Orbital的《Illuminate》 歌词

启迪

Illumina测序原理是一种叫做“链式反应（Chain Reaction）”的技术，它可以将DNA序列转换为可读的数据。它的基本原理是以特定的 DNA序列为模板，分子生物学家们使用酶和反转录酶来将DNA序列转换为可读的数据。拓展：Illumina测序技术也可以用来研究多种基因和细胞表达，可以研究基因突变、蛋白质结构和功能，并可以用来识别和比较不同物种之间的遗传差异。此外，Illumina测序技术还可以用来研究DNA的组织结构，以及DNA组织结构如何影响基因表达和细胞表达。这种技术还可以用来研究基因组的演变，以及如何影响基因表达和细胞表达。

向来纠纷不断的基因测序领域又迎来新的诉讼。 据悉，全球基因测序霸主Illumina在上月宣布已向德国杜塞尔多夫地区法院对华大集团的子公司拉脱维亚华大智造提出专利侵权诉讼。诉状称，华大智造的测序产品，包括BGISeq-500、MGISeq-2000和相关化学试剂，侵犯了编号为EP 1 530 578 B1的专利。该专利涵盖了Illumina公司特有的边合成边测序技术。 值得注意的是，在Illumina官网上，一份2010年的公告显示华大集团曾向Illumina采购了其HiSeq 2000测序系统。而当时深圳华大基因研究院副院长张秀清曾表示这是华大集团为全球科学家开发提供基础测序设施的重要一步。 华大智造是华大基因集团旗下测序仪研发制造板块企业，在目前全球主流的二代测序仪方面，华大智造位居全球前三，双方在测序仪生产销售上存在激烈竞争。另一方面，曾经华大集团的测序服务板块也是Illumina的大客户，但如今随着华大智造在二代测序仪上的突破，华大基因也不再从Illumina进行采购，而是转向采购华大智造产品。 华大集团方面对界面新闻回应称，华大集团自己的技术很有信心。华大集团旗下华大智造目前已累计投入超过50亿元人民币的研发经费，实现测序技术源头式专利布局，已经打破基因测序产业上游的市场垄断。关于专利纠纷，正在积极应对，会采取相应的法律行动，不排除会用反诉等法律武器保护其合法权利。 此外据悉，目前华大智造在国内外的相关产品的销售尚未受到影响。 华大智造的拉脱维亚子公司是为欧洲的销售做准备，而本次存在纠纷的产品来源于华大智造此前收购的Complete Genomics公司，在被华大智造收购前Illumina就曾与Complete Genomics有过数次专利诉讼纠纷，但已于2013年和解。 界面新闻从欧盟专利局官网查询发现，这两项专利均于2003年申请。有业内人士介绍，一般来说专利期为20年，到期前一两年竞争对手可能就开始进行销售筹备等工作。上述人士表示，目前看，Illumina所指控的应该是一个测序仪试剂的某些细小的技术，这些技术“难度不大，但是是测序仪必须必备的，无法绕开”。上述业内人士认为，由于技术复杂，究竟Illumina这次所指控的具体是哪一点，又将如何证明，很难预测。 公开信息显示，此前有一家德国公司QIAGEN GmbH也曾因此次涉及到的专利EP 1 530 578 B1，卷入到Illumina的诉讼中。 另外一位行业人士则表示，从原理上来说，双方产品的底层技术相同，但实现路径不一样。 据华大智造COO蒋慧此前介绍，华大智造测序仪使用的核心技术称为DNBSEQ，基于单链滚环的扩增技术。其他公司使用的另一种技术，是基于芯片上的桥式PCR技术，在芯片上进行PCR的扩增，而这两种技术是短读长高通量测序中比较差异化的技术路线。 此外，相互发起专利诉讼已是基因测序领域的常态事件，Illumina曾对全球多家企业发起过专利诉讼，但也曾有过被凯杰、美国哥伦比亚大学等反诉。

读做：衣露米娜是个著名公司的名字，并不是一个正式的单词，是illuminate的变种，就是照亮，使----亮起来的意思，可以翻译成光照公司，英语起名时会常常使用一个些自创的单词变种来显得更酷，举个最简单的例子，cokacola，这个单词本来也是没有的，公司名气了，就进入字典，就像中文里用自创的词语做公司名一样，淘宝，天猫，这些也是自创的词语。

illumina高通量测序介绍如下：1.原理illumina的Hiseq2000和454都是通过单序列的扩增放大信号，只是Hiseq2000中间有桥式扩增，可以两头测序。测序长度来讲，Hiseq2000一般为1X100和2X100的模式，而454平均500bp左右，最长700左右，测序准确度来讲Hiseq的测序准确度稍高一些，454由于在测序的过程每次是加一种碱基，所有如果是单碱基重复，比如AAAA，那么区分几个A的准确性就会下降。2.数据分析和应用方向数据分析相差不大，只是不同的软件，应用方面两者各有优势，Hiseq2000数据适应性更高。454一般是宏基因组种群丰度测序上应用更好一些，不过illumina也有MIseq代替。3.通量和价格HISEQ2000的通量要高一些，价格比454便宜很多。综合来讲454现在应用面比较窄了，所以在市场上现在也慢慢被代替掉了。现在耗材和试剂也很快就停服务了。不过Hiseq现在市场上也都2500居多了，并且现在也有新的的技术更新的3000和4000。说实话现在Hiseq2000也很少了。

目前我们主要分析的数据还是二代测序的数据，也就是大家经常挂在嘴边的 NGS ，而这其中最大的赢家应该算是 illumina 测序公司了，其经典的边合成边测序（sequencing by synthesis，SBS）巧妙地利用带不同荧光的dNTP来让碱基组成可视化，本身还是很有意思的。但随之而来的就有一些问题，比如以RNA-seq为例， 如果你是一个经典的从表达矩阵开始的数据分析选手，那其实建库细节对你来说好像也没那么重要；而如果你是一个从原始fastq下机数据（甚至建库实验）开始的数据分析选手，此时建库的细节就可能显得尤为重要，需要你做到知根知底。 或许你经常遇到一些名词，其中有一些可能让你感到迷惑： 现在我们就以illumina经典的 TruSeq Stranded mRNA 建库测序为例来走一遍整个illumina测序的流程，为什么会选择这个建库策略呢？ 首先，RNA-seq是目前我们触手可及、应用最广的基因表达量检测技术；其次，相较之于链非特异性测序，链特异性测序对大多数人来说更复杂，更难以理解。 关于链特异性测序我之前已经有一个长篇大论谈到了这个问题： 一文阐述链特异性测序——stranded? reverse-stranded? un-stranded? ，阅读量还不错，反馈也还可以，有兴趣的可以去看看，在这里就只以 TruSeq Stranded mRNA 为例了。 老规矩，我还是以图辅以文字的方式来先整体介绍一下 TruSeq Stranded mRNA ： 对着流程看，提前说一下， 红色始终代表sense strand的信息，天蓝色代表antisense strand的信息 ： 注意了，我们现在回到这个结构，开始走上机测序的流程： 做过fastq文件比对的人都知道，这个过程中非常重要的，大家挂在嘴边的就是 去接头 ，第三个名词出来了： adapter 。那么到底什么是接头？ fastqc 这样的软件又是怎样检测到的？ cutadapt 、 fastp 、 trimmomatic 、 trim_galore 这些软件又是怎么去接头的？似乎这些都是灰色地带，下面是我的理解： 首先还是看文库结构： 这实际上很好理解，我们没有人去adapter是从fastq文件中每条read的开头去的。那么什么是adapter呢？你可以简单理解为，在一个文库中，非生物学序列的其余序列都属于adapter，包括 P5、P7、测序引物结合位点 。那么fastqc是怎么检测adapter的呢？你去看看fastqc的GitHub，会发现它有这样的几个序列： 你可能会觉得很神奇，其实fastqc判断你的序列有没有adapter就是在和这几个序列做简单的匹配罢了。接踵而来的问题就是： 首先给答案： 听起来很离谱，画个图就清楚了： 果然，不能说完全相同，只能说一模一样，也就是说，现在市场上所有的Tn5转座酶都必须将这段序列连接到DNA的两端，这样才能让我们检测到adapter。 你可能还是不信，好吧，那再来一个其它的例子吧： 这不能说完全相同，只能说一模一样吧……总该信了？ 结束了上面的测试，你或许会发现一个问题： 那按这么说，是不是read1和read2的测序引物的3"端总是会有部分是一样的啊？一样的部分就是作为判断adapter是否存在的那条序列？ 你自己看看上面的那个图，不就知道了， 事实上就是这样。 最后，为了让你更信，我还把trim_galore的adapter序列也粘贴在这里，这不和fastqc的一模一样？原来纷繁复杂的illumina测序竟然这么统一！

illumina 双端测序（pair end） illumina测序的核心在于利用可逆终止的、荧光标记的dNTP进行边合成边测序（Sequencing-By-Synthesis, SBS ） Flowcell（流动池）是有着2个或8个lane（泳道）的玻璃板，每个lane可以测一个样本或者多样本的混合物，且随机布满了能够与文库两端接头分别 互补配对或一致 的寡核苷酸（oligos，P7和P5接头）。一个lane包含两列，每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）。 B站视频链接，讲的很详细： 【陈巍学基因】视频1：Illumina测序化学原理_哔哩哔哩_bilibili 1. 利用转座子（transposome）对双链DNA进行剪切以及接头（adapter）的连接 2. 接头连接成功后，利用低循环扩增技术在接头处进行修饰，分别在两端添加sequencing primer binding site1 / sequencing primer binding site2（即测序引物结合位点）、index1/index2以及我们称之P5和P7的寡核苷酸序列 下图是维基百科的示意图，详细一些。 注意： 关于index，也叫barcodes，因为一个lane可以同时测多个样品，为了避免混淆样品的read products，每种样品的DNA由一种index修饰，这样测序得到的reads都是具有index标记的，在测序结果中，依据之前标签与样品的对应关系，就可以获得对应样品的数据。而这里的 index1和index2是为了区分paired-end测序得到的双端reads 。 1. Flowcell上随机分布了两种不同的寡核苷酸序列，分别 与P5互补（即P5"），与P7一致（即P7） 。 2. 待测sequence通过P5与folwcell上的P5"序列杂交互补，以待测sequence为模板进行互补链（即reverse strand）的延伸，互补链的两端为P5"和P7"。 3. 接下来模板链被切断并洗下 Reverse strand的P7"与Flowcell上的P7杂交互补，进行链的合成，这就是我们所熟知的 桥式PCR 接下来合成的双链被解链，再分别与Flowcell上的接头杂交互补，延伸，解链，杂交，延伸，解链...如此重复35个循环 4. 桥式PCR完成后，使用NAOH将双链解链，并利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）对8-氧鸟嘌呤糖苷（8-oxo-G）的选择性切断作用，选择性地将P5"与链的连接切断， 留下与Flowcell上P7连接的链 ，也就是Forward strand。同时游离的3"端被阻断，防止不必要的DNA延伸 1. 测序引物（sequencing primer）结合到靠近P5的测序引物结合位点1（sequencing primer binding site 1）上，在系统中加入四种dNTP和DNA聚合酶。这里的dNTP有两个特点：它是有荧光基团标记的，每种碱基标记的荧光基团不一样；它的3"末端连了一个叠氮基，这个叠氮基能够阻断后面的碱基与它相连 因此在聚合酶的作用下，与Forward strand相应位置碱基配对的dNTP就会结合到新合成的链上，而由于叠氮基的存在，后面的dNTP无法继续连接。这时用水将剩余的dNTP和酶给冲掉，将Flowcell进行扫描，扫描出来的荧光对应的碱基的配对碱基即是该链该位置的碱基。同时在这个Flowcell上有成千上万个cluster也在进行同样的反应，因此一个循环就能同时检测多个样本（这也是高通量的核心所在）。这个循环完成后，加入化学试剂把叠氮基和标记的荧光基团切掉，进行下一个循环（碱基的连接、检测与切除）。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出，也就是Forward read 序列。 2. Index测序：所有循环结束后，read products 被洗掉，index1 primer与链上index primer1 结合位点杂交配对，进行index1的合成及检测 3. Index1测序完成后，洗脱测序产物。此时机器已通过荧光得到了index1的序列 4.Index2测序：Forward strand顶端的P5序列与Flowcell上的P5"杂交配对，进行index2测序。测序完成后洗脱产物 1. 洗脱index2测序产物后，以Flowcell上的P5"为引物，Forward strand为模板进行桥式扩增，得到双链 2. NAOH使双链变性为单链，并洗去已经测序完成的Forward strand 3. 类似的，readprimer2结合到靠近P7"的read primer binding site 2开始对Reverse strand的测序。测序完成后即可得到Reverse read序列。 前面介绍的都是paired-end的测序，而single-end测序方式是只将index，sequencing primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端，另一端直接连上P5/P7，将片段固定在Flowcell上桥式PCR生成DNA簇，然后单端测序读取序列

illumina测序的技术核心原理是相同的都是边合成边测序的方法，它的测序过程主要分为四步： 利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。 Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头（P5和P7），这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。 桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增(35X)。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。但PCR本身会造成的碱基错误也随之引进。 测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。这些dNTP的3"-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3"-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。 Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题 (Homopolymer错误)，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间。测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约为1周。 链特异性测序可以保留最初产生RNA的方向，目前最常用的dUTP 链特异性建库的方法首先利用随机引物合成RNA的一条cDNA链，在合成第二条链的时候用dUTP代替dTTP，加adaptor后通过 尿嘧啶DNA糖基酶 处理，将有U的第二条cDNA降解掉。尿嘧啶DNA糖基酶能够催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶，对RNA无活性，这样 最后的insert DNA fragment都是来自于第一条cDNA 因此，以dUTP链特异性建库方式测序RNA的结果中，R1文件中read的方向和基因的方向（正义链）是相反的，而R2文件中的read2 方向和基因的方向是相同的。 上样 flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，测序就在此进行。lane上随机分布两种接头， p5‘ （与P5互补）， P7 （与P7"互补），待测序列自带了p5接头和p7接头。序列只能一开始是利用p5接头互补，因为p7接头和lane是一样的。将构建好文库中的待测序列配置成一定的浓度通过flowcell，序列会在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，并与上面的短序列配对。上样的结果就是lane吸附住了冲过来的DNA，并且可以在表面进行桥式PCR扩增。要测序的是模版链p5 - p7，开始它与lane接头配对产生了互补链，后来强碱试剂作用下去杂，两条链被分开，由于模版链没有附着在lane上，模版链被冲走，但是互补链p5‘- p7‘ 依然稳稳固定在lane上。加入缓冲溶液，互补链的p7‘和lane上的p7互补（但还是一个lane中的），目的是快速扩增lane p7接头连接的链，也就是下图中的Forward Strand，它和模版链是一致的，后来测序的只用这一部分。PCR弯成桥状，一轮桥式扩增一倍，大约35个循环后，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，这PCR是一群完全相同的序列，叫做cluster。桥式PCR目的在于实现放大单一碱基的信号强度，满足后期测序需求。桥式PCR完成后，形成了很多的桥形的互补双链，再次强碱解链。这一次不再进行复制，而是利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）选择性的切掉lane 上p5‘ 连接的链，只留下了与lane p7连接的链即Forward Strand。 测序

陈巍学基因-illumina测序原理 官方-illumina测序原理 步骤： 一、sample prep（样本准备）：基因文库制备（一个基因组切断再加接头） 二、cluster generaton（簇的形成）：文库在测序芯片（流动池flowcell）上不断扩增，形成桥式PCR，再切掉反向链（reverse strand），形成许多簇相同的正向序列（正向链forward strand）。 三、sequencing（测序）：荧光信号、可逆阻断终止技术、Sequences-by-Synthesis 四、data analysis（数据分析） 一、基因文库： 二、桥式PCR：文库种到测序芯片，并进行扩增的过程。 测序芯片： 三、 双末端测序 ：即对正向链测序也对反向链测序。

flwocell是带有流通槽的玻璃滑块，是测序反应的载体，里面有8条lane。 lane是测序反应的平行泳道，是试剂添加、洗脱等过程的发生位置。 每一个lane里最小的单位叫做一个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）。 测序的结果就叫做一个reads，对双端测序来说，5"端reads叫reads1，3"端reads叫reads2。 https://www.bilibili.com/video/av13107081 样品准备就是在DNA fragments（片段）的末端添加adaptors（接头）。超声波将DNA分子打断成300-800bp长序列片段（人类基因组打成300-500bp），用酶补平为平末端，然后3‘端加一个A碱基（因为接头的3‘端有一个突出的T），再在两端加上互补配对的adapter，再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库。 每一个lane固定了两种不同的oligos（寡聚核苷酸引物）（垂直于lane），测序时，两种oligos中的一种和fragment上的adaptor互补结合，如下图所示： 再之后双链分子变性，原始模板（左）被洗去，右边链通过bridge PCR进行扩增。随后不断扩增，生成数百万个cluster，如下图： 测序从第一个测序引物primer的延伸开始，生成第一个read（读段）。每一个核苷酸都带有荧光标记。四种核苷酸带有四个不同的荧光标记，发射出特征性的荧光信号，这个专有过程叫sequencing-by-synthesis.循环结束后，生成的read product被冲掉，在生成下一个read。整个过程生成数百万个reads，代表所有的fragment。 https://www.bilibili.com/video/av9273946 这个视频的21分有讲双端测序的过程，自己写的过程里没提到第二条链怎么生成的。 测序后生成的文件为fastq格式，每4行为一个read，read第1行：空格左边（从红色的1开始）为ID信息，DJG8....为测序仪信息，后边数字代表是测序仪运行的第272次。空格右边为barcode信息，用于区分样品。第2行为测序结果序列信息。第4行为碱基质量值。

首先从原理上说，Illumina测序芯片是桥式扩增，形成“簇”，终止子法，双向测序；454是磁珠法扩增，利用聚合反应副产物PPi后续反应，得到荧光；ABI的SOLiD系统同样是磁珠法扩增，但利用的是连接反应（具体方法略显复杂）。 其次从性能上说，Illumina测序仪的通量极大，目前的HiSeq X已经达到1.6-1.8T；454则是读长最长（这三款）；ABI因为其连接反应测序的特点，其精度应该是最高的。 最后扒一扒他们的短儿，Illumina价格昂贵，尤其后期的极高通量的测序仪不是一般实验室能承受的。同时他们的仪器或许都有人看管，指定该类仪器只能进行某种生物样本的测序，当然其实性价比依然在；454的缺点，只在这三者中比的话，就是其同聚物准确度偏低；对于SOLiD，就是读长特别短，同时因为SOLiD的测序原理，测序系统都相对复杂，因此SOLiD系统不好升级，到了目前似乎已经很少听说SOLiD系统了。

文盲飘过。。。。。。

最主要的是技术的更新，另外还有一部分是市场的占有策略。1，测序技术的改进：全基因组主要应用的是illumina的Hiseq X10的测序平台，该平台在图片信息处理和flowcell上都有很大的改进（原来是平板上长簇，现在上面有小孔），另外在扩增的技术上也有一点改进（RPA扩增技术）。以上几点使得数据的通量大大调高。所以相应的测序价格也会降低。2，市场占有策略：这一点我个人理解比技术更新更重要，illumina的战略思路，占有测序市场。其实illumina的Hiseq X10的测序平台试剂要比其他平台的试剂便宜很多。不过这个平台签有协议，只能做人的全基因组重测序项目。

Illumina的、Roche的、ABI的，都是二代测序技术算是。也有一些号称为三代测序的技术，比如Pacific Biosciences的什么。主要特征是单分子测序。二代测序虽然快，但仍然需要扩增才有足够的量来测序。而扩增过程本身不同的基因会有一定的偏好性，做基因组没问题，但做转录组测序问题就有点突出了。三代号称都是不需要扩增，样品量极少就可以直接测的，感觉更准一样的。但实现上现在有很多问题，还不成熟。主要就是错读率还是有点高。Metagenome、转录组什么这些，这是这些高通量测序技术的应用而已。不管用什么高通量测序技术，几乎都可以做的。回复我个人认为 俗称的ABI，还是专指一代测序，那也是ABI最风光的年代。后来变成了Life Technologies，之后才有了Ion torrent 和proton。目前illumina的MiSeq 读长可以到2*300 bp， 大通量的HiSeq也能到2*150 bp。已经算很长的了。

1.测序原理依然是CG一直用的Sequencingbyligation(SBL)而非illumina家明显占优势的Sequencingbysynthesis(SBS)。虽然CG在前一段时间买了SBS的专利，但在这款测序仪上明显没有使用。28bp的读长应该是4个7mer连起来的长度。2.读长是28bp。50xcoverage一个WGS，每年10000个WGS，一个run跑8天来算的话，一个run的通量大概是32.8T，就数据量讲，绝对是测序仪中航母的体量的#当然占地面积更是#。准确度按照官方的话说应该是“unbelievableaccuracy”，大概错误率是1E-6这个级别，显然是比任何面试的测序仪正确率都远远要高。但是请不要忽略了CG这台测序仪的读长只有28bp，而请考虑把illumina的读长从250bp和150bp砍到28bp再比较正确率的情况。3.1先说优势。数据产量巨大，因而单位成本一定很低，适合做人类基因组的重测序。CG打从出生就标榜是“人类基因组重测序的最佳测序平台”。28bp的读长，复杂度低的“人类”基因组（或是外显子组）处理起来尚且算是得心应手。28bp只能做重测序，组装什么的还是撸撸睡吧。而对于NIPT以及类似的技术，测序过程就是“堆砌数据量”，仅需检测拷贝数变化而不关注覆盖度和SNP水平的变异，CG这款新机器可能是非常好的选择（我不是很确定的是，28bp这个长度是否可能对大规模混样而需要许多复杂度较高的barcode什么的造成一定的麻烦）。而类似于未来的面向肿瘤无创早起筛查的游离肿瘤细胞（ctC）检测，游离肿瘤DNA（ctDNA）检测，以及面向产前胎儿基因组测序的胎儿有核红细胞（FNRBC）检测，所测绝大部分数据将是无用数据，CG这种“数据不要钱”的平台的优势可能就会显现。不就是堆数据量么，咱在行。3.2劣势嘛，数据量太大也是一个劣势——凑不满run，一般人根本跑不动。参考HiseqX尴尬的现状。然后读长是硬伤，所以除了“人类”“重测序”以外，几乎没法应用于别的领域了（熊猫那种比人类基因组复杂度还要远低的大概还是可以啦）。以及28bp对pooling时barcode的影响，表示略担心。其他的，参考CG以前的机器，其运行稳定性是个考验，毕竟8天时间不短，反应量数据量都巨大，不知道会不会很容易需要“售后”。

Illumina的测序仪是以flowcell进行测序的，一般的一张flowcell是一个run，像Hiseq2500的话是2张flowcell，也就是一次运行的测序量。每张flowcell上通常都有多个通道，每个通道可以单独测不同的样品，这样的通道就是lane。Hiseq2500的一张flowcell有8条通道，也就是8个lane。如果上机前使用cbot的话可以每条lane都跑不同的样品，互不干扰，如果直接上机进行快速模式的话就无法区分不同样本了。

illumina 的接头是两头都接上,illumina测序中有成簇这一步,需要两头接头 不过illumina测序分为单端和双端,单端的话虽然接了两个接头,但是只有一个接头有测序引物.双端测序双端都有测序引物.

lane表示测序芯片上的一条流通槽,测序文库与试剂均在里面,测序信号的扫描也是按照一条lane上的一个tile进行. run翻译成中文是运行的意思,这里也是这个意思,就是机器运行一次的意思.

<meta charset="utf-8"> FASTQ文件在Illumina下通常会被命名为 SampleName_S1_L001_R1_001.fastq.gz 比如 NTC_S11_L001_R1_001.fastq.gz 其被下划线_分为了五个部分： 第一部分：SampleName，样本名，与上机时在Sample Sheet中填写的一致 第二部分：S1，S* ，S后跟的数字与样本在Sample Sheet中的顺序一致，从1开始。不能分配到确定样本的read会归到S0（Undetermined_S0） 第三部分：L00 ，泳道lane的编号 第四部分：R，R1表示read1，R2表示read2。R1和R2为paired end reads。同一个样本的配对的FASTQ，只有这个地方不同 第五部分：001，通常为001 Each entry in a FASTQ file consists of four lines: u2022 Sequence identifier u2022 Sequence u2022 Quality score identifier line (consisting of a +) u2022 Quality score Sequence identifier @<instrument>:<run number>:<flowcell ID>:<lane>:<tile>:<x-pos>:<y-pos><read>:<is filtered>:<control number>:<index sequence> eg: Quality score The character "!" represents the lowest quality while "~" is the highest. Here are the quality value characters in left-to-right increasing order of quality (ASCII):

illumina的平台所用的片子叫做flow cell，一各flow cell有8个lane（这8个lane是相互独立的）。一各flow cell叫一个run。也就是说一各run包括8个lane。

illumina的接头分叉是因为避免接头一直连接，另外在上flowcell的时候，两个接头需要和芯片上的olgo探针杂交，需要两头不一样的序列，所以illumina的接头为Y结构。

歌名：Please演唱：StaindCan"t you see that I"m sick of this?Chances are you"re obliviousTo how I feel, Sitting on your throneAnd I"m sure that I"m not alone,not alone, not aloneTell me please, who the fuck did you want me to be?Was it something that I couldn"t see?Never knew this would be so politicalAnd please, I"m still wearing this miserable skinAnd it"s starting to tear from withinBut it"s obvious that doesn"t bother youSo pleaseI didn"t think that you"d sell me outNow I know what you"re all aboutYou might feel in control of thingsBut you"re not holding all the strings,all the strings, all the strings...Tell me please, who the fuck did you want me to be?Was it something that I couldn"t see?Never knew this would be so politicalAnd please, I"m still wearing this miserable skinAnd it"s starting to tear from withinBut it"s obvious that doesn"t matter to youI swallowed all your answers;I"ve swallowed all my prideYou"ve used up all your chances,To keep this all insideTell me please, who the fuck did you want me to be?Was it something that I couldn"t see?Never knew this would be so politicalAnd please, I"m still wearing this miserable skinAnd it"s starting to tear from withinBut it"s obvious that doesn"t bother youSo please, don"t keep telling me that it"s okayI don"t buy all the shit that you sayAnd quite honestly I"m fucking sick of itSo please, if I cut off this nose from my faceThen I wouldn"t feel so out of placeBut it still wouldn"t be quite enough for you,So please(End)http://music.baidu.com/song/7516387

可能是你的pcr比较短，一个测序反应就可以了，同时你没有要求测通，因为由于测序原理的原因，从测序引物开始的前几十个碱基是不准或者测不到的，所以如果想知道一个pcr的全部序列就需要一对引物进行双向测序，另一条引物可以是你的扩增引物也可是根据已测序列设计的反向引物。

资本是什么？资本就是拿着本金，通过投资获得利润。资本永远是贪婪的，追求年复一年不断增长的投资回报率。无论是基因检测市场，还是任何一个非国家完全控制的市场，资本都在推动它的运转和发展。 通过前一章的介绍，可能大家都注意到了，我在提及测序的时候，就已经提到了两家公司，罗氏，和Illumina。那么，我就从这两家公司的发展历程为切入点，探究资本在临床检测市场上发挥的作用。 测序巨头 Illumina 在2000年前后，经济发达的美国，随着人类基因组计划步入尾声，大家对基因的了解越来越深入，股市刮起了一阵“基因检测”概念的狂热，大量投资涌入，人人都想在这个领域分一杯羹。 Illumina早在1998年便已经成立，最早就是一家空壳公司，创始人也不是科技天才，连公司要做什么产品都没思路。但是不得不说，创始人的眼光和定力还是很不错的，在2000年，招募了Jay Flatley来做产品研发。Flatley本身是医学博士，来Illumina之前把自己创办的公司“分子动力”卖了三个亿。所以可以看出这个人，不仅懂技术，还颇有商业变现头脑。 Jay Flatley的加入，为Illumina注入了完全不同的动力，他非常看好测序仪市场的广阔前景，并提出了大家后来都很熟悉的一句话， “把测序成本降到1,000美元以下” 。 这句话，Illumina的员工听到了，投资者听到了，同行也听到了。成本，是当时阻碍测序市场规模的最大障碍。所有人都听得出，成本降低意味着市场规模的扩大，因为这两样事情是成反比的。测序仪就和电脑、空调、冰箱一样，只有普通家庭消费得起的，才是资本喜欢的大蛋糕。 诊断巨头 罗氏 罗氏，成立于1896年，没错，已经有120多年的历史了，老资本主义企业了。经历过一战和二战，最早是做制药，从19世纪的消毒剂、止咳糖浆，到20世纪的维生素、镇定类安眠药。罗氏经历过各种风风雨雨，简言之每一任领导人都非常注重研发，善于将科研成果进行商业化，罗氏出资建立的纳特利分子生物学研究所和巴塞尔免疫研究所，其中不乏诺奖级的研究成果。 罗氏布局诊断行业，始于20世纪60年代末，随后第五代领导Gerber，通过一系列壕气收购，确定了罗氏的四大核心业务，即制药、诊断、维生素、香水。

在准备NGS文库的时候，会有用到转座酶Tn5， Nextera DNA Library Preparation Kit ，比如ATAC-seq就有用到这个Tn5。转座酶携带有特定的序列称为 转座子Transposon 。 下面是ATAC-seq的工作原理，想必听说过ATAC-seq的，对这个图都会再熟悉不过了。 Tn5是kit里面带有的，没什么大不同。ATAC-seq 的barcoded primers （adaptors）会有一些不同，接下来，看下图中的每段序列对应的sequnce都是什么。 下面图例，Nextera tn5用来给基因组DNA加adaptors。 下面的图片就是准备ATAC-seq时候需要用到的index primer （adaptor），和Nextera DNA library prep kit里的有一点类似，但是也很不同。Ad1_noMX是Forward 引物，没有index （barcode），所以只有一个。Reversed引物有24个Ad2.（1-24），所以有24组不同的index （barcode）序列。这个index序列是和Nextera一样的。我涂红色部分就是index序列的反向反义序列，每个index序列是不同的8个碱基，这个和Nextera的i7（部分一样，请自己对照）是一样的。 i5 sequence: ATAC-seq的Adaptor1 里没有barcode i7 sequence: 有两种Adaptors，分别为Adaptor1 （50bp） 和Adaptor2 （53bp）。 其中Adaptor1（5" illumina Primer1 sequence （29bp）+ Tn5 Read1 sequence（14bp）（再延伸到ME里面7bp）3"），Adaptor2（5" illumina Primer2 sequence（24bp）+ barcode sequence （8bp）+ Tn5 Read2 sequence （15bp）（再延伸到ME里面6bp）3"） 这样算来，ATAC-seq library的长度=左面（Adaptor1 长度 +剩余部分Tn5的ME（12 bp_TATAAGAGACAG））+ open chromatin 的DNA长度+右面（剩余部分Tn5的ME（13bp_GTATAAGAGACAG）+ Adaptor2 长度）=open chromatin 的DNA长度 + 128bp。 所以，在ATAC-seq的libraries中 mono nucleosome的ATAC-seq library长度大概是(单核小体146bp+核小体free region)+两端的adaptor及Tn5最里面部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=274bp+free region，也就是bioanalyzer里面看到的第二个peak。图中显示大概是340bp左右。所以free region应该是330bp-274bp=56bp 。 那么会问，对不对呢？看下bioanalyzer的第一个peak，显示是182bp，这个peak代表的是nucleosome free region的ATAC-seq library，所以是nucleosome free region序列长度 + 两端的adaptor及Tn5部分ME序列长度（50bp+12bp+13bp+53bp）=182， 所以，不难得出同样的结果，nucleosome free region序列长度是54bp。差不多哦 以此类推，第三个peak代表de-nucleosome ， 500bp到550 bp之间，是不是等于两个核小体长度加上核小体空隙序列再加上两个adaptor， 2 146bp + 2 55bp + 128bp= 530bp （为什么55bp也要乘2？答：多出来一个核小体当然就多出来一份核小体空隙） nucleosome free region, mono-nucleosome, de-nucleosome and try-nucleosome “GAP不是服装品牌，而是个坑”。 所以需要在PCR第一步，需要5min的72摄氏度来填坑。 还要注意，就是在tagmentation的时候会出现三种产物，上面的图只是其中一种。 哪里说的不对欢迎纠正，请留言。 参考： http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/Transposon_Tn5 http://nextgen.mgh.harvard.edu/attachments/Nextera%20Protocol.pdf https://teichlab.github.io/scg_lib_structs/SMART-seq_family.html http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/ez-tn5-transposase.pdf?sfvrsn=4

BaseSpace is Illumina"s genomics cloud computing environment for next-generation sequencing (NGS) data analysis. Now biologists and informaticians can easily and securely analyze, archive, and share sequencing data. NGS data analysis is simplified and accelerated with push-button tools. Cumbersome and time-consuming data transfer steps are eliminated. Productivity is improved. 摘自illumina官网。BaseSpace就是云计算环境了。具体你去官网查查吧！竟然在百度问这么专业的问题，厉害！

链特异性转录组测序（strand-specific RNA sequencing）是指在构建测序文库时，利用Illumina高保真Taq酶将mRNA链的方向信息保存到测序文库中。测序后的数据分析可确定转录本是来自正义还是反义DNA链。与普通转录组测序相比，它更能准确地统计转录本的数量和确定基因的结构，同时可以发现更多的反义转录本，目前被广泛地应用于研究基因结构和基因表达调控等领域范围。

Illumina的测序仪是以flowcell进行测序的，一般的一张flowcell是一个run，像Hiseq2500的话是2张flowcell，也就是一次运行的测序量。每张flowcell上通常都有多个通道，每个通道可以单独测不同的样品，这样的通道就是lane。

我靠，大哥，你是做小麦基因组的吗？哪个实验室啊？膜拜啊，这么复杂的基因组。L50指的是N50序列的长度。

1985年，美国人凯利·穆利斯开创了聚合酶链式反应，也就是PCR，用来快速富集DNA。这一天才idea从诞生之日，便改变了整个分子生物学的发展进程。“设计引物→提取核酸→上机扩增→跑胶”，成了众多生物科研狗的日常。分子生物学甚至因此被称之为“凝胶上的科学”。 基于PCR开发的技术，包括RT-PCR、ddPCR、光PCR等等，正在全世界无数的实验室帮助科研人员理解、挖掘分子层面的生物学奥秘。比如目前最常用7500，无论是高校、医院、第三方检测机构，基本都用得到它。 花开两朵，各表一枝，测序技术的发展要比PCR坎坷很多。 NGS，即Next Generation Sequencing，下一代测序技术，又称二代测序，高通量测序，鉴于基因测序发展过程复杂，我简单分为几个阶段，并不严谨，望各位海涵。 第一阶段 天降猛男 提起测序，不得不提测序行业的鼻祖，天降猛男---弗雷德里克·桑格，测定第一条蛋白质序列和第一条基因序列，并因此两获诺奖的男人。 第二阶段 通量为王 2005年，生命科学公司推出了基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，即454焦磷酸测序, 开创了第二代测序技术的先河。 ABI和Illumina也不甘落后，相继推出各自的高通量测序仪。第二代测序技术成为了近十几年来，科研中最常用的测序技术，越来越多物种的全基因组图谱被绘制，各种GWAS研究，千人基因组计划，TCGA计划，极大的推动了生物学对临床的指导意义。 从花费十年耗资30亿美元的人类基因组计划，到如今基因组测序成本降至千元以下，这十余年的发展不可谓不迅猛。测了这么久的全基因组，学术界的主要矛盾也逐渐发生了改变。大家发现，NGS虽然好，但是烧钱啊，再测下去教授的裤衩都没了。为了几篇nature，science，把家底都赔上好像也不是很划算。有没有那种通量高、价钱低、对临床还有价值的技术啊？ 第三阶段 剑指临床 经历过第二阶段的洗礼后，课题组的教授们学聪明了，不烧钱了，也没钱可烧了。大家开始心有灵犀的搞靶向测序，甚至还有白嫖的（数据挖掘）。 这第三阶段的，我以2013年为分水岭，因为这一年罗氏关闭了454测序业务，454焦磷酸测序仪逐步退出市场。 同样在2013年，Illumina收购了Verinata Health 、Advanced Liquid Logic、NextBio三家公司。这三家公司专注的技术领域分别为繁殖和遗传健康、微流样品处理以及基因组信息学。 经此一年，Illumina完成了产业链的整合，以测序仪生产为核心，并将触手伸向下游的测序数据分析服务。 旧王已死，新王当立。 到2016年，Illumina已垄断全球测序仪器市场超过70%，而当年欲收购Illumina的罗氏，仅占市场10%的份额。 因为Illumina深知测序只是开始，最终，他们面对的是一个更加广阔的检测市场，客户想要的不是简简单单ATCG的排列组合就完事了，而是具有临床意义的遗传风险、用药指导、甚至是液体活检。

二代测序就是一种技术，不过测序原理分几种，一种是illumina的边合成边测序原理，目前使用最多，还有就是life的h离子转换ph的测序方法。现有的技术平台主要包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Sol-exa GenomeAnalyzer、Helicos BioSciences公司的HeliScopeu2122 Single Molecule Sequencer、美国Dana-her Motion公司推出的Polonator；以及连接法测序 (sequencing by ligation)，即通过引物来定位核酸信息，技术平台有Applied Biosystems/SOLiDu2122 system。扩展资料：第二代测序技术的背景：1、DNA测序技术：长期以来，DNA测序技术一直是分子生物学相关研究中最常用的技术手段之一，从一定程度上推动了该领域的快速发展。人类基因组计划、转录组分析、微生物基因组重测序、单核苷酸的多态性 (single nucleotide polymorphisms,SNP) 分析等方面也促进的其他生物学领域的研究和发展。每一代测序技术的更替都标志着生物学中基因芯片、数据分析、表面化学、生物工程等技术领域有了新的突破，从而应用在了测序领域，大大降低了测序成本，提高了测序效率，使测序向着高通量、低成本、高安全性和商业化的方向发展2、第一代DNA测序：尽管第一代 DNA 测序技术以其可达 1000 bp 的测序读长、99.999% 的高准确性帮助人们完成了大量的测序工作，但其测试速度慢、成本高、通量低等方面的不足，也致使其不能得到大众化的应用。随着科学技术的进步以及科研人员对测序技术的努力开发，2005 年 Roche 公司发布的 454 测序系统标志着测序技术跨人高通量并行测序的时代。第二代 DNA 测序技术又称大量并行测序技术 (massive parallel sequencing,MPS)、高通量测序技术(high—throughput sequencing,HTS)，以低成本、99% 以上的准确度，1次可对几百、几千个样本的几十万至几百万条 DNA 分子同时进行快速测序分析。这一时期的代表技术有 Roche 公司的 454、Illumina公司的 Solexa、ABI公司的SOLID，由于该时期的测序技术十分前沿，因而市场主要被这三家公司所垄断

肺癌治疗可望有新契机　国卫院找到癌细胞转移关键新研究：盐分摄取过多，罹患阿兹海默症机率大增「百草之王」高丽参　研究：助身体抗环境荷尔蒙肝癌主要治疗方法　射频消融后肿瘤未复发 卫生福利部财团法人国家卫生研究院宣布，将启动一项以全基因体及全外显子定序为基础，以在2025年纳入台湾健康照护体系做为目标的先导计画。国卫院自2017年起在科技计画经费的补助下建立高通量基因体定序的核心能力，先导计画将于2020年底为病人及家属完成10,000个基因体定序。为了加速该项专案的进行，国卫院将与Illumina公司建立伙伴关系，共同开发有效营运之基础架构，包含基因体数据管理和分析服务，这将是后续其他领域合作者及第三方参与之基础。 计画可建立大数据平台　促进本土生技产业发展 国卫院分子与基因医学研究所特聘研究员蔡世峯博士表示，由于台湾许多医院已在使用基因检测， *** 正在拟定全国性的策略来协调整合相关的数据或流程，并且确保在健康医疗体系大规模使用的一致性。G2020群体基因体学先导计画为国卫院执行之「亚太生医矽谷精准医疗旗舰计画（旗舰计画）」的扩大与延伸。「台湾 *** 透过旗舰计画，支持G2020之执行，主要目标有两个：第一，建立量产规模，具品质认证的基因体定序设施，以执行族群基因体学计画，并在亚太地区实施精准医疗。第二，建立大数据平台，做为学界及业界参与者的基因体与健康数据之交流，以促进健康照护的创新，以及本土生技产业之发展。」 国卫院梁赓义院长表示，旗舰计画已经完成2,000个罕见疾病及癌症病人的基因体定序，此为G2020先导计画的一部分，我们将会扩展到10,000个全基因体定序，为基因体定序在台湾患者在健康照护的临床使用上奠定基础。 梁赓义院长同时说，「透过G2020之执行，我们将建立首家获得ISO认证的基因体检测实验室，以提供临床等级的基因体检测结果，并整合到台湾医疗体系的数据架构中。」 Illumina将与国卫院开发和实施针对族群基因体学「营运架构」 做为合作伙伴，Illumina将与国卫院开发和实施针对族群基因体学的「营运架构」，利用各种仪器、基因体文库的制备、资讯产品所组成的综合解决方案，做为G2020先导计画执行的基础架构。Illumina与国卫院该项合作的关键项目为「资讯科学」，Illumina将推展其分析平台(Illumina Analytics Platform)和终端使用者应用工具（例：DRAGEN,BaseSpace），以强化基因体数据交换，确保数据使用之安全性，有效链结基因体与eHealth数据，提供临床、研究及业界团体不同用途之使用。 Illumina产品开发资深副总经理Susan Tousi表示，Illumina已投入资金来开启基因体在医疗上的应用，并且与此一领域之领导者或大型计画，例如GA4GH联盟，共同合作，和Illumina内部的族群基因体部门共同合作，透过基因体和eHealth数据之广泛交流以及反复使用，将可取得更多的证据来支持基因体学在医学上的应用潜能与产业价值。 话题： Illumina, 国家卫生研究院

聊一聊最常用的二代测序那些事： 转录组分析进阶 20170319-第01期-Illumina测序原理 主要是看一下 ： 备注：黑色区域为P7；红色区域为P5;假设P5->P7 为正向 图示如下： u200b adapter在中文是适配器或者接口的意思，在前面的内容中已经提到将测序序列打碎成片断后要将末端补平然后添加adapter，用于与flowcell上的oligo匹配固定并为后续桥式PCR做准备，而前面提到的Index与adapter之间的位置关系一般为adapter1-Index-fragment-adapter2，adapter2通过与oligo互补连接在flowcell上，在进行完桥式PCR之后进行测序时，添加primer，这一段primer的序列是与Index互补的而非adapter1，所以最终拿到的测序结果应该是Index+fragment+adapter2或者Index+部分fragment ： u200b u200b 我们知道samplp index (单端index)：一条lane能测得的数据量在30G左右，而一个样品的测序量一般不会这么大，所以在建库的时候对每一种样品的接头加上不同的标签序列，这个标签就叫做Index，有了index就可以同时在一个lane中测多种数据了，后期可以根据index将数据分开 . u200b 某些时候我们也需要组合的双端标记 ：对low_input signal cell sequencing(如signal cell ChIP-seq 建库)过程中需要双端index （CDI 组合方法/UDI ）进行标记，进行区分不同细胞;对于droplet 技术，通过Barcode 进行区分就好。 u200b 如下图：DNA insert 两侧添加了i7/i5 接头，所以read 上会有index信息。 如CoBATCH 实验流程：由于Tn5 一般为8bp 序列，但做T5/T7 的barcode 只有1-2百种，不是2**8（需要满足一定条件的碱基，才可以单作barcode），需要采用的i5 /i7 的排列组合进行标记细胞。 u200b 目前有各种各样的seq技术，大多是建库方法不一样，测序过程绝大多数对DNA测序，单端及其双端两种。目前来看单端数据比双端价格便宜，尽量的选择双端测序，想想测序就是为了进行比对，单双端比对差异可以理解成： RNA-seq几乎都是双端测序，去除小RNA（数据长度比较短，单端就可以测通）；ChIP-seq 对DNA 进行比对，不存在可变剪切问题，单端数据应该是可以的，一般来说序列长度大于30bp 就可以比较精确度定位到human 基因组了。 u200b rTn5转座酶是野生型Tn5转座酶的高活性突变体，可以高效的将Tn5转座子插入到目标序列。Tn5转座酶识别Tn5转座子酶序列的内端（insideend，IE）、外端（outsideend，OE）和嵌合端（mosaicend，ME）序列，含有ME序列片段的体外转座效率最高。rTn5转座酶的插入位点具有很高的随机性，因此被广泛的用于体外转基因（外源基因整合到宿主细胞）和二代测序建库等领域。 u200b rTn5转座酶可以将含有成对识别序列的双链DNA片段（如下图所示）随机整合到宿主细胞的基因组中。整合的过程分为两步：首先，rTn5转座酶同含有选择标记和识别序列的目标基因片段结合，形成转座体（Transposome）；之后，通过转化的方式将转座体导入宿主细胞，利用选择标记筛选成功整合目标基因的宿主细胞。 u200b 当 s5 s7 在片段的两端，在后续步骤能够被有效扩增 . 当下应用最火热的是10X Genomics公司的解决方案 10x genomes 有10万个barcode,一般一个细胞存在1个barcode.通过barcode 进行拆封read，也存在一个barcode 对应了多个细胞，最好少于1万个细胞。也可以进行跨物种分析，查看collusion 比例。 10X分析单细胞表达 一个细胞大约有40000-80000个UMI,平均一个基因有10个UMI,进而进行分析. 5"- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT ACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN -3" 5"- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT ACATrGrG +G -3" 5′- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT -3′ 5"- AGATGTGTATAAGAGACAG -3" 5"- <u> TCGTCGGCAGCGTC </u> -3" 5"- GTCTCGTGGGCTCGG -3" 5"- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC -3" 5"- * CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT* -3" 5"- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [8-bp i5 index]<u> TCGTCGGCAGCGTC </u> -3" 5"- * CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT* [8-bp i7 index] GTCTCGTGGGCTCGG -3" 5"- <u> TCGTCGGCAGCGTC </u>AGATGTGTATAAGAGACAG -3" 5"- CTGTCTCTTATACACATCT CCGAGCCCACGAGAC -3" 5"- GTCTCGTGGGCTCGG AGATGTGTATAAGAGACAG -3" u200b scit-ChIP-Seq 建库策略： Truseq library preparation method for low-input and single-cell itChIP . a, Overview of the design of mosaic Truseq library preparation for a sequencing using Illumina"s standard recipe. T5 and T7 barcodes are introduced during barcoded Tn5 tagmentation to distinguish between single cells. PCR indexes are introduced during the 2nd PCR to separate itChIP libraries. The resulting libraries are sequenced by PE150 on Novaseq 6000 or Hiseq X-Ten platforms (Illumina). nt, nucleotides u200b 意思说：通过Tn5 进行加入标签来区分不同细胞；再通过1st PCR 加入序列扩增引物；再通过2st PCR 加入测序接头: (有没有发现和smart-seq2 P5/P7 接头序列非常相似，可能illumia测序都用的这种测序接头) P5( 5"- AATGATACGGCGACCACCGAGATCT -3" ) P7( 5"- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -3" ), PCR index(和普通的建库index一样可能，单index 用于标记lane中多个文库；而不是用单index 区分细胞)

Q1：mRNA高通量测序，选择Illumina HiSeq 2000平台。Q2：样本有混杂，不能期望后期数据分析来除杂。

他们是两家不同公司的测序平台1.原理illumina的Hiseq2000和454都是通过单序列的扩增放大信号，只是Hiseq2000中间有桥式扩增，可以两头测序。测序长度来讲，Hiseq2000一般为1X100和2X100的模式，而454平均500bp左右，最长700左右，测序准确度来讲Hiseq的测序准确度稍高一些，454由于在测序的过程每次是加一种碱基，所有如果是单碱基重复，比如AAAA，那么区分几个A的准确性就会下降。2.数据分析和应用方向数据分析相差不大，只是不同的软件，应用方面两者各有优势，Hiseq2000数据适应性更高。454一般是宏基因组种群丰度测序上应用更好一些，不过illumina也有MIseq代替。3.通量和价格HISEQ2000的通量要高一些，价格比454便宜很多。综合来讲454现在应用面比较窄了，所以在市场上现在也慢慢被代替掉了。现在耗材和试剂也很快就停服务了。不过Hiseq现在市场上也都2500居多了，并且现在也有新的的技术更新的3000和4000。说实话现在Hiseq2000也很少了。

他们是两家不同公司的测序平台1.原理illumina的Hiseq2000和454都是通过单序列的扩增放大信号，只是Hiseq2000中间有桥式扩增，可以两头测序。测序长度来讲，Hiseq2000一般为1X100和2X100的模式，而454平均500bp左右，最长700左右，测序准确度来讲Hiseq的测序准确度稍高一些，454由于在测序的过程每次是加一种碱基，所有如果是单碱基重复，比如AAAA，那么区分几个A的准确性就会下降。2.数据分析和应用方向数据分析相差不大，只是不同的软件，应用方面两者各有优势，Hiseq2000数据适应性更高。454一般是宏基因组种群丰度测序上应用更好一些，不过illumina也有MIseq代替。3.通量和价格HISEQ2000的通量要高一些，价格比454便宜很多。综合来讲454现在应用面比较窄了，所以在市场上现在也慢慢被代替掉了。现在耗材和试剂也很快就停服务了。不过Hiseq现在市场上也都2500居多了，并且现在也有新的的技术更新的3000和4000。说实话现在Hiseq2000也很少了。

ABI公司在双脱氧法测序的基础上进一步开发出荧光标记的双脱氧法测序试剂盒（BigDye试剂）。接着再结合毛细管电泳生产出“ABI3730”和“ABI3500”等测序仪。 原理： 双脱氧法测序的第一个核心技术就是在用DNA聚合酶合成DNA链的过程中掺入双脱氧核苷酸（ddNTP）。 天然DNA组成元件是单脱氧核苷酸（dNTP），其糖基的3"和5"位各有一个羟基，5"位的羟基连接到上游的磷酸基团，不断重复，形成一条DNA骨架链。 Sanger的方法就是用化学合成的方法合成出3位"没有羟基的核苷酸，这就是双脱氧核苷酸。 BigDye试剂包括四种荧光标记的ddNTP，dNTP，DNA聚合酶，镁离子，PH缓冲液等。 反应得到的一系列不同长短的DNA片段经过纯化后，去掉游离的荧光ddNTP单核苷酸，上机测序。 超声波将DNA分子打断成300-800bp长序列片段（人类基因组打成300-500bp），用酶补平为平末端，然后3‘端加一个A碱基（因为接头的3‘端有一个突出的T），再在两端加上互补配对的adapter，再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库。 flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，测序就在此进行。上面构建好的文库中的待测序列事先配置好一定的浓度，经过这里的时候，会在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，与上面的短序列配对。上样的结果就是lane吸附住了冲过来的DNA，并且可以在表面进行桥式PCR扩增。 第一轮扩增模版： flowcell表面固定的序列 --> 模版链 去杂： 加入NaOH强碱性溶液使双链DNA变性，互补链由于和lane上短序列强力连接固定住了；模板链失去了双链氢键连接，好似悬空，它会被洗脱 **桥式形成： **加入缓冲溶液，互补链的p7‘和lane上的p7互补（但还是一个lane中的）就像下图这样（摘自illumina官网）目的是快速扩增lane p7接头连接的链，也就是下图中的Forward Strand，它和我们的模版链是一致的。我们后来测序只用这一半 illumina采取了“一次加一个荧光碱基，用完失效”的办法确定cluster的碱基排序顺序。 一轮测序是这样完成的： 双端测序之Forward Strand ： 先是primer结合到靠近p5的sequencing primer binding site1上，再加入特殊的dNTP【它的3‘ 羟基被叠氮基团替代，因此每次只能添加一个dNTP；还含有荧光基团，能激发不同颜色】；在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉；再加入激发荧光缓冲液，用激光激发荧光信号，光学设备记录荧光信号的记录，计算机将光学信号转化为测序碱基。 再向下一轮： 再加入化学试剂淬灭荧光信号并使dNTP 3" 叠氮基团变成羟基，这样能继续向下进行再加一个，并且保证这个不再发出荧光。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出。得到了Forward Strand序列。 Index测序： 上面的循环结束后，read product被冲掉，index1 primer和链上的index1 互补配对，进行index1的检测。测完后，洗脱产物，得到index1 的序列。接下来p5与lane上的p5‘配对，测得了index2，并洗脱。 双端测序之Reverse Strand： 洗脱掉index2 产物后，还是一个桥式扩增，得到双链，再变性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去测完的Forward strand。然后和测Forward一样，也是先连接primer，只是连接的位点是Primer Binding Site2，测完后得到reverse strand序列。 single-end 只将index，Primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端，另一端直接连上P5/P7，将片段固定在Flowcell上桥式PCR生成DNA簇，然后单端测序读取序列。

tags： Trimmomatic NGS fastq NGS 原始数据过滤对后续分析至关重要，去除一些无用的序列也可以提高后续分析的准确率和效率。Trimmomatic 是一个功能强大的数据过滤软件。 Trimmomatic 发表的文章至今已被引用了 2810 次，是一个广受欢迎的 Illumina 平台数据过滤工具。其他平台的数据例如 Iron torrent ，PGM 测序数据可以用 fastx_toolkit 、NGSQC toolkit 来过滤。 Trimmomatic 支持多线程，处理数据速度快，主要用来去除 Illumina 平台的 Fastq 序列中的接头，并根据碱基质量值对 Fastq 进行修剪。软件有两种过滤模式，分别对应 SE 和 PE 测序数据，同时支持 gzip 和 bzip2 压缩文件。 另外也支持 phred-33 和 phred-64 格式互相转化，现在之所以会出现 phred-33 和 phred-64 格式的困惑，都是 Illumina 公司的锅（ damn you, Illumina! ），不过现在绝大部分 Illumina 平台的产出数据也都转为使用 phred-33 格式了。 Trimmomatic 过滤数据的步骤与命令行中过滤参数的顺序有关，通常的过滤步骤如下： 由于 Trimmomatic 过滤数据的步骤与命令行中过滤参数的顺序有关，因此，如果需要去接头，建议 第一步就去接头 ，否则接头序列被其他的过滤参数剪切掉部分之后就更难匹配更难去除干净了。 在 SE 模式下，只有一个输入文件和一个过滤之后的输出文件： -trimlog 参数指定了过滤日志文件名，日志中包含以下四列内容: 由于生成的 trimlog 文件中包含了每一条 reads 的处理记录，因此文件体积巨大（GB 级别），如果后面不会用到 trim 日志，建议不要使用这个参数。 在 PE 模式下，有两个输入文件，正向测序序列和反向测序序列，但是过滤之后输出文件有四个，过滤之后双端序列都保留的就是 paired ，反之如果其中一端序列过滤之后被丢弃了另一端序列保留下来了就是 unpaired 。 其中 -phred33 和 -phred64 参数指定 fastq 的质量值编码格式，如果不设置这个参数，软件会自动判断输入文件是哪种格式（v0.32 之后的版本都支持），虽然软件默认的参数是 phred64，如果不确定序列是哪种质量编码格式，可以不设置这个参数。 PE 模式的两个输入文件： sample_R1.fastq sample_R2.fastq 以及四个输出文件： sample_paired_R1.clean.fastq sample_unpaired_R1.clean.fastq sample_paired_R1.clean.fastq sample_unpaired_R1.clean.fastq 通常 PE 测序的两个文件，R1 和 R2 的文件名是类似的，因此可以使用 -basein 参数指定其中 R1 文件名即可，软件会推测出 R2 的文件名，但是这个功能实测并不好用，因为软件只能自动识别推测三种种格式的 -basein : 建议不用 -basein 参数，直接指定两个文件名（R1 和 R2）作为输入。 输出文件有四个，当然也可以像上文一样指定四个文件名，但是参数太长有点麻烦，有个省心的方法，使用 -baseout 参数指定输出文件的 basename，软件会自动为四个输出文件命名。例如 -baseout mySampleFiltered.fq.gz ，文件名中添加 .gz 后缀，软件会自动将输出结果进行 gzip 压缩。输出的四个文件分别会自动命名为： 此外，如果直接指定输入输出文件名，文件名后添加 .gz 后缀就是告诉软件输入文件是 .gz 压缩文件，输出文件需要用 gzip 压缩。 每一步的过滤如果需要多个参数，通常用冒号 : 将各个参数隔开，当然参数的先后顺序是有要求的。 从名字可以看出，这一步是为了去除 illumina 接头的，这个软件其实就是专为 illumina 平台数据而设计的。 为了更好理解测序 reads 中为什么会有引物和接头序列，我画了一个文库加上接头之后的结构示意图，也把引物结合部位大概标了出来： 这个文库结构示意图理解之后就容易理解测序过程了。 去除接头以及引物序列看似简单，但需要权衡灵敏度（保证接头和引物去除干净）和特异性（保证不是接头和引物的序列不被误切除），由于测序中可能存在的随机错误让去接头这样一个简单的操作变的复杂。 虽然理论上接头序列和引物序列可能出现在 reads 中的任何位置，但实际上序列中出现接头和引物大部分情况下都是由于文库插入片段比测序读长短导致的，这种情况在 reads 的开头部分是有一段可用序列的，末端包含了接头的全长或部分序列，如果末端只有接头的一部分序列，那么去除这残缺的接头序列也不是容易的事。 然而，在 PE 测序模式下如果文库的插入片段比测序读长短，那么 read1 和 read2 中非接头序列的那部分会完全反向互补，Trimmomatic 有一个 ‘palindrome" 模式会利用这个特点进行接头序列的去除。 下图中 A、B、C、D 四种情况就是 Trimmomatic 去除接头和引物的四种模式： A 模式：测序 reads 从起始位置开始就包含了完整的接头序列，那么根据 Illumina 测序原理，这整条 reads 都不可能包含有用序列了，整条 reads 被丢弃。 B 模式：这种相对常见，由于文库插入片段比测序读长短，会在 reads 末端包含部分接头序列，若是这部分接头序列足够长是可以识别并去除的，但如果接头序列太短，比接头匹配参数设置的最短长度还短，那么就无法去除。但是，如果是 PE 测序，可以按照 D 模式去除 reads 末端的很短的接头序列。 C 模式：PE 测序可能出现这种情况，正向测序和反向测序有部分完全反向互补，但是空载的文库，两个接头直接互连，这样的 reads 不包含任何有用序列，正反向测序 reads 都被丢弃。 D 模式：是 Trimmomatic 利用 PE 测序进行短接头序列去除的典范，如果文库插入片段比测序读长短，利用正反向测序 reads 中一段碱基可以完全反向互补的特点，将两个接头序列与 reads 进行比对，同时两条 reads 之间也互相比对，可以将 3" 末端哪怕只有 1bp 的接头序列都可以被准确去除，相对 B 模式去除接头污染更彻底。 Trimmomatic 使用了一种类似序列比对软件（例如 Isaac aligner，一个超快速的 alignment 软件）的两步策略来搜索潜在的接头序列。首先，使用接头序列中的一段种子序列（seed 长度不超过 16bp）与测序 reads 进行比对，如果种子序列在测序 reads 中有足够好的比对结果（具体由 seedMismatch 参数决定），就启动第二步的接头全长与 reads 比对。第一步的 seed 搜索速度很快，可以过滤掉没有接头污染的 reads ，这种两步搜索的方法使得接头序列的查找效率很高。 在第二步的接头序列和测序 reads 全长比对统计比对分值时，罚分策略考虑了测序碱基的质量值Q，每一个比对上的碱基加分 0.6，每一个错配的碱基减分 Q/10，考虑碱基质量值可以降低低质量碱基（高测序错误率）错配对整个比对得分的影响。在这个规则下，一段 12bp 的接头序列完全比对到 reads 上得分为 7.2, 25bp 的接头序列完全比对到 reads 上得分为 15。因此在 ILLUMINACLIP 参数中 simple clip threshold 的值建议为 7-15 之间（即上图中 A/B 比对模式比对得分阈值）。 对于 palindromic 模式的比对（上图中 D 模式），可以比对上的序列长度会更长，为了保证识别接头序列的准确率，比对得分的阈值也更高，例如 reads的 R1 和 R2 中有 50bp 序列可以反向互补匹配，得分为 30。这种模式下，Trimmomatic 可以识别并去除 reads 中非常短的接头序列。 ILLUMINACLIP 参数说明 ：按照规定顺序，ILLUMINACLIP 的参数列表如下（各个参数之间以冒号分开）， PE 测序需要注意最后一个参数 。对于 SE 测序最后两个参数可以不设置。 fastaWithAdaptersEtc ：指定包含接头和引物序列（所有被视为污染的序列）的 fasta 文件路径，Trimmomatic 自带了一个包含 Illumina 平台接头和引物序列的 fasta 文件，可以直接用这个。 seedMismatches ：指定第一步 seed 搜索时允许的错配碱基个数，例如 2。 palindrome clip threshold ：指定针对 PE 的 palindrome clip 模式下，需要 R1 和 R2 之间至少多少比对分值（上图中 D 模式），才会进行接头切除，例如 30。 simple clip threshold ：指定切除接头序列的最低比对分值（上图 A/B 模式），通常 7-15 之间。 minAdapterLength ：只对 PE 测序的 palindrome clip 模式有效，指定 palindrome 模式下可以切除的接头序列最短长度，由于历史的原因，默认值是 8，但实际上 palindrome 模式可以切除短至 1bp 的接头污染，所以可以设置为 1 。 keepBothReads ：只对 PE 测序的 palindrome clip 模式有效，这个参数很重要，在上图中 D 模式下， R1 和 R2 在去除了接头序列之后剩余的部分是完全反向互补的，默认参数 false，意味着整条去除与 R1 完全反向互补的 R2，当做重复去除掉，但在有些情况下，例如需要用到 paired reads 的 bowtie2 流程，就要将这个参数改为 true，否则会损失一部分 paired reads。 看一个 PE150 数据的测试，就知道 keepBothReads 参数的重要性了： 滑窗剪切，统计滑窗口中所有碱基的平均质量值，如果低于设定的阈值，则切掉窗口。 SLIDINGWINDOW 参数如下： widowSize :设置窗口大小 requiredQuality ：设置窗口碱基平均质量阈值 包含一个可以自动调整的过滤条件，在保留尽可能长的序列和保持序列中碱基测序错误率尽可能低之间进行平衡，以达到 trim 之后保留序列的价值最大化。 对于不同的应用场景，一条 reads 序列的价值由以下三个因素决定： MAXINFO 有两个参数，第一个 target read length 控制上面的因素一，即允许的最短 read 长度。第二个参数 strictness 是控制因素二和因素三之间的平衡，即满足最短 read 长度的情况下，是保留尽可能多的碱基，还是保证尽可能低的测序错误率。 MAXINFO 过滤从 reads 3" 端开始进行剪切，在考虑上述三个因素的情况下统计所有可能的 trim 方式的到的 clean reads 的 INFO 分值（即所谓的 reads 价值），这三个因素分别以不同的方式影响最终的 reads INFO 分值： 针对一条 read 的任何可能的剪切方式都计算出 INFO 分值，最终的 reads 长度和切除的碱基由 INFO 最大值决定。实际上这三个影响因子作用的方式不同： 参数说明： targetLength :使得 reads 可以 map 到参考序列上唯一位置的最短长度（likely）。 strictness ：一个介于 0 - 1 之间的小数，决定如何平衡 最大化 reads 长度 或者 最小化 reads 出现错误的概率，当参数设置小于 0.2 时倾向于最大化 reads 长度，当参数设置大于 0.8 时倾向于最小化 reads 中出现测序错误的概率。 从 reads 的起始端开始切除质量值低于设定的阈值的碱基，直到有一个碱基其质量值达到阈值。 quality :设定碱基质量值阈值，低于这个阈值将被切除。 从 reads 的末端开始切除质量值低于设定阈值的碱基，直到有一个碱基质量值达到阈值。Illumina 平台有些低质量的碱基质量值被标记为 2 ，所以设置为 3 可以过滤掉这部分低质量碱基。官方推荐使用 Sliding Window 或 MaxInfo 来代替 LEADING 和 TAILING 。 quality :设定碱基质量值阈值，低于这个阈值将被切除。 不管碱基质量，从 reads 的起始开始保留设定长度的碱基，其余全部切除。一刀切，把所有 reads 切成相同的长度。 length ：reads 从末端除之后保留下来的序列长度 不管碱基质量，从 reads 的起始开始直接切除部分碱基。 length ：从 reads 的起始开始切除的碱基数 设定一个最短 read 长度，当 reads 经过前面的过滤之后，如果保留下来的长度低于这个阈值，整条 reads 被丢弃。被丢弃的 reads 数会被统计在 Trimmomatic 日志的 dropped reads 中。 length ：可被保留的最短 read 长度 此选项可以将过滤之后的 Fastq 文件中质量值这一行转为 phred-33 格式。 此选项可以将过滤之后的 Fastq 文件中质量值这一行转为 phred-64 格式。 Trimmomatic 也可以自己制作包含接头和引物序列的 fasta 文件，格式可以参考软件自带的 adapters 文件夹中的格式。 adapters 文件夹中包含 illumina 测序 TruSeq2，TruSeq3 针对 SE 和 PE 的通用接头和引物序列。

紫外交联仪是一种多用途的紫外辐射系统，主要用于将DNA或RNA交联到尼龙膜、硝酸纤维素膜上。交联过程仅需25–50秒。传统的方法是将膜置于真空烘箱中80℃烘烤2小时。与真空烘箱烘焙相比，紫外交联仪照射可使杂交信号显著增加。紫外交联仪可用于Northern、Southern blotting、EMSA等膜交联，CLIP-seq、iCLIP-seq、PAR-CLIP-seq、pBpa、sulfo-SDA、psoralen等双分子交联以及微生物灭活（例如细菌，真菌，病毒），光稳定性验证，琼脂凝胶中DNA的切割，RecA突变筛选，胸腺二聚体产生的部分限制性内切酶消化，UV灭菌消除PCR污染。在紫外灭菌，聚合物固化（例如水凝胶，甲基丙烯酸甲酯树脂）等方面也有应用。紫外交联仪，VL-1000A（365nm）、VL-1000B（302nm）、VL-1000C（254nm）、VL-3000（三种波长）在功能上有着诸多的优势与特点，比如：◇多种模式自由选择：自动模式（Auto Mode）、能量模式（Energy Mode）、时间模式（Time Mode）、预设模式（Preset Mode）。◇多种光源自由选择：254nm(UVC）、302nm（UVB）、365nm（UVA)◇安全性强：仪器装有安全联锁装置，当门打开或者门关闭不严时会自动关闭紫外光源，保护使用者安全。◇灯管更换提示功能：当灯管功率小于初始值的60%时，此灯亮，提示用户需要更换灯管。◇光源分布一致性好：紫外交联仪光源的分布，尤其是中心区域的分布一致性好，能够保证样品各点吸收的能量基本一致。◇友好、安全的观察窗：观察窗采用3层特殊玻璃，用户可以安全地通过此窗口观察样品和灯的运行状态。◇ 预设常用实验程序◇ 不同波长灯管 自动识别功能

打个比方，一代测序一次测序只能够对1个基因进行测序，而高通量测序能够一次检测几十甚至几百个基因，这就是高通量，同时产生的数据也很巨大，一代测序一次测几百bp，高通量测序一次测几个Gbp

移步github 共有的特点： 10X Genomics，是常规Illumina二代测序的升级版，由于开发出了一套巧妙的Barcoding建库方案，使得Illumina这种短读长二代测序能够得到跨度在30-100Kb的linked reads信息，与二代测序数据相结合，在Scaffold的组装上能够得到媲美三代测序的组装结果 其GC偏好性如何？ 10X Genomics技术相对于Illumina来说，有改进，但依旧是个拱形，而PacBio则是无偏倚的均一分布。10X的技术，其Coverage一样是受GC含量影响较大的，那么如果真要应用10X技术，那么必须注意目标DNA的GC含量分布最好能控制在30～70%。 真正的单分子测序（Helicos True Single Molecule Sequencing） 待测DNA 被随机打断成小片段，在每个小片段（ 200bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上随机固定多个 poly-dT 引物，其末端皆带有荧光标记，以利于精确定位。 首先，将小片段 DNA 模板与检测芯片上的poly-dT 引物进行杂交并精确定位，然后逐一加入荧光标记的末端终止子。这个终止子与 Illumina 的终止子可不一样，不是四色的，是单色的，也就是说所有终止子都标有同一种染料。 在掺入了单个荧光标记的核苷酸后，洗涤，单色成像，之后切开荧光染料和抑制基团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入。通过掺入、检测和切除的反复循环，即可实时读取大量序列。最后以软件系统辅助，可分析出完整的核酸序列。 缺点 ：Heliscope 在面对同聚物时也会遇到一些困难，但可以通过二次测序提高准确度；由于在合成中可能掺有未标记的碱基，因此其最主要的错误来源是缺失。 PacBio SMRT（single molecule real time sequencing）技术也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT 芯片为测序载体。 基本原理是：DNA 聚合酶和模板结合，4 色荧光标记4 种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。 DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。 PacBio SMRT 技术的一个关键是怎样 将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来 ： 优缺点： 该技术的关键之一是，它们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA 碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。 测序原理： 特点： Nanopore 测序仪 MinION 的一些特征： ONT公司目前推出的几款测序仪： 在analysis文件夹中，下机的数据被分割为三个文件进行存储 数据的命名: Pacbio 数据的文库模型是两端加接头的哑铃型结构，测序时会环绕着文库进行持续的进行，由此得到的测序片段称为 polymerase reads ，即一条含接头的测序序列，其长度由反应酶的活性和上机时间决定。目前，采用最新的 P6-C4 酶，最长的读长可达到 60kb 以上。 polymerase reads 是需要进行一定的处理才能获得用于后续分析的。这个过程首先是去除低质量序列和接头序列： 处理后得到的序列称为 subreads ，根据不同文库的插入片段长度，subreads 的类型也有所不同。 对长插入片段文库的测序基本是少于2 passes的(pass即环绕测序的次数)，得到的reads也称为 Continuous Long Reads (CLR) ，这样的reads测序错误率等同于原始的测序错误率。 而对于全长转录组或全长16s测序，构建的文库插入片段较短，测序会产生多个passes，这时会对多个reads进行一致性校正，得到一个唯一的read，也称为 Circular Consensus Sequencing（CCS）Reads ，这样的reads测序准确率会有显著的提升。 不同于二代测序的碱基质量标准Q20/Q30，三代测序由于其随机分布的碱基错误率，其单碱基的准确性不能直接用于衡量数据质量。那么，怎么判断三代测序的数据好不好呢？ 需要关注的是两个比例： 目前采用的组装策略： 这四种组装策略并不是完全孤立的，在一个组装任务的不同阶段会用到不同的方法 不同的组装策略可以选用的工具： 基因组的组装问题，实际上就是从序列得到的图中搜寻遍历路径的问题，有两种构建图的方法： 可以看到，随着reads长度的增加，基于OLC算法的组装工具组装出的contigs的长度几乎在线性增长，而基于de Bruijn图算法的组装效果并没有随着reads长度的增加而提高 三代单分子测序会产生较高的随机错误，平均正确率在82.1%-84.6%。这么高的错误率显然不能直接用于后续的分析，需要进行错误校正： 校正过程中会将short reads未覆盖到的Gap进行裁剪，short reads在PacBio long reads上的覆盖情况： 这样做的其中一个考虑是去除adapter 那么是什么原因导致了低覆盖度区域的产生的呢？ Base-calling做的就是从测序仪输出的电流信号波形图中将碱基解码 (decoding) 出来 第一步就是就是对波形图进行分段 (segmentation)，即检测每个current shift的边界，这一步由ONT公司提供的 MinKNOW 完成，但是分段基于的假设是ssDNA分子匀速穿过nanopores，但是由于ssDNA穿过nanopore的速度很快，很容易产生一两个碱基的速度差异，这样就容易在decoding时造成insert和delete 接着就基于current shift进行base calling，ONT公司提供的base caller为Metrichor，其底层算法基于HMM，将可能的k-tuple（由k个碱基组成的序列）作为隐藏状态，将current signals作为观测状态。ONT公司最新开发出的Metrichor用RNN取代了HMM，并将其整合到其开发出的新的生物信息数据分析平台EPI2ME中 随后，科研圈又开发出了开源的base calling工具，Nanocall 和 DeepNano。 ONT后来又在github上开源了一个RNN base-caller —— Nanonet 测序时，测序仪 MinION 连接上主机，安装在主机上的软件 MinKNOW 控制测序仪，对于每条reads，其 signal segmentation 结果（包括segment mean, variance and duration）以及测序过程中的 metadata 会被保存成FAST5格式的二进制文件（基于 HDF5标准 的变种）。 保存在FAST5文件中的原始数据会经过云端的Metrichor的处理，产生的解码的序列会被保存在另外的以 .FAST5 为后缀的HDF5文件中，包含一条template read和一条complement read或只有一条 2D read 。 MAP (MinION Access Programme) community 开发出的用于处理FAST5文件的工具，它们均能从FAST5文件中解析出FASTA/FASTQ文件，除此之外还有各自特色的质量统计功能： 参考资料： (1) 生物技能树论坛：PacBio sequence error correction amd assemble via pacBioToCA (2) 天津医科大学，伊现富《系统生物学-chapter2》 (3) Nanopore 第四代测序技术简介 (4) Magi A, Semeraro R, Mingrino A, et al. Nanopore sequencing data analysis: state of the art, applications and challenges.[J]. Briefings in Bioinformatics, 2017. (5) 细节曝光！Oxford Nanopore真机还原，听听圈内人怎么说 (6) 三代测序--QC篇 (7) PacBio Training: Large Genome Assembly with PacBio Long Reads (8) Koren S, Schatz M C, Walenz B P, et al. Hybrid error correction and de novo assembly of single-molecule sequencing reads[J]. Nature Biotechnology, 2012, 30(7):693-700. (9) 冷泉港ppt：Hybrid De Novo Assembly of Eukaryo6c Genomes (10) Leggett R M, Darren H, Mario C, et al. NanoOK: multi-reference alignment analysis of nanopore sequencing data, quality and error profiles[J]. Bioinformatics, 2016, 32(1):142-144.

1）测序文库的构建（Library Construction）首先准备基因组（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insert size，以便在组装（Assembly）的时候获得更多的信息。2）锚定桥接（Surface Attachment and Bridge Amplification）Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。3）预扩增（Denaturation and Complete Amplification）添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。4）单碱基延伸测序（Single Base Extension and Sequencing）在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做Base Calling，Illumina公司Base Calling所用的软件是Illumina"s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。5）数据分析（Data Analyzing）这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。

fastq格式是一种基于文本用来储存生物序列和序列对应质量的文件格式；生物序列和质量均使用单一ASCII码编码。 第1行：以@开头的序列ID，空格后跟着描述性内容； 第2行：序列（碱基序列或者核酸序列）； 第3行：以+开头的序列ID，空格后跟着描述性内容；有时为了节省存储空间会只保留+； 第4列：序列测序质量，每个质量字符与序列字符一一对应； 测序质量对应的ASCII码（由低到高排列）： !"#$%&"()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~ Illumina sequence identifiers @HWUSI-EAS100R:6:73:941:1973#0/1 从版本illumina 1.4以后，有所改变： @EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG Q值与p值对应。 #P值是每个碱基测序错误率 这儿有两个转换公式： The first is the standard Sanger variant to assess reliability of a base call, otherwise known as Phred quality score: The Solexa pipeline (i.e., the software delivered with the Illumina Genome Analyzer) earlier used a different mapping, encoding the odds p/(1-p) instead of the probability p: Although both mappings are asymptotically identical at higher quality values, they differ at lower quality levels (i.e., approximately p > 0.05, or equivalently, Q < 13). Q与p值之间的关系：红色的为phred对应方程，黑色的为Illumina对应方程，虚线表明p=0.05，对应的质量得分为Q≈13 Phred+33与Phred+64： Phred+64：质量字符的ASCII值 = Q + 64 Phred+33: 质量字符的ASCII值= Q + 33 参考： FASTQ format 转录组入门（3）：质量控制 转录组入门（3）：了解fastq测序数据

他们的原理都是差不多的，首先都是先交联(Crosslink), 然后在通过一系列的处理，测序，找出来那些地方（loci pair）之间被交联的比较多，来推测染色体的3D结构。3C最早，只能做某一些特殊点的，4C把范围扩大了一些，到HiC，可以给出整个染色体上所有loci之间的相互作用了。后来发现，HiC因为范围大，需要测序的深度太深，但是大部分信号都是没用的，所以就找出一部分关键点来，就是后来的各种XXXHiC和ChIA-PET。3C和XXXHiC, ChIA-PET其实都是HiC的子集，区别是，3C对功能来说，算是随机的子集，因为技术水平不够，哪里能测就测哪里。后来的XXXHiC和ChIA-PET，技术水平已经超过HiC，为了省成本，是哪里重要测哪里

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从1977年Sanger发明了双脱氧链终止法一代测序技术开始，测序技术发展至今已有四十多年时间，先后经历了以GS FLX、Solexa、SOLID为基础的二代测序技术，以及基于单分子实时测序（SMRT）和纳米孔测序技术的三代测序技术。虽然三代测序在蓬勃发展，并在基因组和转录组测序等领域展现出前所未有的优势，但限于成本问题，其应用范围尚不及二代测序。 二代测序技术以其短读长、高通量、准确性高的特点，仍在测序市场上占优势地位。以Illumina Solexa为例，首先利用超声波将DNA打断成200-500bp小片段文库，加接头后DNA片段随机附着于flowcell表面，经过桥式PCR扩增形成“DNA簇”，实现碱基信号强度放大，采用边合成边测序的方法，进行全基因组全面，准确的测序。 2014年Illumina推出HiSeq X Ten测序仪，它利用数十亿个纳米孔的流动槽，较大缩短了测序周期。2017年它又推出了新一代测序仪NovaSeq系列，我们以相同文库分别进行Hiseq Xten系列和NovaSeq系列测序，DNA重测序产出数据指标如下： 看完重测序，再看看转录组文库测序比较： 基于以上结果，总结了以下几点： 1.测序原理：X-ten与Nova6000测序原理均是基于solexa的边合成边测序的原理；Nova6000采用Illumina的EX-AMP簇生成技术，以及新一代的Patterned Flow Cell。 2.Q30质量值：在实际测序中Nova6000的Q30相对于X-ten更稳定且测序时长更短，试剂衰减对质量影响更小，整体的Q30 Nova6000要优于X-ten。 3.测序方式：受限于X-ten的控制软件以及试剂等因素，X-ten只能进行单Index的测序识别；而Nova6000可以进行I7 I5双端Index的测序，理论上可以做到更精准的识别。 4.DNA文库冗余度：Nova6000明确优于X-ten平台。 有木有发现随着二代测序仪器的发展，测序结果真是又快又好，目前二代测序较多的应用于基因组重测序，转录组分析，小分子RNA研究等领域。基于二代测序技术进行遗传图谱构建，基因定位的研究也越来越多。

Fastq是测序数据下机格式，其中包含测序序列(reads)的序列信息及其对应的测序质量信息。 FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下： 其中第一行以“@”开头，随后为Illumina 测序标识符(Sequence Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二行是碱基序列；第三行以“+”开头，随后为Illumina 测序标识符(选择性部分)；第四行是对应序列的测序质量。 Illumina 测序标识符详细信息如下： 第四行中每个字符对应的ASCII值减去33，即为对应第二行碱基的测序质量值。如果测序错误率用e表示，Illumina测序平台的碱基质量值用Qphred表示，则有下列关系： ASCII - 33 = Qphred　=　-10log10(e) 此公式可说明，质量值越大测序错误率(e)越低，准确性越高

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

在fastq文件里，会用4行文本来表示一条序列： 在fastq文件里，会用4行文本来表示一条序列： 其中第一行文本是序列的名称（read name 或者说read ID），包含了非常多有用的关键信息，每部分信息之间用 ":" 分隔开，从左到右依次看过去： SIM 表示 instrument ID（即测序仪的硬件ID） 1 表示 run number（该测序仪上的测序顺位数字？） FCX 表示 followcell ID（测序芯片的ID） 1 表示 lane ID（第几条lane） 15 表示 Tile number（Tile数字） 6329 表示 X coordinate of cluster（桥式PCR生成的簇的横坐标） 1045 表示 Y coordinate of cluster（簇的纵坐标） GATTACT+GTCTTAAC 表示 read1 UMI ID + read2 UMI ID（拆分数据的UMI序列） 1 表示 read number，1 表示read1，2表示read2 N 表示 Y if the read is filtered (did not pass), N otherwise.（N表示合格，Y不合格） 0 表示 control number（在HiSeq X and NextSeq平台上总是为0） ATCCGA 表示 index（拆分数据用的index序列） 解释名词 SBS：边合成边测序反应，每次SBS会延伸一个碱基，大约耗时70分钟。 Run：单次上机测序反应，可以产生4G-75G测序通量不等。 Lane：单泳道，每条泳道可以直接物理区分测序样品，1次run最多可以同时上样8条Lane。 Channel：Lane的同义词。 Tile：每次荧光扫描的最小单位，小区，每条Lane中排有2列tile，合计120个小区。每个小区上分布数目繁多的簇结合位点。 Cluster：簇，在Solexa测序技术中会采用桥式PCR方式生产DNA簇，每个DNA簇才能产生亮度达到CCD可以分辨的荧光点。 Index：标签，在Solexa多重测序（Multiplexed Sequencing）过程中会使用Index来区分样品，并在常规测序完成后，针对Index部分额外进行7个循环的测序，通过Index的识别，可以在1条Lane中区分12种不同的样品。 Barcode: Index同义词 Hiseq 2000 与 2500比较： 2000的通量600G/RUN,2500的通量120G/RUN 2000有2个flowcell,每个flowcell8个lane 2500的也是2个flowcell，快速模式中每个flowcell2个lane，每个lane产出30G数据量

U0001f449 mRNA：最常见的转录组测序，建库一般选200-300bp的片段，PE150或125测序 U0001f449 microRNA： 将microRNA分离出来直接单独测序 U0001f449 IncRNA： 长链非编码RNA，有正向、反向转录，要进行 链特异性建库 【 关于链特异性建库： 作用就是测序过程保留转录本的方向信息，让我们知道转录本是来自正义链还是反义链。方便后来区分不同的IncRNA类型以及它的定位，可以更准确获得基因结构和表达信息。】 U0001f449 提取： U0001f449 纯化： U0001f449 检测是否合格的指标： U0001f449 分离RNA=》将RNA打断成小片段=》将小RNA片段反转录成DNA（DNA更稳定更容易扩增）=》加接头=》PCR扩增 =》质量检查QC 具体： 总RNA样本检测合格后，对于真核生物，用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，对于原核生物，用试剂盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二链，经过QIAQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱。洗脱纯化后的双链cDNA再进行末端修复、加碱基A、加测序接头处理，然后经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作。 注： 【RNA片段化目的：RNA长达几kb，测序仪器只能测200-300bp长度的短片断。 反转录目的：DNA更稳定更容易扩增。 接头作用：1u20e3ufe0f 使测序机器识别片段 2u20e3ufe0f可同时测多个样品。 PCR扩增：只有加了接头的片段才能被扩增。】 目前二代测序主要采用 Illumina平台 一般：质控-》比对(alignment or mapping)-》估算表达量(read counting)-》表达量比较(differential expression)。 U0001f449 原始数据： Illumina测序仪下机的数据通常为Bcl格式，然后公司使用Bcl2Fastq软件，根据Index序列分割转换成每个样品的Fastq文件，用户拿到的就是fastq格式的原始数据。 U0001f449 质控： 使用fastqc，查看碱基质量、接头情况、GC含量、序列长度、重复序列等 U0001f449 过滤： 一般需要去掉低质量碱基或者未识别碱基（N）太多的reads；另外如果测序文库的插入片段太短，比如insert size=50，但采用PE 150测序，read1和read2就会测到接头，所谓的“测通“就是这意思，此时需要去掉接头序列。有时会出现两个接头连在一起的情况，也需要去掉。 不同的比对流程 U0001f447 上图来自文章 A survey of best practices for RNA-seq data analysis, 2016, GB U0001f449HISAT2是TopHat2的升级版，该软件使用改进的BWT算法（Sirén et al. 2014）将参考基因组转换成index，实现了更快的速度和更少的资源占用。 【先将大的基因组序列打断成许多小片段，然后为了方便接下来寻找这些片段，需要对他们进行构建索引index（目的就是标注每个小片段的位置），再将测序的reads和基因组一样，也是打断成小片段，然后把它的小片段比对到基因组的小片段上，比对上的会给出位置信息。】 【注：index比对的方法也避免由于某个碱基不匹配导致整段reads比对不上的结果】 U0001f449 Counts：与转录本重叠的reads数。 U0001f449 RPKM/FPKM：Reads/Fragments per kilobase of transcript per millions of read mapped 【建库测序是一个随机抽样的过程，而这个抽取的样品实际上是以 Fragments 为单位，而不是 Reads。因此，使用FPKM更为合理。当 single-end 测序的时候，RPKM 与 FPKM 是等价的；当 pair-end 测序的时候（一个fragment对应两条reads），应该使用 FPKM。】 U0001f449 TPM: Transcripts per million reads 【当样本差异过大，要强调准确度或者定量目标基因的表达量的时候，TPM是最有效的。TMP先处理基因长度问题，再处理测序深度。】 目的： 1u20e3ufe0f 告诉我们是否能看到对照组与处理组直接的差异；2u20e3ufe0f 为下游的分析去掉其中不可靠的数据。 ～～未完待续～～ 以上内容参考： 1. 刘小泽：简单理解RNA-Seq 2. 刘小泽：转录组谜团 3. 刘小泽：转录组那些事儿 Part I 4. 生信星球转录组培训第一期Day1--善良土豆 更多资料： 视频 StatQuest: A gentle introduction to RNA-seq 讲义 http://www.mi.fu-berlin.de/wiki/pub/ABI/GenomicsLecture12Materials/rnaseq1.pdf