的质量进行分离和纯化.层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质,使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离.也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）.一种利用带孔凝胶珠作基质,按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术.一般是大分子先流出来,小分子后流出来.
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于分离蛋白质和寡糖核苷酸.
作用原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构,具有分子筛效应.它有两种形式：（1）非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开.
4.盐析：增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象.是蛋白质分离纯化中经常使用的方法,最常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等.

蛋白分离纯化中要根据分离蛋白的性质确定分离方法,比如：前期纯化要注意缓冲液的使用,后期要加保护剂,因为纯度越高,蛋白质可能就越不稳定.

是指它所处的溶液的酸碱度

酶分离纯化与一般蛋白质分离纯化最重要的区别是,每一步操作有要特别注意防止变性

蛋白质分离纯化的方法,要根据不同的处理物和目的蛋白而选择不同的方法.所以在纯化之前,应该要对目的蛋白一些理化性质等要加以了解.不过蛋白质纯化最常用的是饱和硫酸铵法.

蛋白质变性影响因素：
1,一般温度高于60摄氏度持续一段时间会变性.不同蛋白耐受高温不同,具体问题具体分析.
2,高浓度有机溶剂,如丙酮,乙醚,巯基乙醇等.
3,含有蛋白酶环境会分解蛋白.
4,变性剂,如高浓度盐酸胍和尿素.,
5,盐溶液,在一定浓度盐作用下,会使蛋白中折叠在内部的疏水集团暴露而改变折叠结构.
6,pH值变化,强酸强碱条件下会破坏蛋白质结构.等电点时蛋白质沉淀.
...
因此,克服和避开上述内容可以减少变性.具体措施：
1,控制温度,pH值.避开强酸强碱和等电点.
2,尽量减少和有机溶剂和变性剂的接触.
3,添加蛋白酶抑制剂,可以减少蛋白分解.
4,盐浓度适宜,不能太高.
5,增加NMSF,N-马来酰亚胺,去氧胆酸钠等抗氧化物质,可以防止蛋白被氧化变性.
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