看到文献中有一个荧光素酶表达的图 纵坐标是RLU/mg protein是什么意思啊？

蛋白质抑制基因表达，luciferase结果是什么样RNA干扰的分子抑制机制的三种方式及原理转录抑制 与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域从头合成DNA的甲基化。Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。转录后抑制不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生siRNA片断，再由合成的RISC切割靶mRNA从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻断，这种RNAi方式叫做转录后沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS)。siRNA对靶mRNA降解具有序列特异性，只能引起同源mRNA降解，如果siRNA与mRNA有一个bp不配对，RNAi作用就极大降低，如果两者有4个bp不配对，就不能产生RNAi。翻译抑制 Grishok等在研究RNAi时，发现在细胞中在细胞中存在内源性小片段单链RNA(ssRNA)，其长度也在21～25 nt之间，这种ssRNA可与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)特异性地结合，从而抑制mRNA的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的ssRNA叫做stRNA(small temporal RNA)。ssRNA的形成是因为当RNA的大小为70～80 nt时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在21～25 nt之间，这样的双链结构易被Dicer酶识别并切割成stRNA，由stRNA抑制翻译。这种方式的RNAi也作用于转录后形成的mRNA，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。

双荧光素酶的实验原理是利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，一般将萤火虫荧光素酶（FLuc）作为报告基因，海肾荧光素酶（RLuc）作为内参基因。构建报告基因质粒，经过细胞转染与裂解，经荧光测定仪检测该报告基因系统中释放的生物荧光，从而反映基因是否存在靶向互作。

它们分别行使不同的功能～gfp表达绿色荧光蛋白～紫外激发下可见绿光～luciferase表达荧光素酶～需要特定底物反应后才能实现生物发光～gfp为激发荧光～luciferase发光为自然光～

双荧光素luc不表达有多种原因，实验过程中的每一个步骤都可能导致双荧光素luc不表达。如果目的基因载体没有成功转移到受体细胞，或者受体细胞没有成活，以及实验过程中出现其他物质抑制了双荧光素luc的表达等等，都有可能导致双荧光素luc不表达。基于荧光素酶（Luciferase）的发光原理，形成了双荧光素酶报告基因检测系统。该系统包括萤火虫荧光素酶（Fireflyluciferase）和海参荧光素酶（Renillaluciferase）。两者可与各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，产生的荧光值即表示两种酶的表达量多少。

luciferase knockdown 荧光素酶基因敲除

荧光小菇（Mycena chlorophos），其属名在希腊文中，意思是（绿色的灯），美锡尼（Mycena）是公元前十五世纪时相当繁华的古希腊城市，据说是在特洛依战争时，阿格麦穆隆王的宫殿里也摆着这样淡绿色的灯，发现这种真菌并将之命名的希腊学者，遥想着古代希腊宫殿里的种种风情，将这美丽的真菌取了如此罗曼蒂克的名字。早期在北美洲的居民，称呼这些发光的真菌为「jack-o-lantern」或是「foxfire」，意即「鬼火」或是「狐火」的意思；在日本则称之为「夜光茸」，在八丈岛的凤凰木或是小笠原诸岛的竹林中出现，在多雨的季节，小笠原当地甚至推出「green-pepe夜晚之旅」（green-pepe为当地称呼夜光茸用语），专门为观光客推出的旅游行程，还颇受好评。关于荧光蕈类的发光机制至今尚未被阐明，但是似乎与萤火虫的发光机制有所差别。萤火虫的发光机制是体内的荧光素（luciferin）、荧光酵素（luciferase）、ATP及氧的化学反应而发光，笔者曾就荧光小菇进行研究，其发光的时间似乎有日周期性，一般荧光小菇自「出菇」注一后约莫可存活3天，其间若白天将荧光小菇移进室内暗处，并不会发光，直至傍晚时分才发出淡淡的绿光，但若混乱其光周期性，即使白天在暗室内依旧会发光。荧光小菇发光时，只有蕈伞会发光，蕈柄及菌丝体并不会发光，参照国外文献几乎可以确定在菌丝产生核融合注二产孢时会发光。为何荧光蕈类要在夜晚发光至今尚无定论，一般推测为吸引特定昆虫帮其散播孢子。由于夜晚时荧光蕈的样子很像水母，故又有人称为绿色陆地水母。

小动物活体成像 主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。另外, 这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质和方法, 非常安全。因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。

gfp表达绿色荧光蛋白,紫外激发下可见绿光,luciferase表达荧光素酶,需要特定底物反应后才能实现生物发光。

原理：转录是以一条DNA链为模板，合成出一条mRNA的过程。所以，检测某一基因在特定条件下是否转录，可以提取样品的mRNA，反转录成cDNA，然后用扩增该基因的PCR引物扩增，如果有条带就是说明转录，没有条带就是不转录。过程：1.提取样品mRNA；2.反转录合成cDNA；3.设计该基因特异的PCR引物；4.进行PCR扩增，电泳，检测结果。

答：双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素。其中荧火虫荧光素是从甲虫（Photinus pyralis）中分离得到，分子量为61kDa；而海肾（Renilla）荧光素酶则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36kDa。这两种酶的区别之一是他们的底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的区别之二是发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双报告实验中得到广泛应用，它们的发光原理如下所示： 答：单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。 答：双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比，本系统被广泛用于 miRNA 靶基因验证。 miRNA 主要通过作用于靶基因的 3"UTR 起作用，可以将目的基因 3"UTR 区域构建至载体中报告基因 luciferase 的后面，通过比较过表达或者干扰 miRNA 后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映 miRNA 对目的基因的抑制作用，也即用荧光值来判断miRNA是否和靶基因结合。 答：靶基因的3"UTR长度不一，将全长都插入载体中不切实际，通常只插入包括miRNA结合位点前后200bp左右的序列，大概就是400bp[1]，但也有文献插入的是80个bp[2]，有文献选择了200多个bp[3]，但严格来讲，应该选择400bp，以结合位点为中心，上游200bp，下游200bp。 答：常用的载体有两种策略。第一种是两种荧光素分别位于两个载体上，第二种是两种荧光素酶位于同一个载体上。以第一种为例，这两种载体分别为pMIR-REPORT miRNA载体和pRL-TK载体。经检索发现，pMIR-REPORT miRNA载体是由Ambion开发的载体，它用来克隆插入miRNA靶序列，评估细胞内miRNA功能的载体，该载体的图谱如下所示： 另外的一个载体是pRL-TK载体，这个载体是由Promega开发的，pRL-TK是海肾荧光素酶报告载体，含有SV40增强子，质粒图谱如下所示： 从这两个图谱中可以发现，pMIR-REPORT miRNA这个载体主要是用于评估miRNA与靶基因3"UTR的结合，靶基因的3"UTR放在荧光素酶的后面，这个荧光素酶是荧火虫荧光素酶，而pRL-TK这个载体则表达海肾荧光素酶，将这两个质粒共同转染进入293细胞中来检测荧光时，pRL-TK这个质粒起到一个内参的作用。 第二种方案就是将荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶构建到一个载体上，这样偏差更小，毕竟转染一个质粒比转染两个质粒要容易，在这方面，根据检索到的资料显示，现在的这类质比较有名的是Promega公司的pmirGLO质粒，图谱如下所示： 另外的质粒就是国产的，即复能基因的pEZX-MT06质粒，图谱如下所示： 答：首先要知道，插入的靶基因原始3"UTR的质粒叫野生型质粒，除此之外，还需要在萤火虫荧光素酶3"UTR插入miRNA结合位点突变的序列载体，这个质粒通常叫突变型质粒，最后还有各种对照载体，包括萤火虫荧光素酶空载体，miRNA空载体，还有海肾素荧光载体，以文献中的案例[4]说明，此文献使用了6组来进行验证，其分组以及分组说明如下所示： 注：pGL3是荧光素酶报告质粒，绿色的是对照组，即不加miRNA质粒，红色的是正常组，加miRNA质粒。思路即为荧光素酶质粒（3种情况：①空质粒；②加了WT靶基因3"UTR的质粒；③加了MUT的靶基因3"UTR的质粒）×miRNA precursor（两种情况，即加与不加），经排列组合，即为6组，详细说明如下所示： 第一组 荧光素酶质粒pGL3不加3"UTR片段 + miRNA载体质粒 第二组 荧光素酶质粒pGL3不加3"UTR片段 + miR-200c质粒 第三组 荧光素酶质粒pGL3 -WT-3"UTR+ + miRNA载体质粒 第四组 重点：荧光素酶质粒pGL3 -WT3"UTR + miR-200c质粒 第五组 荧光素酶质粒pGL3 -MUT-3‘UTR+ miRNA载体质粒 第六组 重点：荧光素酶质粒pGL3 -MUT-3‘UTR + miR-200c质粒 理想结果：第四组降低，即miRNA能够与靶基因的3UTR结合，第六组不变，即突变后靶基因3‘UTR不与miRNA结合。 答：最经典的仪器就是Promega的GloMax 20/20 发光检测仪，但这种仪器只适合一次检测一个酝酿。但也可以用多功能酶标仪来检测（本实验室的仪器是VARIOSKAN LUX），这种酶标仪可以实现多通量检测。萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。 答：测得的结果一个萤火虫荧光素酶产生的光信号，记为RL1，，海肾荧光素酶产生的信号，记为RL2。RL1/RL2将数据均一化后，每两组之间用ANOVA检测即可。

这种可检测的光是来自于外源光提供的能量Luminescence，多半不需要这个检测模块，提供了底物，所以这个检测模式下：这是荧光，所以如果你的试剂盒中：化学发光，完全是靠样品和检测试剂的反应发光。GFP。因为这种模式下，这种形式的光，没有任何外源的光信号，则需要用这个模块进行检测，来自于酶学反应提供的能量，而你的样品可以表达荧光素酶。 Fluorescence，仪器的检测灵敏度更高，并会要求调节仪器的激发光和发射光。Luciferase是通过这个部分检测的，RFP是用这个模块检测的。所以通常试剂盒中会有荧光染料。如果试剂盒里面根本没提激发波长和发射波长的信息

你好找到的都是抑制的 不过是预测的 需要做Luciferase real-time western分别从不同水平验证

1L，人家没问你酶标仪是什么，人家有说明书好吧？混分也得有点素质啊。 lz，酶标仪测定ELISA比Luciferase方便多了，因为不用加样啊... 你在96孔板上显色之后，加终止液，然后直接在机器上设好吸光度就测了，一块板1分钟就测完了。 比如，你是HRP-TMB显色，就设定吸光度为450nm，shake 5秒，然后每个孔1秒，测下去就好了。满意请采纳

分部在细胞质里。

您好,萤火虫发光的物质主要是鲁西菲林(Luciferin)和荧光素酶(Luciferase)。1. 鲁西菲林是一种有机小分子物质,遇到荧光素酶及ATP等可以发光。2. 荧光素酶是一种酶类蛋白质,可以催化鲁西菲林氧化发光反应。3. 发光反应无需光照,属于化学发光现象。4. 发光效率极高,大约有95%的化学能转变为光能。5. 发出的光为绿色或黄绿色,波长约为560纳米。6. 发光反应可重复多次,但强度会逐渐衰减。 7. 发光物质不会产生大量热量,反应过程几乎不放热。8. 鲁西菲林和荧光素酶性质稳定,可用于多种生物探针。综上所述,这些都是萤火虫发光物质的主要性质特点哦。

与血反应

啥意思 做luciferase么？ 转一个luciferase的siRNA做正对照？

是Ambion品牌的一个产品：siRNA阳性对照，特异性抑制luciferase。用他来抑制luciferase可以通过检测luciferase活性来检测siRNA的干扰效率等，以便用来优化转染条件等，以及和其他目的siRNA一起实验以作阳性对照监测转染效率。

萤火虫之所以能发光，是因为它们体内含有一种叫做荧光素的化学物质。萤火虫的身体内部有一个特殊的器官叫做光器官，光器官内含有荧光素和酶。当氧气和荧光素在酶的作用下结合时，就会产生光。这个过程被称为生物发光。萤火虫发光有多种功能。首先，它们用发光来吸引异性萤火虫进行交配。雄性萤火虫会发出特定的光信号，吸引雌性萤火虫的注意。其次，萤火虫的发光也可以用来警告天敌，告诉它们自己有毒或不好吃。最后，发光还可以用来吸引猎物，例如吸引其他昆虫前来，作为食物。总的来说，萤火虫之所以能发光，是因为它们体内含有特殊的化学物质，并通过光器官的作用产生光。这种发光在萤火虫的生活中起到了交配、警告和捕食等多种功能。

如何证明基因需要转录调控元件调控表达如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，从而对基因的表达起抑制或增强的作用，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，荧光素酶与底物反应，如pGL3-basic等。（3） 加入特定的荧光素酶底物转录因子是一种具有特殊结构，也称为反式作用因子。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，这些特异性的序列被称为顺式作用元件、行使调控基因表达功能的蛋白质分子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合。（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合。其原理简述如下，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比，产生荧光

如何预测和鉴定miRNA的靶基因 miRNA sponge抑制载体，经特异地优化设计，增强吸附能力的同时增加了更多的结合位点，这样提高了成熟miRNA或siRNA抑制能力，消弱细胞中miRNA或siRNA导致的基因沉默效应，从而进行miRNA或siRNA功能缺失性研究。 MiRNA sponge载体与化学修饰的反义寡核苷酸相比，有它无可比拟的优势：a. 由于miRNA sponge是由质粒编码的，可以反复使用；b. 它能够通过包装慢病毒颗粒达到稳定沉默细胞microRNA的细胞系，有利于进行对原代细胞和难转染细胞miRNA的抑制； c. 能够沉默整个家族的microRNA以达到对整个家族microRNA功能的研究； d. 可以利用miRNA sponge实现体内外loss of function研究；e. 可以用来检测luciferase靶基因报告系统分析；f. 可以自由组合串联不同miRNA抑制子序列，达到沉默多种不同miRNA的目的。

1994年，华裔美国科学家钱永健（roger y tsien）开始改造gfp，有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、可变色。到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好，现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的pcr用多聚酶后的一波浪潮。不过真发现的有用东西并不很多。成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所sergey a. lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白，包括红色荧光蛋白。 生物发光现象，下村修和约翰森以前就有人研究。萤火虫发荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin），有化学反应如氧化，以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修和约翰森的研究。 下村修和约翰森用过几种实验动物，和本故事相关的是学名为aequorea victoria的水母。1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班要回家了，他把产物倒进水池里，临出门前关灯后，依依不舍地回头看了一眼水池，结果见水池闪闪发光。因为水池也接受养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响水母素，不久他就确定钙离子增强水母素发光。1963年，他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系。其后ridgway和ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。 1955年davenport和nicol发现水母可以发绿光，但不知其因。在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，他们纯化到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白gfp。morin和hastings提出水母素和gfp之间可以发生能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到gfp，刺激gfp发光。这是物理化学中知道的荧光共振能量转移(fret)在生物中的发现。 下村修本人对gfp的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。他离开普林斯顿到 woods hole海洋研究所后，同事普腊石(douglas prasher)非常感兴趣发明生物示踪分子。1985年普腊石和日裔科学家satoshi inouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cdna）。1992年，普腊石拿到了gfp的基因。有了cdna，一般生物学研究者就很好应用，比用蛋白质方便多了。

楼上正解，我也在他们那里做过，你有问题其实可以直接问他们的，他们会很认真的给你解释清楚。

night merket

细胞实验重复三次是一组细胞设三个复孔嘛不是。单次至少3个复孔 ，需要至少3次独立重复实验（肯定不是一天做的），所以重复三次和一组细胞设三个复孔不是一个意思。关于实验设计复孔，生物学重复的一点建议1、96孔板的实验，比如MTT，luciferase reporter等实验室，单次至少3个复孔，需要至少3次独立重复实验（肯定不是一天做的）。2、WB实验，收样的时候可以不用做复孔，分装蛋白的时候可以分几份跑胶，也可以就跑一次。但是结果至少重复3次（三批的样本）保证重现性。3、PCR实验，收样的时候不需要复孔，但是p的时候至少设置3个复孔，且至少3次独立重复实验，也就是说你等收三批以上的RNA样本。4、染色实验，组织样本，至少来源于3只以上的动物，这个具体看你用什么模式生物，小鼠得6只，大鼠3只。每个组织至少有3-5张切片进行染色。最后分析的时候如果是扫描图片可以是一张整图，如果是放大的截取的图片，那至少观察5个以上的视野。细胞样本染色，6孔板或者比6孔板大的染色，我一般做1-2个复孔，其实一个也可以。96孔这种，至少也需要3个复孔.且都需要做3批以上。5、CoIP, IP pulldown因为最后处理相当于WB,参考WB即可。6、ChIP参考PCR即可。7、RNA-seq, ChIP-seq,>3个重复样本。

四季随笔——乔治·吉辛

ntrk基因融合即融合型基因，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连.置于同一套调控序列(包括启动子、增 强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。融合型基因的表达产物为融合蛋白。根据构成融合型基因的种类，可以将融合型基因分为四大类。常用的报告基因有:GFP(绿色荧光蛋白)基因、GUS基因、LacZ基因和Luciferasese(虫荧光素酶)基因等，主要目的是对功能基因进行示踪，研究其功能及特性。由信号肽或单体蛋白的序列与功能基因构成的融合型基因。其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白，为生产或科研所用。扩展资料：每条染色体的两份拷贝在有些位置可能具有不同的等位基因，通过互换染色体间相应的部分，可产生于亲本不同的重组染色体。重组来源于染色体物质的物理交换，减数分裂前期，每条染色体有4份拷贝，所有的4份拷贝紧密相连，发生联会。这个结构称为二阶体，二阶体的每条染色体单元称为染色单体，染色体物质的两两交换就发生在不一样的染色单体（非姐妹染色单体）之间。发生重组的必须条件是两条DNA链的互补性。每条染色单体包含一条长的双链DNA，发生重组的断裂位点依赖于位点附近碱基的互补配对。当双链中的一条链与另一条双链的一条链发生交叉时，将形成一条杂合DNA。每个重组包括左侧亲本双链体DNA通过一段杂合DNA与右侧的另一条亲本双链体相连。参考资料来源：百度百科-融合型基因参考资料来源：百度百科-基因重组

　　Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。　　转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。　　其原理简述如下：　　（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。　　（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。　　（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

　　Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。　　转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。　　其原理简述如下：　　（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。　　（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。　　（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

自然界中广泛分布着生物发光有机体,其中包括细菌、真菌、鱼、昆虫等.在这些生物发光有机体中催化生物发光反应的各种酶都称之为荧光素酶（Luciferases）,底物则命名为荧光素（Luciferin）.自1986— 1987 年首次被当作报告基因使用以来,荧光素酶基因已成为目前运用最广泛的报告基因之一.尽管来自不同物种的荧光素酶及底物存在有很大的差异,但有一个共同点,即在生物发光反应体系中均需发生氧化反应.它通过两个步骤使底物荧光素发生氧化作用,而产生发光反应,此反应是ATP 依赖性的.杂环荧光素首先腺苷化,然后通过氧化脱羧作用,产生AMP、CO2,并通过激活的荧光素中间产物发射光.将反应所需的试剂与含有荧光素酶的细胞裂解液混合即会产生一种迅速衰减（在一秒钟内）的黄绿色闪光（发射峰560 nm）,这种光信号可用配备了便于迅速混合反应物的自动注射装置的荧光检测仪（Luminometer）进行检测,也可用标准的液闪仪对光信号进行记录.当底物过量时,发光量的总值与样品的荧光酶活性成正比,因此,可对荧光素酶报告基因的转录进行间接估计.荧光素酶易被蛋白酶降解,在转染的哺乳动物细胞中的半衰期约为3 小时.荧光素酶报告系统为启动子活性的检测提供了一个敏感、快速、非放射性的检测方法.荧光素酶报告基因检测试剂盒(Luciferase Reporter Gene Assay Kit),是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase).荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence).然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光.通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达.通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在luciferase的上游或其他适当的地方,构建成报告基因质粒.然后转染细胞,适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性.通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响.Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

自然界中广泛分布着生物发光有机体,其中包括细菌、真菌、鱼、昆虫等.在这些生物发光有机体中催化生物发光反应的各种酶都称之为荧光素酶（Luciferases）,底物则命名为荧光素（Luciferin）.自1986— 1987 年首次被当作报告基因使用以来,荧光素酶基因已成为目前运用最广泛的报告基因之一.尽管来自不同物种的荧光素酶及底物存在有很大的差异,但有一个共同点,即在生物发光反应体系中均需发生氧化反应.它通过两个步骤使底物荧光素发生氧化作用,而产生发光反应,此反应是ATP 依赖性的.杂环荧光素首先腺苷化,然后通过氧化脱羧作用,产生AMP、CO2,并通过激活的荧光素中间产物发射光.将反应所需的试剂与含有荧光素酶的细胞裂解液混合即会产生一种迅速衰减（在一秒钟内）的黄绿色闪光（发射峰560 nm）,这种光信号可用配备了便于迅速混合反应物的自动注射装置的荧光检测仪（Luminometer）进行检测,也可用标准的液闪仪对光信号进行记录.当底物过量时,发光量的总值与样品的荧光酶活性成正比,因此,可对荧光素酶报告基因的转录进行间接估计.荧光素酶易被蛋白酶降解,在转染的哺乳动物细胞中的半衰期约为3 小时.荧光素酶报告系统为启动子活性的检测提供了一个敏感、快速、非放射性的检测方法.荧光素酶报告基因检测试剂盒(Luciferase Reporter Gene Assay Kit),是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase).荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence).然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光.通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达.通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在luciferase的上游或其他适当的地方,构建成报告基因质粒.然后转染细胞,适当刺激或处理后裂解细胞,测定荧光素酶活性.通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响.

应用原理转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。技术流程（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。（5） 培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。（8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。发展双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时, 通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供 PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们体会到该系统的便利。体外分泌的荧光素基因:目前NEB公司提供新型的可在细胞外分泌的荧光素酶,分别是Gluc和Cluc,具体使用帮助可在NEB官方网站找到.

自然界中广泛分布着生物发光有机体，其中包括细菌、真菌、鱼、昆虫等。在这些生物发光有机体中催化生物发光反应的各种酶都称之为荧光素酶（Luciferases），底物则命名为荧光素（Luciferin）。自1986— 1987 年首次被当作报告基因使用以来，荧光素酶基因已成为目前运用最广泛的报告基因之一。尽管来自不同物种的荧光素酶及底物存在有很大的差异，但有一个共同点，即在生物发光反应体系中均需发生氧化反应。它通过两个步骤使底物荧光素发生氧化作用，而产生发光反应，此反应是ATP 依赖性的。杂环荧光素首先腺苷化，然后通过氧化脱羧作用，产生AMP、CO2，并通过激活的荧光素中间产物发射光。将反应所需的试剂与含有荧光素酶的细胞裂解液混合即会产生一种迅速衰减（在一秒钟内）的黄绿色闪光（发射峰560 nm），这种光信号可用配备了便于迅速混合反应物的自动注射装置的荧光检测仪（Luminometer）进行检测，也可用标准的液闪仪对光信号进行记录。当底物过量时，发光量的总值与样品的荧光酶活性成正比，因此，可对荧光素酶报告基因的转录进行间接估计。荧光素酶易被蛋白酶降解，在转染的哺乳动物细胞中的半衰期约为3 小时。荧光素酶报告系统为启动子活性的检测提供了一个敏感、快速、非放射性的检测方法。荧光素酶报告基因检测试剂盒(Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在luciferase的上游或其他适当的地方，构建成报告基因质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

应用原理转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。扩展资料应用植物基因工程在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因（nos）、章鱼碱合成酶基因（ocs）、新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌（Agrobacterium tumfaciens）的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰（磷酸化、乙酰化等），从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。荧光酶基因（luc）是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2+、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。动物基因工程在动物基因表达调控的研究中，报告基因也被广泛应用。常用的有氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、β-半乳糖苷酶基因（LacZ）、二氢叶酸还原酶基因、荧光酶基因等。cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。检测因子作用可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。双杂交体系是由报告基因转录调控区、报告基因及一对可以相互作用的杂合反式作用因子组成。来从上述杂交体系中发展出的单一杂交体系技术，也是根据报告基因表达量的检测筛选出与已知顺式作用元件相结合的未知因子的DNA，该项技术正广泛应用于克隆细胞中含量微弱且用生化手段难以纯化的反式作用因子。由此可知，报告基因在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位，它是作为外源目的基因能否转化植物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，现已推广到真核生物的基因调控领域中。随着基因工程技术日新月异的发展，报告基因这一探路者的作用会更明显。参考资料来源：百度百科-荧光素酶报告基因参考资料来源：百度百科-报告基因

荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。普洛麦格(北京)生物技术有限公司在为生命科学领域提供创新性解决方案和技术支持方面处于全球领先地位。公司生产的2,000多种产品使全球科学工作者们能加快对细胞分析、蛋白组学和基因组学研究的认知，以及在药物筛选、分子诊断和遗传鉴定领域的应用。

报告基因检测被广泛应用于研究基因表达及外部刺激下原核和真核细胞的反应。Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。但是报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，例如培养细胞的数目和活力的差别、细胞转染和裂解的效率、以及加样操作过程中引起的变异。Dual-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。共转染的“对照”报告基因会作为内对照，减小细胞活性和转染效率对实验的影响。因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。Promega提供了一种先进的双报告基因技术（Dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试，该技术同时使用两个独立的报告基因以提高实验的准确性，Biotek synergy 系列微孔板检测仪作为双报告基因的检测分析平台获得了Promega DLR 认证。在双报告基因系统中，通常一个报告基因用于检测特定实验条件下待测物的反应，即“实验”reporter，另一个报告基因用来检测实验条件，类似于内部对照，用于校准“实验”reporter的数据。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，例如：转染效率、细胞活性、细胞裂解差异以及加样操作过程中引起的差异。Promega公司的Dual-Luciferase系统利用萤火虫和海肾荧光素酶的活性分别检测实验组和对照组。萤火虫荧光素酶是一种分子量为61KD的单体酶，分两步催化虫荧光素的氧化反应，产生560nm的光，海肾荧光素酶是一种分子量为36KD的单体酶，催化海肾荧光素的氧化反应，产生中心波长为480nm的蓝光。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶没有种源同源性，对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。

双荧光素酶报告基因载体报告基因检测被广泛应用于研究基因表达及外部刺激下原核和真核细胞的反应。Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。但是报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，例如培养细胞的数目和活力的差别、细胞转染和裂解的效率、以及加样操作过程中引起的变异。Dual-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。共转染的“对照”报告基因会作为内对照，减小细胞活性和转染效率对实验的影响。因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。Promega提供了一种先进的双报告基因技术（Dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试，该技术同时使用两个独立的报告基因以提高实验的准确性，Biotek synergy 系列微孔板检测仪作为双报告基因的检测分析平台获得了Promega DLR 认证。在双报告基因系统中，通常一个报告基因用于检测特定实验条件下待测物的反应，即“实验”reporter，另一个报告基因用来检测实验条件，类似于内部对照，用于校准“实验”reporter的数据。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，例如：转染效率、细胞活性、细胞裂解差异以及加样操作过程中引起的差异。Promega公司的Dual-Luciferase系统利用萤火虫和海肾荧光素酶的活性分别检测实验组和对照组。萤火虫荧光素酶是一种分子量为61KD的单体酶，分两步催化虫荧光素的氧化反应，产生560nm的光，海肾荧光素酶是一种分子量为36KD的单体酶，催化海肾荧光素的氧化反应，产生中心波长为480nm的蓝光。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶没有种源同源性，对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferaseassay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

报告基因检测被广泛应用于研究基因表达及外部刺激下原核和真核细胞的反应。Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。但是报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，例如培养细胞的数目和活力的差别、细胞转染和裂解的效率、以及加样操作过程中引起的变异。Dual-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。共转染的“对照”报告基因会作为内对照，减小细胞活性和转染效率对实验的影响。因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。Promega提供了一种先进的双报告基因技术（Dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试，该技术同时使用两个独立的报告基因以提高实验的准确性，Biotek synergy 系列微孔板检测仪作为双报告基因的检测分析平台获得了Promega DLR 认证。在双报告基因系统中，通常一个报告基因用于检测特定实验条件下待测物的反应，即“实验”reporter，另一个报告基因用来检测实验条件，类似于内部对照，用于校准“实验”reporter的数据。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，例如：转染效率、细胞活性、细胞裂解差异以及加样操作过程中引起的差异。Promega公司的Dual-Luciferase系统利用萤火虫和海肾荧光素酶的活性分别检测实验组和对照组。萤火虫荧光素酶是一种分子量为61KD的单体酶，分两步催化虫荧光素的氧化反应，产生560nm的光，海肾荧光素酶是一种分子量为36KD的单体酶，催化海肾荧光素的氧化反应，产生中心波长为480nm的蓝光。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶没有种源同源性，对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

报告基因检测被广泛应用于研究基因表达及外部刺激下原核和真核细胞的反应。Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。但是报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，例如培养细胞的数目和活力的差别、细胞转染和裂解的效率、以及加样操作过程中引起的变异。Dual-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。共转染的“对照”报告基因会作为内对照，减小细胞活性和转染效率对实验的影响。因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。Promega提供了一种先进的双报告基因技术（Dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试，该技术同时使用两个独立的报告基因以提高实验的准确性，Biotek synergy 系列微孔板检测仪作为双报告基因的检测分析平台获得了Promega DLR 认证。在双报告基因系统中，通常一个报告基因用于检测特定实验条件下待测物的反应，即“实验”reporter，另一个报告基因用来检测实验条件，类似于内部对照，用于校准“实验”reporter的数据。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，例如：转染效率、细胞活性、细胞裂解差异以及加样操作过程中引起的差异。Promega公司的Dual-Luciferase系统利用萤火虫和海肾荧光素酶的活性分别检测实验组和对照组。萤火虫荧光素酶是一种分子量为61KD的单体酶，分两步催化虫荧光素的氧化反应，产生560nm的光，海肾荧光素酶是一种分子量为36KD的单体酶，催化海肾荧光素的氧化反应，产生中心波长为480nm的蓝光。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶没有种源同源性，对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

1994年，华裔美国科学家钱永健（Roger Yonchien Tsien）开始改造GFP，有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的黄色、蓝色，有的可激活、可变色。到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好，现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮。不过真发现的有用东西并不很多。成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白，包括红色荧光蛋白。生物发光现象，下村修和约翰森以前就有人研究。萤火虫发荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin），有化学反应如氧化，以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修和约翰森的研究。下村修和约翰森用过几种实验动物，和本故事相关的是学名为Aequorea victoria的水母。1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班要回家了，他把产物倒进水池里，临出门前关灯后，依依不舍地回头看了一眼水池，结果见水池闪闪发光。因为水池也接受养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响水母素，不久他就确定钙离子增强水母素发光。1963年，他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系。其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光，但不知其因。在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，他们纯化到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP。Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中知道的荧光共振能量转移(FRET）在生物中的发现。下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。他离开普林斯顿到 Woods Hole海洋研究所后，同事普腊石（Douglas Prasher）非常感兴趣发明生物示踪分子。1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物学研究者就很好应用，比用蛋白质方便多了。普腊石1992年发表GFP的cDNA后，不做科学研究了。他申请美国国家科学基金时，评审者说没有蛋白质发光的先例，就是他找到了，也没什么价值。一气之下，他离开学术界去麻省空军国民卫队基地，给农业部动植物服务部工作。当时他如果花几美元，就可以做一个一般研究生都能做，但是非常漂亮的工作：将水母的GFP基因放到其他生物体内，比如细菌里，看到荧光，就完全证明GFP本身可以发光，无需其它底物或者辅助分子。将GFP表达到其它生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。水母素和GFP都有重要的应用。但水母素仍是荧光酶的一种，它需要荧光素。而GFP蛋白质本身发光，在原理上有重大突破。Chalfie的文章立即引起轰动，很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章，其实不过是跟风性质，没有原创性。

双荧光素酶指的是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，萤火虫荧光素酶在ATP、Mg2+和O2存在的条件下，将萤火虫荧光素催化发光。海肾荧光素酶以腔肠素为底物，在氧分子存在的条件下催化腔肠素氧化发光，此过程中发出最强波长在465 nm左右的生物荧光。双荧光素酶可用于启动子结构和活性的分析、信号通路是否激活分析、转录因子同其调控序列的作用验证等。

测定CTL效应的方法有：51铬（Cr）释放法和非同位素测定法两大类。　　一、经典的CTL活性测定方法为51铬（Cr）释放法，本法结果准确、重复性好，但也存在以下不足：　　①使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；　　②51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；　　③51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验；　　④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。　　二、非同位素测定法：　　1 荧光测定法　　1.1 alamarBlue一步荧光测定法　　alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。具体测定方法是：在靶细胞孔（T）、效应细胞孔（E）和实验孔（T+E）各加alamarBlue,共育6~24h后用板式荧光测定仪测530nm（发射）/590nm（散射）波长荧光强度，将T及E孔荧光均值相加后减去实验孔（T+E）荧光均值，与T孔荧光均值比较即可计算CTL对靶细胞的溶解%。　　1.2 Calcein-AM荧光扫描测定法　　Calcein acetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共充，再加Fluoro-Quench试剂（一种以Ca2+螯合的小牛血红蛋白主要成分、还含溴化乙啶试剂，它对细胞无毒，不能进入活细胞但可能进入膜已破损的死细胞），淬灭培养液中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞对照孔（代表细胞100%存活）比较。即可计算效应细胞杀伤靶细胞%。　　2 流式细胞分析法　　2.1 PE-mAb/FITC-annexin V 荧光标记法　　正常细胞的磷酯酰丝氨（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡(Apoptosis)时翻转露于膜外侧，可与annexinV高亲合力结合。研究发现PS外翻为细胞凋亡(Apoptosis)的早期事件，先于膜通透性增加所51Cr或其他染料的释放。将效应细胞与靶细胞充分共育后，用PE结合的效应细胞特异性单克隆抗体（如CD8-PE）标记效应细胞（不能与PE-mABA结合的细胞即为靶细胞），再用FITC-annexin V标记凋亡靶细胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞%。　　2.2 DIOC18(3)/碘化丙锭（PI）荧光标记法　　用DIOC18（3）（3，3，-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate）标记靶细胞膜，用红色荧光核染料PI（propidium iodide）标记效应细胞和死亡靶细胞，通过流式细胞分析可清楚区分2类细胞。在用人和猪的外周血单核细胞（PBMC）作效应细胞时可观察到靶细胞溶解%与不同E：T比之间存在良好相关。本法简单易行，与51Cr释放法同样敏感可信，重复性和相关性很好，另一优点是可用新制备的脾细胞作靶细胞，不再需要培养及活化靶细胞，还可测多种动物的NK活性。　　2.3 PKH-26/CFSE荧光标记法　　Sheehy等采用PKH26和CFSE双示法可有效地标记和区分靶细胞，其标记靶细胞后的自发释放仅为51Cr释放法的1/40，因此可更准确地评价及检测少量CTL介导的细胞溶解。平行试验结是显示本法与51Cr释放法明显相关（r2=0.998，p<0.0001），对进一步研究效应细胞溶解细胞的机理具有应用价值。　　2.3 树突状细胞（DC）清除法　　抗原标记的树突状细胞DC(dendritic cell)在体内的存活与CTL活性明显相关。将DC用两种不同荧光物质标记，再分为两部分，一部分用抗原标记，另一部分不标记，二者混合后注入小鼠皮下，只有标记了特异抗原的DC自引流淋巴结清除，未标记抗原的DC仍存于局部不受影响。据此建立了简单灵敏体内测定CTL活性的方法。由于DC可有效摄取及呈递复合抗原、核酸及凋亡小体，本法除可测定用特异性肽负荷的DC免疫或用流感病毒感染所产生的CTL反应外，也可用于评价不具有肽表位特征的抗原的CTL活性。　　3.报告基因转染法　　应用基因转染技术将原核或真核生物的报告酶如β-半孔糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）或荧光素酶（luciferase,luc）基因转染靶细胞，建立稳定转染靶细胞系，以此测定CTL、NK细胞及药物介导的细胞毒和细胞凋亡(Apoptosis)。通过测定释放入培养液中报告酶活性（代表靶细胞死亡数目），可以计算效应细胞杀伤靶细胞%。其中β-gal半衰期较luc长，应用较为方便。　　4 比色测定法　　4.1 MTT（或MTS）还原法　　本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可计算效应细胞杀伤靶细胞%。　　4.2 LDH释放法　　酸脱氢酶（LDH）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤%。　　5 其他　　5.1 “鸡尾酒“混合刺激法　　将外周血细胞在体外用一种含有抗原、细胞因子、共刺激分子及放射照射的饲养细胞的混合“鸡尾酒”刺激7天后，在有限稀释条件下可从微孔板快速测得抗原特异性信号。本法灵敏性高，较传统的CTL测定方法更有效，尤其是本法仅需150μl小鼠外周血而无需处死动物，因此可增加每次测定时的小鼠数量，还可在体内研究过程中于不同时间从每个小鼠多次取血测定，大大方便了CTL反应及其体内效果的相关性研究。　　5.2 ELISPOT试验　　酶联免疫斑点试验（ELISPOT）通过检测抗原诱导的细胞因子（如IFN-γ）的分泌，可在体外定量测定病人PBMC中抗原特异性T细胞反应(T细胞受抗原刺激产生并释放IFN-γ)。本法在肽特异性分泌IFN-γ的T细胞数量与细胞毒活性之间，与标准的51Cr释放法相关良好，是一种在临床试验中监测病人对肿瘤抗原的CTL或Th-细胞反应的灵敏、准确、价廉、的方法，可对肿瘤病人的抗肿瘤疫苗(vaccine)疗法的优化提供必要的信息。　　以上几种CTL测定方法各有特点，其中随着荧光测定仪器的普及和新的荧光标记物的发现，荧光测定法将有可能取代传统的51Cr释放法，而微量和直接测定体内CTL活性的方法将为细胞免疫研究开辟新路。

关于荧光小菇类的发光机制至今尚未被阐明，但是似乎与萤火虫的发光机制有所差别。萤火虫的发光机制是体内的荧光素（luciferin）、荧光酵素（luciferase）、ATP及氧的化学反应而发光，笔者曾就荧光小菇进行研究，其发光的时间似乎有日周期性，一般荧光小菇自“出菇”注一后约莫可存活3天，其间若白天将荧光小菇移进室内暗处，并不会发光，直至傍晚时分才发出淡淡的绿光，但若混乱其光周期性，即使白天在暗室内依旧会发光。荧光小菇发光时，只有蕈伞会发光，蕈柄及菌丝体并不会发光，参照国外文献几乎可以确定在菌丝产生核融合注二产孢时会发光。为何荧光蕈类要在夜晚发光至今尚无定论，一般推测为吸引特定昆虫帮其散播孢子。

如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，从而对基因的表达起抑制或增强的作用，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，荧光素酶与底物反应，如pGL3-basic等。（3） 加入特定的荧光素酶底物转录因子是一种具有特殊结构，也称为反式作用因子。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，这些特异性的序列被称为顺式作用元件、行使调控基因表达功能的蛋白质分子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合。（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合。其原理简述如下，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比，产生荧光

miRNA sponge抑制载体，经特异地优化设计，增强吸附能力的同时增加了更多的结合位点，这样提高了成熟miRNA或siRNA抑制能力，消弱细胞中miRNA或siRNA导致的基因沉默效应，从而进行miRNA或siRNA功能缺失性研究。MiRNA sponge载体与化学修饰的反义寡核苷酸相比，有它无可比拟的优势：a. 由于miRNA sponge是由质粒编码的，可以反复使用；b. 它能够通过包装慢病毒颗粒达到稳定沉默细胞microRNA的细胞系，有利于进行对原代细胞和难转染细胞miRNA的抑制； c. 能够沉默整个家族的microRNA以达到对整个家族microRNA功能的研究； d. 可以利用miRNA sponge实现体内外loss of function研究；e. 可以用来检测luciferase靶基因报告系统分析；f. 可以自由组合串联不同miRNA抑制子序列，达到沉默多种不同miRNA的目的。

国际标准是0，融合基因正常值小于0.1%而各个医院的内参值不等，需要换算。融合蛋白有两种不同的含义,一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。另一种含义就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白,如在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一，介导病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。另一种糖蛋白是血细胞凝集素神经酰胺酶。检查不同，数值也不相同，那么意义就存在了差别。扩展资料所谓融合基因，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连．置于同一套调控序列（包括启动子、增 强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成的嵌合基因。融合基因的表达产物为融合蛋白。根据构成融合基因的种类，可以将融合基因分为四大类：（1）由报告基因和功能基因构成的融合基因。常用的报告基因有：GFP（绿色荧光蛋白）基因、GUS基因、LacZ基因和Luciferasese（虫荧光素酶）基因等，主要目的是对功能基因进行示踪，研究其功能及特性。（2）由信号肽或单体蛋白的序列与功能基因构成的融合基因。其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白，为生产或科研所用。（3）功能基因与功能基因的融合。可分为两类：A相同功能基因的融合，目的是增强基因的功能，扩大基因的应用范围，如杀虫基因之间的融合。B．不同功能基因的融合，为特殊需要而构建，如生产无毒疫苗等。（4）报告基因与抗药性基因的融合用于构建融合载体，以利于插入大片段的cDNA或作为双功能标记。参考资料：百度百科-融合基因