如下图流式细胞仪的横坐标是什么意思

流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。光源、液流通路、信号检测传输和数据的分析系统是流式细胞仪的主要组成。临床中运用流式细胞仪进行外周血白细胞、骨髓细胞以及肿瘤细胞等的检测是临床检测的重要组成部分。流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。基本结构：流式细胞仪由三部分构成：液流系统，包括流动室和液流驱动系统；光学系统，包括激发光源和光束收集系统；电子系统，包括光电转换器和数据处理系统。流式细胞仪的工作原理是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图，直方图和加三维结构图像进行分析。用于FCM的样本是单细胞悬液，可以是血液、悬浮细胞培养液、各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液以及石蜡包埋组织的单细胞悬液等。

流式细胞仪有以下功能：1.临床诊断：比如白血病、淋巴瘤的分型；造血干细胞的检测；TBNK和细胞因子的检测等。2. 实验研究：只要细胞或者微球的大小在流式检测范围内，都可以用流式来分析各种抗原的含量或代谢状态等。3. 细胞分选：有分选功能的流式可以把不同的细胞筛选出来，以便进行下一步的研究。

【答案】：流式细胞仪由三部分构成：1.传感系统，包括样本递送系统、样品池、检测系统、电子传感器和激光源等。2.计算机系统。3.电路、光路和水路系统，有电源、光学传导和滤片、鞘液循环和回收部分等。

原理：根据激发光的强弱，来判断细胞和染色物质的结合情况，从而得到要检测的结果。 1、将待测细胞染色后，制成单细胞悬液。 2、用一定压力将待测样品压人流动室，同时不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管人口方向与待测样品流成一定角度，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 3、流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光信号和荧光信号。

流式细胞仪技术 流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。其优点如下： 1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。 2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。 3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。 一、样品的制备 流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号，因此，细胞必须做成单个细胞悬浮状态，不能聚集，也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异（如特异单抗），而且不允许渗透至载液中。 标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系，要经Ficoll分离，作单细胞分离处理，但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等)，化学法（EDTA、EGTA和柠檬酸盐）消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS，柠檬酸盐的浓度为40μmol/L，并同时采用机械分散法，将经消化处理的膨松组织，用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重悬，最好过一下尼龙或不锈钢网筛100μm和20μm。细胞浓度要保证在1-2×106/mL 若标本用于测定单个细胞，需加入1～5 mg/L的DNAase，将有助于阻止破碎细胞释放的DNA造成细胞再聚集，但是若分离的细胞要作DNA含量测定之用时，则切勿加DNAase。 二、悬浮细胞的固定 上述制备的活细胞即可用于流式细胞仪分析，如果染色和流式分析要拖后进行，或为了提高染色效果，则要将细胞预固定。乙醇固定是常用的方法。 1、固定方法： (1)甲醛法：在细胞悬液中加入等量的8%甲醛(用Hank"S液配)4℃下固定12-18小时。 (2)乙醇法：细胞悬于PBS中，缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇，使终浓度为70%，冰浴30分钟。 (3)丙酮法：于细胞悬液中，缓慢加入冷丙酮，使终浓度为85%。 2、实例： (1)用预冷的无钙、镁含0.5mmol/L EDTA的磷酸盐缓冲液，将细胞制成1×106细胞的悬液。 (2)在4℃下逐滴加入3倍体积的95% 乙醇，连续搅拌使乙醇终浓度达70%。 126 (3)该细胞可在4℃下保存数日。 (4)分析前先用1000r/min离心10分钟，弃去乙醇，再将细胞悬于PBS中或要求的试剂中。 三、流式细胞仪分析的应用 (一)非染色细胞的光散射 一个粒子(如细胞)出现在一束光线中，立即会干扰该光束，造成该光束入射光的重分布，该细胞所获能量则以衍散、折射、反射等复杂的参数形式重新发射出来，这些参数与细胞体积、表面构象、内部结构形成函数关系，可测低角前面约10°的光散射及90°的光散射。 一般认为，90°位置的光散射值主要受细胞内部结构所致的光反射和折射影响，而低角前面10°位置的光散射则主要代表细胞大小。光散射测量方法如下： (1)将细胞悬浮于HBSS中，浓度介于1×106～2×106/mL浓度之间。 (2)以悬浮细胞平衡盐溶液(HBSS)充满含鞘液的细胞贮藏池。 (3)设定细胞流量为500个/S(秒)，以获得最佳测定结果。 (二)染色法 1 细胞的碘化丙锭(propiolium iodide PI)染色 PI和EB(溴化乙锭)为同类物质，与EB一样，PI嵌入DNA双螺旋中，可使荧光强度增加约20倍，PI的荧光强度约为EB染色的1.8倍，以488nm波长激发，DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。 1.1 小鼠Lewis肺癌细胞(3LL)DNA含量测定方法 (1)从C57BL/6小鼠上切除肿块，在培养皿内用PBS冲洗； (2)去除结缔组织及脂肪，剪碎肿块； (3)小碎片移入1.20×38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。 (4)将200～300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL)，染色3LL细胞，于4℃存放20～30分钟。 (5)测定580～750nm之间的发射荧光，以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。 注：PI染色液：0.1%柠檬酸钠1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。 1.2 培养细胞DNA的流式细胞仪分析 (1)从培养皿中吸去培养基，以HBSS冲洗二次； (2)加入PI5mL于培养皿中，在4℃放10分钟； (3)用吸管反复次打细胞，使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。 1.3 完整细胞DNA的PI染色 (1)70%乙醇固定的细胞悬液，离心，去固定液； (2)室温条件下加入PI染色一批细胞（10～10细胞/mL），时间为30分钟，然后行流式细胞仪分析。 1.4 光辉霉素和PI的DNA染色 在荧光抗生素光辉霉素和PI联合染色过程中，光辉霉素的供体分子被PI的受体分子接受产生能量转移，该染色技术主要用于实体肿瘤组织，精子细胞及妇科标本，同时 127 56 也适用于体外培养的细胞。 (1)分离制备的细胞悬液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。 (2)以PI/光辉霉素染色，4℃1小时（PI为10 mg/L、光辉霉素为10 mg/L）。 (3)染色后进样，以100W汞灯作为激光光源，使用BG123nm阻断滤片，叠加K590型高通滤法(one seep filter)。 2、DNA和RNA的鉴别染色 利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下： (1)试剂： 溶液A：低温保存，稳定期约2周。 Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL 1mol/L NacL 15ml蒸馏水76mL，PH1.5（100mL） 溶液B：稳定期数月，最好除菌以后(高压或过滤)贮存。 0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL 0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL 蒸馏水24mL，总体积为99mL pH6.0 吖啶橙母液： 用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物，应小心)，吖啶橙应用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀释。 注意：仪器鞘流系统应保持4℃。 氩激光激发波488nm，红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA或单链DNA(F>530nm) (2)方法 ①用含15%血清的PBS配制细胞悬液，取0.2mL(8×106细胞/mL)，加入0.4mL溶液A，4℃放置45～60秒。 ②加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室温2分钟。 ③应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。 注意：①细胞数保持恒定；②核酸与吖啶橙的比例；③染色时间及温度。 (三)染色法的应用 1、变性及双链DNA的鉴别染色 (1)试剂： HBSS内含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl pH1.35 吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4缓冲液，pH2.6。 ①2×10细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。 ②37℃温育1小时。 ③将0.2mL细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混匀，20℃ 30分钟。 128 6 ④加2mL吖啶橙染色2分钟。 ⑤绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。 2、DNA与癌基因探针双标记测定 这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物，然后用PI标记DNA，现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤： (1)制备白血病细胞悬液，用100%甲醇在-20℃固定10分钟。 (2)取50μl50 mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体，可特异性地直接与N-ras，Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编码的21Kd蛋白相结合)，4℃作用30～45分钟。 (3)用PB离心洗涤2次，重悬浮于50μL HBSS中(含0.1%叠氮钠和2%小牛血清)。 (4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分钟。 (5)同(3)洗涤后加入50μL 1:40的FITC标记的羊抗兔IgG，4℃反应30～45分钟。 (6)同(3)洗涤后，细胞用RNA酶消化，室温20～30分钟。 (7)同(3)洗涤后，用PI染液染20分钟。 (8)同(3)洗涤后，用488nm激发波长测定。FITC染色显示ras癌基因表达产物，PI染色显示DNA含量。 注意事项： ①制备样品时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失和凝集； ②细胞固定时间不宜过长，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂； ③为了降低本底，应将细胞表面未结合的荧光染料洗净； ④进行双标记沉淀时，应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。 3、以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。 (1)试剂： 用培养基配制33 mg/L Brdu及脱氧细胞苷26.4g/mL。 染色液：Hoechst33258溶于PBS，细胞染色24小时后进行分析，据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。 (2)方法： ①将Brdu溶液按1:10加入细胞培养液中。 ②根据细胞周期时间不同，选择不同时间培养的细胞。 ③孵育后，摇散细胞以传代培养。 ④直接用染液重悬细胞，进入流式细胞仪分析。 Hoechst33258荧光值在410～580nm之间，需用330～360nm紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此，不仅特异性标记DNA，亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时，在与细胞孵育过程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态，并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰，此项 技术可用于直接测定细胞G2期及分裂时间。 4、Hoechst33342染色活细胞DNA (1)试剂：Hoechst 33342,用蒸馏水配成0.25mol/L。 (2)方法： 129 ①制备106/m细胞悬液，以Hoechst33342染色，浓度为5～10 mg/L ，室温下20分钟。 ②分析前切勿洗涤细胞。 Hoechst33342可用作细胞DNA的活体染料，据信可在保持细胞活性的同时，呈现出相当好的DNA化学计量关系，激发波在紫外范围350～363nm之间，发射波则在450nm处。 5、以异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyante FIFC）染色蛋白质。 (1)试剂：异硫氰酸荧光素(FIFC)用含40 mg/L RNase的PBS配成0.1～1.0 mg/L浓度。 (2)方法： ①染色前用终浓度70%乙醇固定细胞，至少18小时。 ②离心固定细胞，弃去固定液。 ③室温下用FIFC染色细胞蛋白，30分钟。 ④流式细胞仪分析，使用氩激光，激发波长488nm，荧光发射波长515～535nm。 也可于固定细胞中，以18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分钟以上可对DNA和蛋白质双重染色，分别呈现红色荧光（DNA）和绿色荧光（蛋白质）。 6、荧光素抗体的应用 该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞，可用荧光素或若丹明标记单克隆抗体处理上述细胞；也可用于测定胞浆中的蛋白质(如凋亡BCL-2蛋白，抗病毒蛋白MXA等)，后者在细胞凋亡章节中已介绍从略。 用磷酸盐缓冲液Eagle"s MEM稀释FIFC连接的抗体内含0.1%叠氮钠、2%牛血清。为判定FIFC抗体的最适度的稀释浓度，向微量滴定板的细胞中加入50μL不同浓度的稀释液，再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人LEU-I抗体分析时，应稀释成5 mg/L或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在2×10浓度时其存活率应在90%以上。 方法： (1)于微量滴定板加入50μL抗体稀释度，再加入50μL细胞悬液，混匀。 (2)冰浴45分钟，离心滴定板（1500r/min 10分钟）。 (3)弃上清，以培养基100μL洗涤细胞沉淀2次，每次洗涤后用1500r/min 10分钟，弃上清。 (4)以1ml预冷的培养基配成1×106细胞/mL的已染色细胞悬液，进样前持续保持冷环境(4℃)。 目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应用。 ①细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体。 ②肿瘤学：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。 130 7 ③免疫学：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。 ④血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。 ⑤药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。 2. 匀浆的制备 剪碎法：取心肌组织0.5g放人平皿，用含EDTA的冷PBS缓冲液洗涤。加入少量PBS,用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10 ml PBS；用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；离心沉淀1500 prm×3 min，弃上层。再用PBS洗3次，每次以500 prm短时低速离心除去细胞碎片，以300目尼龙网过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为(2～5)×10/ml。 研磨法：先将组织在200目滤网上研磨，并加入PBS过滤；所得的细胞悬液，2000 prm×5 min，吸去上清，加PBS 1 ml，轻轻吹打成细胞悬液，调整细胞浓度为5×10～10个。再2O00prm×5 min，吸去上清，加PBS 1 ml，轻轻吹打成细胞悬液，经300目滤网过滤，再离心、加PBS吹打，重复2～3次后，调整细胞浓度为 106/ml。 3 流式细胞仪检测细胞凋亡—Annexin V/PI双染色法 Annexin V/PI标记染色：取500u1心肌缓冲液，轻轻混匀细胞后加5ul FITC一Amexin V和5ul PI试剂，置冰浴10min后，流式细胞仪(光源为488nm氨离子激光，预先用Flow-Check调整光路)计数10以上的细胞，用FITC/PI双色分析程序测得心肌凋亡细胞(Annexin V＋/PI—)的百分率。 4 566 131

维护方面：流式细胞仪最怕什么？最容易出现什么故障，？最难的故障又是什么？

几个基本原则：1.必须是现有机器配置可以检测到的。2.对于多色实验，荧光素本身的荧光强度和抗原表达的水平应该是反比。简单的说表达多的抗原所使用的荧光素要选相对较暗的，而表达低的就选较亮的。3.多色实验最好选不同激光激发，释放光谱重叠小的荧光素。

侧向角散射(side scatter,SSC)，流式细胞仪依靠激光器照射细胞所携带的不同荧光物质所产生的不同的荧光进行检测。由于散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。侧向角散射是指与激光束正交90°方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 另外还有前向角散射(forward scatter，FSC)，前向角散射与被测细胞的大小有关，确切地说，它与细胞直径的平方值密切相关。通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。利用这两个参数可以对细胞进行分群，通过设门就可以将具有一定ssc和fsc的细胞群从大量细胞中区分出来。所说的设门，是指在进行检测时，所设的选择区域，可以用“门”选择感兴趣的细胞群。具体说，是指在某一张选定参数的直方图上,根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群,并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门,矩形门,圆形门,多边形门,任意形状门和十字门。流式细胞这门技术比较复杂，染色和上机都需要操作人员有一定的经验这里说到的根据CD61 vs SSC设门，应该就是说通过对CD61分子的染色和ssc参数设门，从而得到CD61分子阳性，并具有一定ssc值即有一定物理参数的细胞的数据。由于CD61是血小板的表面分子，因此可以得到血小板的相关数据。

检测cd4和cd8，应该还要同时染色cd3.先选中cd3阳性的细胞（t细胞），然后把t细胞在cd4/cd8的散点图上再显示，可以分为四个象限。分别代表cd4阳性，cd8阳性，双阳性，和无染色的。正常情况下，是不应该有双阳性和未染色的，也就是说你的细胞应该只显示在4个象限的其中的两个。其他的两个最多只是一些背景的杂信号。代表t细胞的两个亚群。

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耗材：流式的试管细胞滤网加样的吸管枪头试剂：染色的各种染料，标记好的荧光抗体染色所需要的缓冲液，封闭液，PBS最终由于上样的缓冲液

流式细胞仪的图分为两种，一种是散点图，一种是柱状图。在散点图上，横，纵坐标代表的是这两个检测指标的相对荧光强度，至于是哪两种，取决于你检测是机器的设置和你实验的需求。在柱状图上，横坐标代表的是相对荧光强度，而纵坐标是计数。还有一种横坐标是时间轴，而纵坐标是相对荧光强度，这个可以检测检测过程中的信号变化。

问题一：流式细胞仪结果图如何看 流式细胞仪检测的都是相对荧光强度，因此一般都是用来比较两个或以上样本的荧光强度的差异。而荧光强度则是由荧光标记抗体或者其他荧光染料根据不同目的来选用的。 你可以贴一组具体的图来，我可以给你一些指导。 问题二：怎样看流式细胞仪淋巴细胞分析结果 最常见的是分析CD4， CD8亚群。 先在FSC， SSC散点图上划出淋巴细胞gate。然后在此gate基础上选取T细胞标志染色阳性的细胞群（一般是CD3）。在把CD34阳性的细胞根据CD4 和CD8染色情况形式为散点图，得到CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, 以及双阳性的比率。如果还有其他细胞标志的染色，再进一步分析。 问题三：如何分析流式细胞仪显示的数据 （一）单参数直方图　　单参数直方图是一维数据用得最多的图形显示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X-Y平面描图仪给出的曲线。根据选择放大器类型不同，横坐标可以是线性标度或对数标度。用信道来表示，实质上是所测的荧光或散射光的强度。纵坐标一般表示的是细胞的相对数。只能显示一个参数与细胞之间的关系是它的局限性。　（二）双参数直方图　　双参数直方图是一种细胞数与双测量参数的图形。常见有以下三种：　　1.二维点图：能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系。横坐标和纵坐标分别为与细胞有关的两个独立参数，平面上每一个点表示同时具有相应坐标值的细胞存在。可以由二维点图得到两个一维直方图，但是由于兼并现象存在，二维点图的信息量要大于两个一维直方图的信息量。所谓兼并就是说多个细胞具有相同的二维坐标在图上只表现为一个点，这样对细胞点密集的地方就难于显示它的精细结构。　　2.二维等高图：类似于地图上的等高线表示法。它是为了克服二维点图的不足而设置的显示方法。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高所代表的细胞数越多。一般层次所表示的细胞数间隔是相等的，因此等高线越密集则表示变化率越大，等高线越疏则表示变化平衡。　　3.假三维图：是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方法。它把原二维图中的隐坐标-细胞数同时显现，但参数维图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰”和“谷地”的结构和细节，这无疑是有助于对数据进行分析的。假三维图列表模式其实只是多参数数据文件的一种计算机存储方式，三个以上的参数数据显示是用多个直方图、二维图和假三维图来完成的。（三）三参数直方图　　目前，由于计算机软件的发展，很多商品化的软件均提供三参数直方图功能，意指这一类直方图的三维坐标均为参数而非细胞数。这种立体图以点图为显示方式，同样可以作全方位旋转以便仔细观察。（四）流式细胞仪的多参数分析　　当细胞标记了多色荧光在流式细胞仪上被激光激发后，所得到的荧光信号和散射信号可以根据需要组合分析以获得所需的信息，这就是流式细胞仪的多参数分析。 问题四：流式细胞术图像如何分析 那些方框叫做圈门，旁边的数字说的是门里面所占的百分比，后面那2张图是计数，右上计数的是48%那群的，下图是计数45%那个门里面的， 整张图的横坐标左边是阴性，右边是阳性 问题五：流式细胞仪检测细胞分型结果分析 你要问什么问题呢？可以具体些吗？ 问题六：流式细胞仪检测图怎么看flowjo Flowjo可以读取FCS格式的文件，一般的流式细胞仪都产生这个格式的文件。把FCS文件导入Flowjo后，双击导入的文件，默认打开的是FSC，SSC 点状图，你可以根据具体的使用更换坐标，或者设定gate 问题七：根据流式细胞仪的数据，如何分析？ 假设你在这个图前面的步骤都是对的，包括设置gate，单细胞的gate等等。 这两个图不具备可比性，第一个的图记录了超过1万个数据，而第二个只有2千多个。相差的很远。这是最大的错误。从现有的百分率来看，G1, G2的百分率也很接近。所以是看不出差别来的。你如果要做的是看你的实验手段是否一直细胞周期。做这个实验是不行的。必须做BrdU或者EdU加PI的双染实验。在不同时间点取对照组和实验组做，才能得出结论细胞周期是否有抑制。 这样的PI单染实验，只能得出各个周期的百分率有没有改变，就算有改变，也不能说是有抑制。至于凋亡，就更加不可靠了。这个实验的特异性非常差。 问题八：流式细胞仪结果分析,急求 你必须把你具体怎么做的都详细的写一下，光凭这个图很混乱。 你CD45和CD105都是FITC染色的，是在同一个样本吗，如果不是，为啥只有一个散点图。如果是的，那就重新做实验吧

贝克曼库尔特安装要求一、 实验室空间要求1.实验室主入口门宽不小于80cm，门高不小于198cm。2.机房占地面积至少需要达到3×3=9平方米。主机周边至少留有0.5米的空间，方便日后维护。Gallios/Navios主机（宽X 深X高=102cm x 70cm x 61cm，重量=109公斤）Gallios/Navios气泵箱（宽X 深X高=71cm x 58cm x 46cm，重量=59公斤）二、 实验室电源要求1.实验室需购置3KVA在线式不间断电源，推荐山特牌UPS。2.仪器安装至少需要使用220V、16A插座1个、10A插座2个，分别安装在仪器后面墙面上。3.仪器必须确保良好接地，零地线电压低于1VAC，地线对地阻抗小于4欧姆。4.配备二个高质量市售多功能接线板，供配套设备使用。三、 实验室温度要求15.5 ~ 32°C，温度变化不得超过±2°C，空调不得与仪器共用同一电源线路。四、 实验室湿度要求20%至80%，无冷凝。五、 实验室配套设施1. 需要二张稳固的台面，一张放置仪器主机，另一张放置电脑，显示器和打印机。台面尺寸：1.5米(宽度)×0.8米（深度）×0.8米（高度）2. 准备至少1L蒸馏水或“Milli Q”级的净化水。

T细胞，可以用CD3单核细胞(血液），巨噬细胞（组织），可以用CD14+ CD33树突细胞，CD11c+CD123

稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约数百μm。实验经验公式f=v/4.5d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度，d为喷孔直径。由此可知使用不同孔径的喷孔及改变液流速度，可能会改变分选效果。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选+150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，因此从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间，一般为数十ms。精确测定延迟时间是决定分选质量的关键，仪器多采用移位寄存器数字电路来产生延迟。可根据具体要求予以适当调整。

流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。

1、通道是：利用Miltenyi或其他公司的磁珠对目的细胞做预纯化或清洗可提高分拣效率。当然，仅仅利用一轮或多轮磁珠筛选而不用流式细胞仪，许多研究也能开展起来，但这不是本文讨论的重点。Amnis 公司已将流式细胞仪射流与荧光显微镜和数字成像整合在一起。其结果是一系列单个细胞的图像能够显示荧光团的分布，而非简单的平均荧光指数（MFI）。2、目前有33种不同的金属可被同时检测。该仪器被Time of Flight 称为"Cytof" [1] 。考虑购买该仪器的研究人员应该确保他们有这一深度的细胞分析需要。此外，细胞在等离子体中会被汽化，所以用于研究的细胞不能恢复。蒸汽分拣仪硬件设备简单，检测点与收集装置间距离较短，检测样品的激光数多。而流动细胞分拣系统通过比色皿提供层流和增强的样品聚焦。3、然而，流动细胞长度有限，而且激光光学装置需要足够空间避免不同通道间的串扰。对于敏感性来说，流动细胞系统明显占优，但蒸汽系统没有保持细胞清洁的问题，并且能提供额外的激光束。需要指出的是，有些激光束本身对细胞有毒害作用。

流式细胞仪（Flow cytometry ）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。

流式细胞检测原理如下：流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标。经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300~400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。样品分选原理。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是:由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中;其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。

细菌计数与投国外期刊跟用不用NB仪器无关。流式细胞仪好像不能分别技术，除非你的菌大小差异很大，估计你的菌大小差异不大，所以不行。流式细胞仪理论上可以计数细菌数。计数细菌，我不建议用流式细胞仪，他有很多情况要考虑。比如说，你用什么染色？染色机理是什么？很多染色剂其实不能很好说明活菌和死菌的区别。我认为菌有4种状态，不能简单分死活两种。普通的倒平板其实很好！！！

CD11B: 单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，NK细胞等CD11C：树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞

可以.这个是流式细胞仪一个常见的应用.上流式细胞仪以前,需注意的是1.细胞打散到单细胞的悬液,没有聚团成块.如果有顾虑的话用纱网过滤一次才用.2.细胞悬液的浓度不能过高和过低.详请参考你的仪器说明建议值.我的经验每毫升一百万足足够了.少些读取慢些也没有大问题,一支样品少过十万的话,就很容易得不到足够的数据.太多则读取过快,准确性可能降低,更多更危险,可能造成仪器管道堵塞.3.如果上机时间能保证,细胞直接打散均匀在PBS里面就可以上机了,除了贴壁细胞需要的胰酶处理按照普通传代步骤来做,之后洗一次,没有什么其他处理.如果细胞悬液制好后可能需要等待（超过半小时）,则用1-2%多聚甲醛或福尔马林溶液保存细胞.注意避光避免丢失荧光信号.这样保存放4度冰箱一两个礼拜之后也还是可以上机,误差不大.

可以，方法如下：（仅供参考）一般来说都是将细胞悬液离心并弃上清后加入固定液,我们加的是70％的冰乙醇,加的量根据你细胞的多少.你这个涉及的测蛋白,那么加多聚甲醛的量和时间可能要控制得严一些才能保证最低限度不破坏a－sma的结构.如果单测细胞凋亡和周期的话固定液多一点和固定时间长一点都影响不是太大.x0d其实无论是做细胞周期的乙醇固定,还是做蛋白染色的多聚甲醛固定,固定液加1ml就可以了,一般每个样品的细胞数都在106左右.固定液太少了不好,因为固定液的实际作用浓度一定程度上受弃上清后管内残留液体量的影响,但太多了也没有意义.也正是这个原因,实际上多聚甲醛的浓度用4%的多一些,而且因其有挥发性,时间长浓度会有所降低.至于固定时间,一般4度30min固定作用就已经比较完全了,但是也可以放置过夜,这样有时有利于时间安排.

一 、细胞表面标记的检测1.试剂平衡至室温。准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）。2.写编号纸并编号。1----IgG1/ IgG1/ IgG12----CD4/CD8/CD33----CD14/CD454----3.每管加相应的抗体10l/每种和50l全血，震荡，室温避光20分钟。加血前摇匀血样。4.加入溶血素1ml，震荡后室温避光10分钟。5.离心，1200转， 5分钟。弃上清，震荡。6.加入PBS洗液2ml，震荡，离心，1200转， 5分钟。弃上清，震荡。7.加入PBS 900l。上机前4度保存。8.上机。二 、细胞内细胞因子的检测1.准备：消毒台面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉签，草纸和有盖垃圾桶（内装有消毒剂）。2.写编号纸并编号。IgG1/ CD8/CD3IFN-gamma; /CD8/CD33.（3－5在超净台操作）取出PMA（1∶100），BFA（1∶10）和离子霉素（1∶10），使用无菌无叠氮钠PBS稀释储存液。4.刺激：取全血或PBMCs（细胞数在0.5-1 106 ）50l/管，再加入50l RPMI1640进行稀释一倍，加入刺激剂PMA，离子霉素和BFA，混匀。最后在全血中的终浓度：PMA:50ng/ml离子霉素：1g/mlBFA：10g/ml。5.37℃，5% CO2 ，4小时孵育(最好用培养箱，松盖) 。6.胞外染色：各管中加入相应的表面抗体20l和激活的全血100l混匀，室温避光20分钟。7.溶血：每管加入溶血素2ml，室温避光10分钟。离心，1200转， 5分钟。弃上清。8.破膜通透：每管加入0.5ml通透剂，室温避光10分钟。加入2mlPBS，1000转，离心5分钟。弃上清。9.胞内染色：加入IFN-gamma;或IgG1的抗体20l，混匀，室温避光30分钟。加入2ml PBS，1000转，离心5分钟，弃上清。10.加入PBS 500l。上机前4度保存。11.上机检测。注意：本实验室可提供流式细胞检测服务或流式细胞仪,不会的新手可以自行上门观察.本实验室为正规三甲医院科研共享平台,所有开放的实验均为本实验最常规的技术服务,暂时开放的除了流式细胞术外还有荧光定量pcr,ChIP免疫沉淀,wester blot,细胞培养,细胞株.

用流式细胞仪检测巨噬细胞可以使用以下的表面标记：cd14,cd11b,f4/80(鼠)/emr1(人),cd68和mac-1/mac-3

流式细胞仪是一种广泛用于细胞生物学和免疫学研究的仪器，能够对细胞进行快速高效的分析。在进口品牌厂家方面，国际市场上存在许多知名品牌，如BDBiosciences、BeckmanCoulter、ThermoFisherScientific等。这些品牌厂家在流式细胞仪领域拥有丰富的经验和先进的技术，其产品涵盖了不同应用领域和研究需求。选择合适的进口品牌厂家需要考虑诸多因素，包括仪器性能、功能模块、售后服务、价格等。

所谓的门，在流式细胞仪检测的时候术语叫做gate。流式细胞仪是针对细胞（后者颗粒）的群来做研究的。往往是先选中感兴趣的一个细胞群，再分析下一步的染色，可以进行很多分级。比如先从所有细胞中画出淋巴细胞，可以在FSC-SSC散点图上画出淋巴细胞的群，比如一个方框，或者任意曲线的gate，也就是所谓的门。把淋巴细胞括在内。然后在另外一个散点图上只显示这个gate里的细胞，但是把横坐标和纵坐标改为其他荧光标记。总之，门就是一个选择细胞群的手段。

流式细胞仪都是检测相对荧光强度的。所以第一，一定要有对照。有几个常用的方法来分析：先用对照设置好阈值，然后分析各个组超过荧光强度阈值的百分数的变化如果没有明显的阳性，阴性阈值，可以比较整体的荧光强度的均值，中位数等等，具体采用哪个指标，要看实验目的。

405 nm/491 nm （激发/释放）。要紫色激光来激发。

CD11B:单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，NK细胞等；CD11C：树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞。流式细胞术是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术。其测量速度快，最快可在1秒钟内检测上万个细胞。可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量。具有明显的统计学意义，提供细胞群体的均值和分布情况。扩展资料：流式细胞技术的应用：1、其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；2、能准确地进行DNA倍体分析；3、借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；4、快速进行细胞分选和细胞收集；5、医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析（心血管疾病），流式细胞术与分子生物学研究；6、应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。参考资料：百度百科-流式细胞技术

市面上绝大多数的流式细胞仪都是以FCS文件格式保存数据的。以BD的机器为例，所使用的 DIVA软件，可以在右侧的列表中的每个实验，或者每个样本的上点右键，然后选中export，再选中export data，然后制定路径就可以导出了。导出的数据可以使用任何可读取FCS文件的软件来读取分析。

纳米流式检测仪，一般用于检测病毒、细菌、癌细胞等特殊的微小生物体。在医院一般用在检验科比较多。

MFI 可以有几个意思，比如Mean Fluorescence Intensity或者Median Fluorescence Intensity。根据你样本的分布，如果样本是正态分布，平均荧光强度和中位荧光强度应该是一致的。但是在非正态分布的样本，这两个值是不一样的。具体用哪一个，要看具体样本的分布。

流式细胞仪在使用前，甚至在使用过程中都要精心进行调试，以保证工作的可靠性和最佳性。调试的项目主要是激光强度、液流速度和测量区的光路等。激光强度：除调整反射镜的角度以调整到所需波长的激光出光外，还要结合显示屏上的光谱曲线使激光的强度输出为最大。液流速度：可通过操作台数字显示监督，调节　气体压力大小以获得稳定的液流速度。测量区光路调节　：这是调试工作的关键。需要保证在测量区的液流、激光束、90散射测量光电系统垂直正交，而且交点较小。一般可在用标准荧光微球等校准中完成。流式细胞术中所测得的量是相对值，因此需要在使用前或使用中对系统进行校准或标定，这样才能通过相对测量获得绝对的意义。因而FCM中的校准具有双重功能：仪器的准直调整和定量标度。标准样品应该稳定，有形成份形状应是大小比较一致球形，样品分散性能良好，且经济、容易获得。常用标准荧光微球作为非生物学标准样品，鸡血红细胞做为生物学标准样品。微球用树脂材料制作，或标有荧光素，或不标记荧光素。所用的鸡血红细胞标准样品制作过程昭下：取3.8%枸橼酸或肝素抗凝的鸡血（抗凝剂：鸡血=1：4），经PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛与清洗后的鸡红细胞混合，室温下振荡醛化24h，最后经PBS再清洗，贮4℃冰箱中备用。需要指出的是因为未经荧光染色，所测光信号为鸡血红蛋白的自发荧光。 ①打开电源，对系统进行预热；②打开气体阈，调节　压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；⑧将所需结果打印出来。 1）光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽；2）光源不得在短时间内（一般要1h左右）关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常；3）液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒；4）注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等；5）特别强度每次测量都需要对照组。

流式细胞仪都是检测相对荧光强度的。所以第一，一定要有对照。有几个常用的方法来分析：先用对照设置好阈值，然后分析各个组超过荧光强度阈值的百分数的变化如果没有明显的阳性，阴性阈值，可以比较整体的荧光强度的均值，中位数等等，具体采用哪个指标，要看实验目的。

你把图发一下

你说的是机器的PMT吧，每款机器的参数是不一样的，具体的要看你用的那台机器的设置。

不一样的，是两个分开的通道。FSC的检测器位于激发激光的轴向位置，而SSC则位于90度角

你的阴性对照就是无任何染色的细胞。PI阳性对照，可以固定过的死细胞，可以保证都是PI阳性Annexin阳性的细胞，用trypsin消化时间长一点（比如消化10分钟），大部分也是阳性的。这个也从一个侧面反映出该方法（Annexin V+PI）的非特异性很高。上机先用阴性对照设置PMT的电压和gate。再用PI和Annexin单染的阳性细胞调节compensation。然后就可以检测双染的样本了。

流式细胞仪的图分为两种，一种是散点图，一种是柱状图。在散点图上，横，纵坐标代表的是这两个检测指标的相对荧光强度，至于是哪两种，取决于你检测是机器的设置和你实验的需求。在柱状图上，横坐标代表的是相对荧光强度，而纵坐标是计数。还有一种横坐标是时间轴，而纵坐标是相对荧光强度，这个可以检测检测过程中的信号变化。

前者是指骨髓的细胞学检查，方法包括涂片细胞形态学检查，流式细胞仪检查，免疫组化等等，指的是一组诊断方法。而后者指的是用流式细胞仪来分析细胞，可以使骨髓细胞，也可以是血细胞或者其他细胞，指的是一种技术。

流式可以检测的样本很多：细胞表面的蛋白，通过荧光抗体直接标记细胞内部的蛋白，细胞固定，通透后再用荧光抗体识别细胞内部的DNA含量，细胞固定，通透后加DNA染料细胞内部钙离子浓度，直接加钙离子浓度荧光染料染色细胞内部线粒体膜电位，比如JC-1，罗丹明染料使用微球阵列，可以同时检测溶液中数十种可溶性蛋白的浓度

流式细胞术是有ABC三种功能，但能否分选还要看流式细胞仪的类型，有些是没有分选功能的，如贝克曼-库尔特EPICS-XL型等。流式细胞仪有大型机和小型机，小型机一般为单激发光源488nm，可测定的荧光波长范围也比较少，一般为四色：如525nm,575nm,625nm等，且多无分选功能。大型机多为科研用，有多个激发光波长，能检测的荧光波长广，多达十几色，有分选功能。.

流式细胞仪只能检测细胞表现分子的，

左下为正常细胞，左上为坏死细胞；右上为晚期凋亡细胞，右下为早期凋亡细胞。

（1）一个完整的细胞周期包括分裂间期（又分为G1期、S期和G2期）和分裂期（M期），可表示为G1→S→G2→M．图二中，左侧峰值表示细胞中DNA含量为2，包括G1的细胞；右侧峰值表示细胞中DNA含量为4，包括G2和M期细胞；两个峰值之间的细胞所含DNA含量为2～4，表示此时DNA正在复制，对应图甲中的S期细胞．（2）据图示染色体行为特点可知，图三为有丝分裂后期．图三所示的细胞处于图一中的M期，DNA相对含量为图二中的4时期，此时细胞中染色体加倍，故有同源染色体4对，染色体组4个．（3）DNA复制时期为S期，如果加入DNA成抑制剂．一细胞周期将停留在S期前，故为图一中的G1期；如果加入秋水仙素，抑制的是纺锤体的形成，使染色体加倍，故图二中两个峰值的变化是左边峰值下降，右边峰值上升．故答案为：（1）G1 G2、M 两个峰值之间（2）M 4 4 4 （3）G1 左边峰值下降，右边峰值上升．

你参考一下这2个文献，他们都是用同一个荧光探针：J Biochem Biophys Methods. 2005 Sep 30;64(3):207-15.2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement.Diabetes Technol Ther. 2011 Jul; 13(7): 743–751.A Fluorescence Method for Measurement of Glucose Transport in Kidney Cells

用于流式检测的全血需要用EDTA抗凝（抽血时使用BD的紫色盖抽血管），抽血后不要冷藏或者冷冻。室温下保存24小时内完成检测。如果血样超过72小时，就不能再用于流式检测了。

流式细胞仪测定图中的。这个两个物质是非常有区别的，这种区别根据他们的形式上有一定的区别。再让用法上也是有不同的。