u6启动子原理

近年研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（double：stranded：RNA，dsRNA）导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，从而导致相应的基因沉默，这种转录后基因沉默机制（post-transcriptional：gene：silencing，PTGS）被称为RNA干扰（RNA：interference，RNAi）。RNAi是真核生物中一种非常保守的机制，它与协同抑制（cosuppression）、转座子沉默（transposon：silencing）以及发育等许多重要的生物学过程密切相关。RNA干扰依赖于小干扰RNA（small：interference：RNA，siRNA）与靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性，涉及众多基因和蛋白复合物，构成了一个以小RNA为核心的真核基因表达调控系统，它可以在染色质水平、转录水平、转录后水平和翻译水平参与基因表达的调节。RNA干扰技术为人们迅速、准确地剖析基因的功能，分析基因之间错综复杂的联系和相互作用提供了极为有用的工具，同时也为人们预防和治疗癌症和病毒疾病提供了新的思路。RNAi是由双链RNA分子在mRNA水平关闭相应基因表达或使其发生沉默的过程，可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质，因此，RNAi技术又被形象地称为基因敲除（knock-down）或基因沉默（gene：silencing），是一种典型的转录后基因调控方法，因此又称转录后基因沉默（PTGS）。RNAi现象广泛存在于生物界中，它在真菌中被称为quelling，在拟南芥、烟草等植物中被称为PTGS或共抑制（co-suppression），在无脊椎动物如果蝇、水螅、线虫以及脊椎动物斑马鱼、小鼠等动物界中被称为RNAi，它可能是生物界，包括植物和动物等普遍存在的一种古老、保守而又极其重要的遗传行为。

RNAi=RNA interference RNA干预或者干涉(RNA=核糖核酸)

rnai技术的基本原理如下：RNA干涉(RNA interference，简称RNAi)是指一些小的双链RNA (double strand RNA,dsRNA)可以高效、 特异的阻断体内 特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术。可以快速分析靶基因的功能，RNAi发展迅速，已成为功能基因组研究和反向遗传学研究的有力工具。RNAi技术被《Science》杂志评为2002年度的十大科技突破。u200dRNAi的分子机制①外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，产生一些dsRNA。胞质中的核酸内切酶Dicer将这些dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的短双链RNA(大约21~25 bp)，即siRNA。②siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，然后反义siRNA再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。③RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，被切割后的断裂mRNA随即降解。④RNAi信号的放大：siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在依赖RNA的RNA聚合酶(RNdependent RNA polymerase, RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

【答案】：RNAi指内源性或外源性双链RNA((tsRNA)介导的细胞内mRNA特异性降解，导致靶基因表达沉默的现象。dsRNA首先被内切核酸酶(dicer)切成长度为19～25个核苷酸的小的RNA干扰(siRNA)片段。然后siRNA与RNA诱发的沉默复合物(RISC)结合，形成siRNA-RISC。RISC-siRNA复合物与一个mRNA分子结合并将其降解后，该复合物还可以作用于另一个mRNA分子，因此一个RISC-siRNA复合物可以降解多个mRNA分子。

RNAi(RNA干扰)现象是指，当与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA导入细胞后 ，该mRNA发生特异性的降解 ，而导致该基因表达的沉寂 。 从理论上讲 ，分子生物学家只要知道某种基因的DNA序列 ，就可以设计出序列特异性的双链RNA分子 ，作为这种基因的特异性抑制物而影响此基因的表达 。任何植物、线虫、果蝇、脊椎动物的基因都可以通过RNAi技术使其发生表达沉寂，所以RNAi技术已成为后基因组时代生命科学研究的有力工具 。在水稻中利用RNAi技术来验证定位的基因 。如根据定位的矮秆或多蘖基因所在的BAC设计引物 ，获得小片段cDNA ，再将其连到载体中通过农杆菌介导法导入正常的植物体内 ，让其在植物体内表达 。 RNAi的发现 首次发现dsRNA 能够导致基因沉默，来源于线虫的研究 。1995年科研人员尝试用反义RNA去阻断par-1基因的表达以探讨该基因的功能 ，经过反义RNA的确能够阻断par-1基因的表达 。 在1990年 ，科学家们试图相矮牵牛花转导色素合成基因 ，用于增加花瓣的色彩 ，其结果出乎预料 ，转基因植株不仅没有新基因的表达 ，反而自身的色素合成也减弱了 ，一些转基因花出现了全白色或部分白色 。1996年，有人在真菌研究中也发现了类似现象 。在粗糙脉孢菌中 ，导入合成胡萝卜素的基因后 ，引起了约30%被转化细胞的脉孢菌自身基因的失活 。RNAi发现以后 ，人们相继在烟草和拟南芥等植物中证明dsRNA可以引起植物的RNAi现象 。 到1998年，有科学家将dsRNA注入到优美新小杆线虫体内 ，发现虫体内与dsRNA同源的内源性基因表达沉默 ，称此现象为RNAi。随后 ，RNAi现象被广泛的发现存在于真菌 、拟南芥、水蛭、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中 ，并且线虫和果蝇成为研究RNAi的两个最常见的模式生物 。随后在培养的哺乳动物细胞中成功进行了RNAi。由此可见 ，RNAi是生物界中广泛存在的一种现象 。 RNAi技术具有高效性和高度特异性 ，作为关闭基因的新技术 ，已成为基因功能研究中的一种快速、简便的方法 。由于可以作为代替基因敲除的基因工具 ，RNAi技术正在改变着功能基因组学领域的研究步伐 。 随着RNAi技术的不断完善 ，它将为生命科学的研究发挥越来越重要的作用 。

RNAi技术是指利用体外合成的短双链RNA（21-23个核苷酸）抑制细胞内特定基因表达的技术，是转录后基因沉默的一种研究基因功能的有力工具。

RNAi发挥作用的过程可分为两个阶段，即起始阶段和效应阶段。在起始阶段，双链RNA分子进入细胞后被称为Dicer的核酸酶切割为2123个核苷酸长的小分子干扰RNA片段（small：interfering：RNA，siRNA）。Dicer核酸酶属于RNaseⅢ家族，能够特异识别双链RNA，产生的小片段RNA的3′端都有2个突出碱基。然后双链siRNA与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced：silencing：complex，RISC），随后进入RNA干扰效应阶段，即siRNAs打开双链从而激活RISC，激活的RISC通过碱基配对与具同源序列的mRNA识别并结合，并在距离siRNA：3′端12个碱基的位置切割mRNA。同时，siRNA可作为引物并以mRNA为模板合成新的dsRNA。这样又可进入上述循环，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。确切切割机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的核酸酶。

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虽然对RNAi的研究只有短短几年时间，但RNAi技术已经快速被应用于多个领域，目前在植物上主要用于基因功能研究。随着基因组测序技术的快速发展，科学家急需一种新的、快速的方法解读基因的功能和基因的表达机制以及基因之间的相互关系。而RNAi技术已成为解决这些问题的重要手段。与其他方法相比，RNAi技术在基因功能研究上有其独特的优点：①简单易行，容易开展；②与基因敲除（gene：knockout）相比实验周期短，成本低；③与反义技术相比具有高度特异性和高效性；④可进行高通量（high-throughout）基因功能分析。因此，RNAi技术的诸多优点使它很快便被作为研究基因功能的主要方法。在临床应用上，RNAi机制可抑制外源和内源有害基因的表达，如利用RNAi技术把与病毒基因具同源性的siRNA引入感染细胞将会抑制病毒的增殖，这为相关疾病的治疗提供了新的思路。另外，利用RNAi技术还可以高效、特异、快速的抑制细胞内癌基因的表达。可以预测，RNAi技术将会为癌症和病毒疾病治疗带来突破。

其简单过程是，双链RNA分子被一类成为Dicer的酶剪切成小RNA分子（~35nt），然后与若干蛋白结合形成复合体，经过活化，能特异性结合目标mRNA使其降解。 表观遗传学又称为后遗传学，是近来很热门的研究领域。与经典的遗传学研究不同，研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因功能的改变。简单来说，就是研究从DNA到蛋白过程中可逆的、可遗传的变化。最典型的就是DNA的修饰和组蛋白的修饰，因为这些不同修饰会导致基因的沉默或表达的变化。 RNAi可以看成是一种表观遗传学的一部分。RNAi是对mRNA水平上的调控，没有DNA序列的变化，存在很多内源性的RNAi，很多还在研究中。

RNAi首先由Fire等1998年发现于秀丽新小杆线虫（emphasis：role=italicCaenorhabditis：elegansemphasis），他们将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达，并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又称RNAi为转录后基因沉默（postt：ranscriptional：gene：silencing，PTGS）。随后人们陆续在果蝇emphasis：role=italic（Drosophila）emphasis、锥虫（emphasis：role=italicTrypanosomesemphasis）、涡虫（emphasis：role=italicPlanariaemphasis）、斑马鱼（emphasis：role=italicZebrafishemphasis）、拟南芥（emphasis：role=italicArabidopsis：thalianaemphasis）、大小鼠和人体内发现了RNAi现象，遗传学研究表明RNAi是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制，与真核细胞中许多重要生物学过程密切相关。随后，RNAi技术被成功地应用到某些哺乳动物细胞中，展示了此项研究更为广阔的应用前景。

RNA干扰科技名词定义中文名称：RNA干扰英文名称：RNAinterference;RNAi定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科）定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）直接度娘

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RNA干扰科技名词定义中文名称：RNA干扰英文名称：RNAinterference;RNAi定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科）定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）直接度娘

通过导入与目标基因mRNA部分片段互补的21bp的双链RNA，能够高效引发目的基因沉默，这就是RNAi（RNA干扰）。原理就是，短片段的双链RNA在体内能在酶（Dicer）

　　1 RNAi的机制　　RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成-22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponent nuclease，RISC)并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达.　　RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员. Dicer酶广泛存在于蠕虫、真菌、物及哺乳动物体内. 他的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点. 在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21-23个核苷酸的siRNA，他启动了细胞内的RNAi反应. 因少量双链RNA即能阻断基因表达，且此效应可传至子代细胞，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统. 研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP). 在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增. 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成小片段siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA. 小片段siRNA生成后与核酸酶形成复合物，随后mRNA与小片段的正义链置换，被mRNA替代. mRNA的位置与最初正义链的位置相同，从而被核酸酶在相同的位点降解. 更有意义的是mRNA的降解使核酸酶得以再生，这样周而复始，mRNA得以降解，因此RNAi呈酶解动态.　　由于mRNA也以21-23 nt的特定间隔降解，因此认为降解dsRNA与mRNA的核酸酶相同. 另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链. 结果mRNA也变成了双链RNA，他在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA. 这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制. RNAi不同于其他基因阻断技术，他是转录后水平的基因静默机制，因此注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应. RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果. dsRNA小片段如小于21-23 nt (如10-15 nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21-23 nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围. RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代　　2 双链RNA的构建　　双链RNA可先在体外构建好，用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差，转化到细胞内的双链RNA半衰期短. 而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用. 构建双链RNA表达载体，使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成. 因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，他指导的转录就会终止，且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，因此合成的RNA无polyA尾. U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别，合成出RNA. Sui et al 用Bluescript作为载体，RNA多聚酶Ⅲ可识别的U6作为启动子，从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1)，将其插入到Bluescript载体中. 然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2. 他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA. 片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止. 而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3"端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而有利于双链RNA诱发RNAi. RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA. T7也可作为启动子合成dsRNA. 将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体. 用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA. 在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶. 腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al 用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA，并成功的阻断了基因的表达.　　RNA interference (RNAi) is a mechanism in molecular biology where the presence of certain fragments of double-stranded RNA (dsRNA) interferes with the expression of a particular gene which shares a homologous sequence with the dsRNA. RNAi is distinct from other gene silencing phenomena in that silencing can spread from cell to cell and generate heritable phenotypes in first generation progeny when used in Caenorhabditis elegans.　　Before RNAi was well characterized, it was called by other names, including post transcriptional gene silencing and transgene silencing. Only after these phenomena were characterized at the molecular level was it obvious that they were the same phenomenon.　　The use of RNA to reduce expression in plants has been a common procedure for many years. Single-stranded antisense RNA was introduced into plant cells that hybridized to the cognate, single-stranded, sense messenger RNA. While scientists first believed that the resulting dsRNA helix could not be translated into a protein, it is now clear that the dsRNA triggered the RNAi response. The use of dsRNA became more widespread after the discovery of the RNAi machinery, first in petunias and later in roundworms (C. elegans).　　RNAi原理图解　　http://lddljf.stedu.net/Article_Show.asp?ArticleID=1974　　RNAi知识介绍powerpoint　　1 http://www.biox.cn/content/20050519/13420.htm　　2 http://www.biox.cn/content/20050519/13422.htm　　3 http://www.biox.cn/content/20050519/13423.htm　　4 http://www.biox.cn/content/20050519/13425.htm　　5 http://www.biox.cn/content/20050519/13426.htm　　6 http://www.biox.cn/content/20050519/13429.htm　　7 http://www.biox.cn/content/20050519/13431.htm　　8 http://www.biox.cn/content/20050519/13433.htm　　9 http://www.biox.cn/content/20050519/13434.htm参考资料：任玥欣, 宋于刚, 陈学清. RNAi研究进展. 世界华人消化杂志 2004;12(3):748-750 http://www.wjgnet.com/1009-3079/12/748.asp

RNAi是把这个基因沉默掉，其主要目的还是验证这个基因的功能 过表达,如果是在野生型中表达这个基因，其目的还是验证基因功能的，可以和RNAi同步做但是如果是在其他突变体中过量表达该基因，则是研究这两个基因的依赖关系~~

rnaiRNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi的定义目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。 如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。 各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。原理最近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNAi领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA（见图）。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3"末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰（6、7）。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能（4、8）。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的组分H1 RNA（11）转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来（6、12、13）。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象（11）。另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷（14）。一个5"端为两个2"-O-甲基RNA、3"端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。RNA干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉（15、16）。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验（17）。注射siRNA之后，小鼠肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。总的来说，siRNA的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。应用siRNA可用于研究基因的功能，可是后基因组时代的今天，研究人员已经不满足于一个一个基因沉默这样的研究节奏了，功能基因组学的研究更需要一个能站在全局高度研究多个基因之间关系的工具，因此，用作大规模RNA干扰用的shRNA/siRNA文库应运而生。 shRNA/siRNA文库联合使用高通量筛选技术和高内涵图像分析技术，使得RNAi筛选在反向基因组学、功能基因研究、药物发现等多个领域成为了一个 强大的应用工具。北京赛诺亚生物技术有限责任公司（）是一家拥有独立自主产权的、以RNAi筛选的相关产品和技术服务为重点生物高新技术企业。公司专业从事各种高通量miRNA检测、RNA干扰筛选、药物筛选、文库筛选及相关产品的研发和销售，同时提供进行各种RNAi相关的载体构建、病毒包装 服务和细胞生物学试剂。公司致力于为从事生命科学研究和早期药物研发的科研人员提供一站式的RNA干扰相关服务。总结经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA（这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。

RNAi历史RNAi现象早在1993年就有报道： 将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA（anti sense RNA和正义RNA（sense RNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年，Andrew Fire 和 Craig Mello的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。RNAi作用机理大约200nt以上的长双链RNA能够进过RNAi途径在很多物种(如：线虫、果蝇、脊椎动物、植物等)沉默靶基因的表达。首先，这些双链RNA被Dicer酶(一种类RNase III酶)加工成20-25 nt的siRNA，而后这些siRNA被组装进入一种RNA依赖的沉默复合物。最后，这些siRNA与RNA分子互补配对，并引导RISC剪切、降解RNA分子。在哺乳动物中，>30nt的长双链RNA将引起潜在的抗病毒效应，引起非特异性RNA降解，抑制蛋白质合成。通过导入短片段(<25nt) siRNA可以避免哺乳动物的抗病毒效应，正确行使RNAi功能。化学合成siRNA的优势越来越多的研究人员开始采用RNAi技术研究基因功能组学，药物靶点筛选，细胞信号通路分析等。RNAi药物研发进展RNAi已经成为目前基因功能研究，药靶发现以及药物开发的基础，RNAi药物将有望成为的一种更为高效快捷的疾病治疗途径。siRNA在临床上应用必须克服技术上难题，主要包括改善siRNA药物动力学特性，避免脱靶效应和干扰素反应等。核酸化学和导入方面取得了巨大的进展，使得RNAi治疗法更具前景和潜能，RNAi药物势必大大推动临床药物开发进程，为临床治疗带来一场革命性变革。过去的几年里，很多公司在RNAi领域都取得了很大的成就。初步统计，大约有19个公司正在开发85种siRNA药物，8个公司正在开发64种反义核酸药物。这些药物主要集中在癌症、肿瘤、心血管、眼部、抗病毒、呼吸道、抗菌、糖尿病等方面。目前Alnylan、默克、罗氏处于RNAi药物研究的第一阵营，其他大公司也都在开展siRNA药物的研发合作或独立研究。RNAi药物实例 2006年6月美国基因治疗学会年会上公布了世界首次 siRNA临床试验获成功这一振奋人心的消息。这项临床试验表明，靶向血管内皮生长因子（VEGF）基因的siRNA能够有效治疗老年性黄斑变性（AMD）。这项试验的成果是RNA疗法发展的一个里程碑，siRNA将在不久成为高效的分子药物应用于临床治疗。近年来，针对多种疾病的siRNA药物已经相继进入临床试验的不同阶段。大家可能注意到，绝大多数RNAi药物都是化学合成siRNA，原因存在多个方面：操作简便、可控；转染效率较高；对细胞毒副作用小；可进行各种修饰、连接；可大规模筛选；可大规模制备等。 事实上，很多制药公司在RNAi上投入了大量的资源，以 siRNA 作为治疗手段的前景诱人， siRNA 从发现到现在短短几年的时间内，第一个 RNAi 药物 Bevasiranib （ Acuity 公司）已经诞生 , 用于治疗湿性老年性黄斑变性 (AMD) 。 据报道：FDA已经批准了Quark药业用于肾移植病人的试验siRNA药物DGFi的新药临床试验申请。在2008年下半年，I期或II期临床试验已启动。目前Alnylam是RNAi药物研发的领头羊，它的siRNA研究领域比较广，已经有一些RNAi药物在临床阶段，尤其是在抗病毒方面有的已经到临床三期了，预计RNAi药物五年内就可以上市了。Alnylam开发的 RNAi 药物用来治疗呼吸道合胞病毒、流行性感冒、帕金森病和高胆固醇血症等。siRNA作为药物会比一般小分子药物开发要快，选择性会更好，如果能够更好地解决药物靶细胞递送，相信可以治疗许多现在药物治疗效果不理想的疾病。我国在创新药物方面的研究还远远落后于西方国家。而RNAi 技术的发展历史很短，是一项刚刚兴起不久的生物技术，虽然我们目前已经与发达国家有一定差距，但差距仅有几年的时间，如果我们加速发展，完全有条件赶超发达国家，有可能在一定时期内在创新药物开发方面取得突破性进展。特别是，利用这一技术可弥补我国在化学制药方面与发达国家之间的巨大差距。这一项新技术给我们带来了一个千载难逢的发展机遇。

RNA干扰的分子抑制机制的三种方式及原理转录抑制 与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域从头合成DNA的甲基化。Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。转录后抑制不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生siRNA片断，再由合成的RISC切割靶mRNA从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻断，这种RNAi方式叫做转录后沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS)。siRNA对靶mRNA降解具有序列特异性，只能引起同源mRNA降解，如果siRNA与mRNA有一个bp不配对，RNAi作用就极大降低，如果两者有4个bp不配对，就不能产生RNAi。翻译抑制 Grishok等在研究RNAi时，发现在细胞中在细胞中存在内源性小片段单链RNA(ssRNA)，其长度也在21～25 nt之间，这种ssRNA可与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)特异性地结合，从而抑制mRNA的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的ssRNA叫做stRNA(small temporal RNA)。ssRNA的形成是因为当RNA的大小为70～80 nt时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在21～25 nt之间，这样的双链结构易被Dicer酶识别并切割成stRNA，由stRNA抑制翻译。这种方式的RNAi也作用于转录后形成的mRNA，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。

分类: 社会民生 解析: 在脱氧核糖核酸和核糖核酸中，起配对作用的部分是含氮碱基。5种碱基都是杂环化合物，氮原子位于环上或取代氨基上，其中一部分（取代氨基，以及嘌呤环的1位氮、嘧啶环的3位氮）直接参与碱基配对。 碱基共有5种：胞嘧啶（缩写作C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T，DNA专有）和尿嘧啶（U，RNA专有）。顾名思义，5种碱基中，腺嘌呤和鸟嘌呤属于嘌呤族（缩写作R），它们具有双环结构。胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶属于嘧啶族（Y），它们的环系是一个六元杂环。RNA中，尿嘧啶取代了胸腺嘧啶的位置。值得注意的是，胸腺嘧啶比尿嘧啶多一个5位甲基，这个甲基增大了遗传的准确性。 碱基通过共价键与核糖或脱氧核糖的1位碳原子相连而形成的化合物叫核苷。核苷再与磷酸结合就形成核苷酸，磷酸基接在五碳糖的5位碳原子上。 碱基: 腺嘌呤 - 胸腺嘧啶 - 尿嘧啶 - 鸟嘌呤 - 胞嘧啶 - 嘌呤 - 嘧啶 核苷: 腺苷 - 尿苷 - 鸟苷 - 胞苷 - 脱氧腺苷 - 胸苷 - 脱氧鸟苷 - 脱氧胞苷 核糖核苷酸: AMP - UMP - GMP - CMP - ADP - UDP - GDP - CDP - ATP - UTP - GTP - CTP - cAMP - cGMP 脱氧核苷酸: dAMP - dTMP - dUMP - dGMP - dCMP - dADP - dTDP - dUDP - dGDP - dCDP - dATP - dTTP - dUTP - dGTP - dCTP 核酸: DNA - RNA - LNA - PNA - mRNA - ncRNA - miRNA - rRNA - shRNA - siRNA - tRNA - mtDNA - Oligonucleotide 核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。 RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤，G鸟嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成为RNA的特征碱基。 与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。 在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA）, rRNA（核糖体RNA）, mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。 在病毒方面，很多病毒只以RNA作为其唯一的遗传信息载体（有别于细胞生物普遍用双链DNA作载体）。 1982年以来，研究表明，不少RNA，如I、II型内含子，RNase P，HDV，核糖体大亚基RNA等等有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类RNA被称为核酶（ribozyme）。 20世纪90年代以来，又发现了RNAi（RNA interference，RNA干扰）等等现象，证明RNA在基因表达调控中起到重要作用。

VIGS 病毒诱导的基因沉默。 原理都是一样的，只不过是利用病毒诱导的RNA干扰。病毒做为载体（插入你靶基因的片段）去侵染寄主，引起靶基因沉默。

细胞内主要的RNA包括mRNA,tRNA,rRNA三种。1.信使RNA(mRNA)主要功能：携带着决定氨基酸排列顺序的信息，在蛋白质合成过程中起模板作用。2.转运RNA(tRNA)主要功能：转运特定的氨基酸，识别信使RNA上的遗传信息。3.核糖体RNA(rRNA)主要功能：是核糖体的组成物质。核糖体是蛋白质合成的场所。

1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！科学界对此感到极度困惑。类似的谜团，直到美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛发现核糖核酸RNA（核糖核酸）干扰机制才得到科学的解释。两位科学家也正是因为1998年做出的这一发现而荣获2006年的诺贝尔生理学或医学奖。上世纪八十年代，托马斯.R.切赫博士在研究RNA的成熟体结构中，发现了可以自我拼接的RNA催化作用（核糖核苷酸酶），并依此荣获1989年诺贝尔化学奖。经过多年的深度研究，切赫博士在DNA基因遗传过程中，发现了有趣的mRNA（信使RNA）和tRNA（转运RNA），从而揭开了遗传基因导致出生缺陷、大脑发育、营养吸收、细胞变异以及健康长寿等一系列人类生命密码的神秘面纱。mRNA（信使RNA）人类的遗传信息主要贮存于DNA的碱基序列中，不过DNA并不直接决定蛋白质的合成。而在真核细胞中，DNA主要贮存于细胞核中的染色体上，而蛋白质的合成场所存在于细胞质中的核糖体上，因此需要有一种中介物质，才能把DNA 上控制蛋白质合成的遗传信息传递给核糖体。切赫博士把这种起着传递遗传信息作用的特殊RNA。称为信使RNA(messenger RNA，mRNA）。简单的说，mRNA就是为了完成基因表达过程中的遗传信息传递。令人遗憾的是，在遗传转录形成的过程中，仅有25%序列经加工成为mRNA，其余的均呈现非编码序列的前体mRNA形式，这些形势的mRNA在分子大小上差别很大，是导致出生缺陷、大脑发育、营养吸收、细胞变异以及健康长寿等一系列问题的基因遗传因素的关键所在。切赫博士历经20年升华钻研，成果破译了mRNA编码序列信息奥秘，通过特殊的生物干预手段，优化mRNA的序列加工，筛查和剔除基因排列诱发基因和细胞突变的序列，不仅确保mRNA的序列加工的有效与增强，而且从根本上避免不良基因传递或传递序列问题引发细胞突变等一系列遗传问题的发生。mRNA编码序列信息的成果破译，奠定了OMG配方盐技术的可行性基础。法尔和梅洛的发现科学家在矮牵牛花实验中所观察到的奇怪现象，其实是因为生物体内某种特定基因“沉默”了。导致基因“沉默”的机制就是RNA干扰机制。此前，RNA分子只是被当作从DNA（脱氧核糖核酸）到蛋白质的“中间人”、将遗传信息从“蓝图”传到“工人”手中的“信使”。但法尔和梅洛的研究让人们认识到，RNA作用不可小视，它可以使特定基因开启、关闭、更活跃或更不活跃，从而影响生物的体型和发育等。诺贝尔奖评审委员会在评价法尔和梅洛的研究成果时说：“他们的发现能解释许多令人困惑、相互矛盾的实验观察结果，并揭示了控制遗传信息流动的自然机制。这开启了一个新的研究领域。”siRNA 的作用原理RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因，细胞中出现了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1）编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶，具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合，形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA（与dsRNA具有同源序列）与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex （RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应。RNA干扰技术的前景RNA干扰技术不仅是研究基因功能的一种强大工具，不久的未来，这种技术也许能用来直接从源头上让致病基因“沉默”，以治疗癌症甚至艾滋病，在农业上也将大有可为。从这个角度来说，“沉默”真的是金。美国哈佛医学院研究人员已用动物实验表明，利用RNA干扰技术可治愈实验鼠的肝炎。尽管尚有一些难题阻碍着RNA干扰技术的发展，但科学界普遍对这一新兴的生物工程技术寄予厚望。这也是诺贝尔奖评审委员会为什么不坚持研究成果要经过数十年实践验证的“惯例”，而破格为法尔和梅洛颁奖的原因之一。诺贝尔生理学或医学奖评审委员会主席戈兰·汉松说：“我们为一种基本机制的发现颁奖。这种机制已被全世界的科学家证明是正确的，是给它发个诺贝尔奖的时候了。”

什么是CRISPR/Cas9？ CRISPR----Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。 07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的 CRIS

siRNA的结构和功能之间存在相关性：dsRNA经过切割形成2025nt的siRNA，它们具有5′末端的磷酸基，3′末端的羟基和2个突出的单链核苷酸。这种结构对于RNAi是十分必要的，Nykanen等的研究表明平末端的siRNA或失去5′-P基团的siRNA不具有RNAi的功能。所以，siRNA的三大结构特征是：长度为2123nt、双链两端各有两个突出的3′端有羟基、5′端有磷酸基团。这些特征使得siRNA有别于其他的dsRNA，这也是细胞能够区分出真正的siRNA和其他dsRNA的分子基础。基于RNAi的这一特性，细胞可以自行监控异常的mRNA，并封闭该基因的表达。

一、区别：1、DNA的组成碱基是ATGC，单位是脱氧核苷酸。RNA的组成碱基是AUGC，单位是核糖核苷酸。2、DNA是双螺旋结构，属于遗传物质。RNA一般是单链，不作为遗传物质。3、RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。4、与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。5、在病毒方面，很多病毒只以RNA作为其唯一的遗传信息载体（有别于细胞生物普遍用双链DNA作载体）。6、RNA中的mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录，tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者，rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。二、DNA是高分子聚合物，DNA溶液为高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线（260nm）有吸收作用，利用这一特性，可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时，吸光度升高，称为增色效应。三、相对而言其他的蛋白质则只能与特定的脱氧核糖核酸序列进行专一性结合。大多数关于此类蛋白质的研究集中于各种可调控转录作用的转录因子。这类蛋白质中的每一种，都能与特定的脱氧核糖核酸序列结合，进而活化或抑制位于启动子附近序列的基因转录作用。四、转录因子有两种作用方式，第一种可以直接或经由其他中介蛋白质的作用，而与负责转录的RNA聚合酶结合，再使聚合酶与启动子结合，并开启转录作用。第二种则与专门修饰组织蛋白的酵素结合于启动子上，使脱氧核糖核酸模板与聚合酶发生接触的难度改变。扩展资料：一、RNA：1、在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA、rRNA，以及mRNA。mRNA是依据DNA序列转录而成的蛋白质合成模板；tRNA是mRNA上遗传密码的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的部分，而核糖体是蛋白质合成的机械。2、细胞中还有许多种类和功能不一的小型RNA，像是组成剪接体（spliceosome）的snRNA，负责rRNA成型的snoRNA，以及参与RNAi作用的miRNA与siRNA等，可调节基因表达。而其他如I、II型内含子、RNase P、HDV、核糖体RNA等等都有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类RNA被称为核酶。二、DNA：1、DNA（脱氧核糖核酸）是人身体内细胞的原子物质。每个原子有46个染色体，另外，男性的精子细胞和女性的卵子，各有23个染色体，当精子和卵子结合的时候。这46个原子染色体就制造一个生命，因此，每人从生父处继承一半的分子物质，而另一半则从生母处获得。2、DNA检验可弥补血清学方法的不足，故受到了法医物证学工作者的高度关注，近几年来，人类基因组研究的进展日新月异，而分子生物学技术也不断完善，随着基因组研究向各学科的不断渗透，这些学科的进展达到了前所未有的高度。参考资料：百度百科-RNA、百度百科-DNA

shRNA是形成发卡结构的，有配对形成双链的区域siRNA是单链的，可以有各种途径产生，也有成熟的产品可以订购RNAi是一种效应的名称，比如shRNA、siRNA、miRNA等都能产生RNAi

UAS/GAL4系统：是果蝇遗传学中一种常用的异位表达系统。与原核生物乳糖操纵子相似，在酵母中GAL4与UAS结合可以调节与半乳糖代谢相关基因的表达。1988年，Fischer等将GAL4在果蝇的特定组织中表达，发现GAL4能以组织特异性的方式激活与UAS相连接的下游基因的转录。该工作为Brand等1993年的经典之作提供了理论基础。rk RNAi全称应该是UAS-rk rnai。例如Act5C-GAL4处女果蝇和UAS-rk rnai雄果蝇杂交，后代的基因型表示是：Act5C>rk RNAi，意思是在全身表达rk rnai基因干扰的果蝇

Small interfering RNA (siRNA)：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸）,由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成.SiRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补的目标mRNA的沉默.RNA干涉(RNAinterference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解,从而导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失的现象.RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具,利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂,迅速阻断基因活性.siRNA在RNA沉默通路中起中心作用,是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素.siRNA是RNAi途径中的中间产物,是RNAi发挥效应所必需的因子.siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成.由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA,当dsRNA达到一定量的时候,Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶,具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域,III型RNA酶活性区域,dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合,形成酶-dsRNA复合体.Dicer 切割后形成siRNA,然后,在ATP的参与下,细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白.siRNA并入RISC中,然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对,降解靶标基因,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA.其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达,所以是一种典型的负调控机制.siRNA识别靶序列是有高度特异性的,因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生,所以这些中央的碱基位点就显得极为重要,一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应.RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和简单性,所以是基因功能研究的重要工具.大多数药物属于标靶基因（或疾病基因）的抑制剂,因此RNAi 模拟了药物的作用,这功能丢失（LOF)的研究方法比传统的功能获得（GOF)方法更具优势.因此, RNAi 在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具.同时,那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物.在药物标靶发现和确认方面,RNAi技术已获得了广泛的应用.生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞,然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因.如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因.一旦所发现的基因属于可用药的靶标（如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外）,就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选.此外,被发现的靶标还可用RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认.在疾病治疗方面,双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗,如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等.在抗病毒治疗方面,帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法.肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果.

RNA（核糖核酸），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA大体可以分为三类mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、tRNA(转运RNA)。mRNA tRNA rRNA的区别：1、功能不同：rRNA是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体（ribosome）。tRNA是分子最小的RNA，又称转运RNA。如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图，则核糖体是合成蛋白质的工厂。tRNA把氨基酸搬运到核糖体上，tRNA能根据mRNA的遗传密码，依次准确地将它携带的氨基酸，掺入正在合成的肽链中，实现肽链的延伸。mRNA功能是在蛋白分子合成过程中，作为“信使”分子，将基因组DNA的遗传信息（即碱基排列顺序）传递至核糖体，使核糖体能够以其碱基排列顺序掺入互补配对的tRNA分子，进而合成正确的肽链，实现遗传信息向蛋白质分子的转化。2、细胞中的含量不同：在大肠杆菌中，rRNA量占细胞总RNA量的75%～85%，而tRNA占15%，mRNA仅占3～5%。在真核生物中，转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列，大约只有25%序列经加工成为mRNA，最后翻译为蛋白质。扩展资料：RNA的组成结构：与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。在病毒方面，很多病毒只以RNA作为其唯一的遗传信息载体（有别于细胞生物普遍用双链DNA作载体）。细胞中还有许多种类和功能不一的小型RNA，像是组成剪接体（spliceosome）的snRNA，负责rRNA成型的snoRNA，以及参与RNAi作用的miRNA与siRNA等，可调节基因表达。而其他如I、II型内含子、RNase P、HDV、核糖体RNA等等都有催化生化反应过程的活性，即具有酶的活性，这类RNA被称为核酶。参考资料来源：百度百科-RNA

RNAi的可遗传性：初期的实验观察到，在秀丽新小杆线虫、果蝇和小鼠的实验可以看到，细胞增殖50100倍仍可保持RNAi效应。这说明RNAi有放大的效应，或者有高效的催化机制。然而，虽然RNAi的效应是长效的，甚至在受注射的秀丽新小杆线虫的子一代的整个生活周期里都能持续，但是由于它并不能产生DNA的修饰，随着细胞的不断分裂，dsRNA逐渐被稀释，最终不能持续地遗传下去。

通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。关键词：干扰分子机制RNAisiRNAsRISCRNA干扰分子机制起始阶段效应阶段RNA诱导沉默复合物通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3"端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3"端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.

1、病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。至于dsRNA的产生机制我也没搞懂。2、宿主细胞对这些异样的dsRNA产生反应，核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。3、siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。4、RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位的两端切割mRNA，使mRNA降解。5、siRNA还可作为引物与mRNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 6、达到基因沉默的目的。回答完毕。

RNAi的特异性：众多实验结果表明导入生物体的siRNA只能引起同源基因表达的抑制，而无关基因不受影响。而且，在siRNA序列中配对的1921nt中如果只改变一个核苷酸，就可以使该siRNA序列不对靶mRNA起作用，证明RNAi有明显的特异性。科学家可以通过制备外源性的siRNA并导入细胞内，特异性地抑制某些基因的过度表达和抑制突变基因的表达，研究基因的功能。

RNAi的可扩散性：Fire等观察到将dsRNA注射于线虫体内，这些dsRNA可以从注射处的细胞扩散到体内其他细胞，引起其他细胞的基因沉默。此外许多研究还显示RNAi信号可以越过胞间屏障向其他细胞和组织扩散，在植物中，RNAi信号可以通过两种途径在细胞间传递：①短距离的相邻细胞之间的传递，植物细胞之间有着非常丰富的连接，即胞间连丝，沉默信号（如siRNA分子）可以通过胞间连丝在细胞间传递；②沉默信号还可以通过植物里纵横交错的脉管系统进行长距离的传送。而在动物中，RNAi信号的扩散需要特殊的蛋白参与，最近Hunter等在线虫中鉴定出了一种与沉默信号传播相关的蛋白，它是由sid-1基因编码的一种跨膜蛋白，能在膜上形成跨膜通道供沉默信号通过，SID-1蛋白同源物在果蝇中不存在，但有研究表明在哺乳动物中存在SID21蛋白同源物。

生物合成蛋白质的过程是DNA经转录酶转录成RNA，核糖体根据RNA上的碱基排列来合成蛋白质。有些病毒没有DNA他们的DNA也是靠RNA来逆转录成的 干扰技术就是通过干扰素来阻止DNA和RNA之间的转录来阻止细胞合成蛋白质，从而达到杀灭病毒的目的。 这种方法治疗没有什么毒副作用，并且被认为可以治百病的技术，是根治艾滋病的有效途径，世界的科学家都在研究这技术。打了老半天的字，给点表示把，采纳了我就得分了

共抑制是指转基因在抑制内源同源基因的同时也抑制自身的表达。共抑制是指转基因方面的。真是由于共抑制现象的发现才引出了后面RNAi的发现。RNAi的机制：1：dsRNA（double　strands　RNA）剪切产生siRNA（short　interfering　RNA）2：RISC（RNA　incluced　silencing　complex）与siRNA识别结合，并介导靶基因的mRNA降解。sdRNA作为RNAi的起始物已经被证实。dsRNA主要是由邻近的启动子或转基因本身的反向重复拷贝导致了dsRNA的产生。

RNAi (RNA interference) 即RNA干涉,是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中.同时作为一项新兴生物技术,RNAi有着广泛的应用前景.本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景. 1.RNAi的定义 目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种,不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果将RNAi看作一种生物学现象,可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.② RNAi是有dsRNA参与指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象.具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后,细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象. 如果将其作为一门生物技术,则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的.② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段,使相应的基因沉默.③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence ,PTGS). 各种不同定义虽然说法不同,但所描述事实是大体相同的,简单地可以说,RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象.

rnai技术的基本原理如下：1、RNAi即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由双链RNA介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。2、RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中。3、同时作为一项新兴生物技术，RNAi有着广泛的应用前景。4、本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景。5、RNAi的定义目前对RNAi的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。6、RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。7、具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。

RNA干扰科技名词定义中文名称：RNA干扰英文名称：RNA interference;RNAi定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科）定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）直接度娘

rnai技术瞬时转染是临时性的干扰目的基因的表达，而稳转存在干扰序列随机整合到基因组，整合的位置对细胞的影响不确定，且对照较难控制。talen技术是靶向定位敲出，特异性高，可以针对某个基因进行敲出，不会对基因组的其他位置产生影响。

RNAi技术是指利用体外合成的短双链RNA（21-23个核苷酸）抑制细胞内特定基因表达的技术，是转录后基因沉默的一种研究基因功能的有力工具。

http://www.biooo.cn/bbs/dispbbs.asp?BoardID=56&id=611

RNAi (RNA interference) 即RNA干涉,是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中.同时作为一项新兴生物技术,RNAi有着广泛的应用前景.本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景.1.RNAi的定义目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种,不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果将RNAi看作一种生物学现象,可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.② RNAi是有dsRNA参与指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象.具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后,细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象.如果将其作为一门生物技术,则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的.② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段,使相应的基因沉默.③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence ,PTGS).各种不同定义虽然说法不同,但所描述事实是大体相同的,简单地可以说,RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象.

RNAi (RNA interference) 即RNA干涉,是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中.同时作为一项新兴生物技术,RNAi有着广泛的应用前景.本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景. 1.RNAi的定义目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种,不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同,如果将RNAi看作一种生物学现象,可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达.② RNAi是有dsRNA参与指导的,以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象.具有核苷酸序列特异性的自我防御机制,是一种当外源基因导入或病毒入侵后,细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象. 如果将其作为一门生物技术,则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的.② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段,使相应的基因沉默.③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence ,PTGS). 各种不同定义虽然说法不同,但所描述事实是大体相同的,简单地可以说,RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象.

就是所谓的小RNA了，它与mRNA形成双链造成mRNA无法翻译出蛋白。目前是研究的热点，主要使用它来大量或抑制某个基因的表达。

反义RNA是指与靶RNA(多为mRNA)具有互补序列的RNA分子,通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式.参与基因的表达调控. RNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中。同时作为一项新兴生物技术，RNAi有着广泛的应用前景。本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景。 1.RNAi的定义 目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。 如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。 各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。

1 RNAi的机制 RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成-22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponent nuclease，RISC)并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达. RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员. Dicer酶广泛存在于蠕虫、真菌、物及哺乳动物体内. 他的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点. 在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21-23个核苷酸的siRNA，他启动了细胞内的RNAi反应. 因少量双链RNA即能阻断基因表达，且此效应可传至子代细胞，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统. 研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP). 在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增. 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成小片段siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA. 小片段siRNA生成后与核酸酶形成复合物，随后mRNA与小片段的正义链置换，被mRNA替代. mRNA的位置与最初正义链的位置相同，从而被核酸酶在相同的位点降解. 更有意义的是mRNA的降解使核酸酶得以再生，这样周而复始，mRNA得以降解，因此RNAi呈酶解动态. 由于mRNA也以21-23 nt的特定间隔降解，因此认为降解dsRNA与mRNA的核酸酶相同. 另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链. 结果mRNA也变成了双链RNA，他在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA. 这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制. RNAi不同于其他基因阻断技术，他是转录后水平的基因静默机制，因此注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应. RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果. dsRNA小片段如小于21-23 nt (如10-15 nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21-23 nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围. RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代2 双链RNA的构建 双链RNA可先在体外构建好，用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差，转化到细胞内的双链RNA半衰期短. 而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用. 构建双链RNA表达载体，使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成. 因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，他指导的转录就会终止，且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，因此合成的RNA无polyA尾. U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别，合成出RNA. Sui et al 用Bluescript作为载体，RNA多聚酶Ⅲ可识别的U6作为启动子，从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1)，将其插入到Bluescript载体中. 然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2. 他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA. 片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止. 而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3"端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而有利于双链RNA诱发RNAi. RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA. T7也可作为启动子合成dsRNA. 将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体. 用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA. 在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶. 腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al 用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA，并成功的阻断了基因的表达.RNA interference (RNAi) is a mechanism in molecular biology where the presence of certain fragments of double-stranded RNA (dsRNA) interferes with the expression of a particular gene which shares a homologous sequence with the dsRNA. RNAi is distinct from other gene silencing phenomena in that silencing can spread from cell to cell and generate heritable phenotypes in first generation progeny when used in Caenorhabditis elegans.Before RNAi was well characterized, it was called by other names, including post transcriptional gene silencing and transgene silencing. Only after these phenomena were characterized at the molecular level was it obvious that they were the same phenomenon.The use of RNA to reduce expression in plants has been a common procedure for many years. Single-stranded antisense RNA was introduced into plant cells that hybridized to the cognate, single-stranded, sense messenger RNA. While scientists first believed that the resulting dsRNA helix could not be translated into a protein, it is now clear that the dsRNA triggered the RNAi response. The use of dsRNA became more widespread after the discovery of the RNAi machinery, first in petunias and later in roundworms (C. elegans).RNAi原理图解http://lddljf.stedu.net/Article_Show.asp?ArticleID=1974RNAi知识介绍powerpoint1 http://www.biox.cn/content/20050519/13420.htm2 http://www.biox.cn/content/20050519/13422.htm3 http://www.biox.cn/content/20050519/13423.htm4 http://www.biox.cn/content/20050519/13425.htm5 http://www.biox.cn/content/20050519/13426.htm6 http://www.biox.cn/content/20050519/13429.htm7 http://www.biox.cn/content/20050519/13431.htm8 http://www.biox.cn/content/20050519/13433.htm9 http://www.biox.cn/content/20050519/13434.htm

rna干扰的名词解释是：RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默两类。TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录，PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。RNA干扰的特点：在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg 和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1，它可以将双链RNA转运出细胞。因此系统性的RNAi包括了SID1介导的双链 RNA在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi不能扩散。