elis

在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。前文（2.2）已述，ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。　　完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定　　　中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液。

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。ELISA实验步骤及注意事项:1、固相载体选择聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。2、包被①板孔的选择：ELISA级别的微孔板。②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度。③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液。④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h。⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。3、封闭①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）。②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）。4、加样及孵育①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm。③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示。④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性。⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。5、显色和终止①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明。②显色底物需现配现用，避免污染。③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。

ELISA的基本原理是：1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开。最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关。故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。扩展资料：ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数值。以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。参考资料来源：百度百科—ELISA

楼主你好！ELISA法指的是酶联免疫吸附实验 ，即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术，可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，它的基本原理主要是： 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）； ②酶标记的抗原或抗体（标记物）；③酶作用的底物（显色剂）。 测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。 希望可以对你有所帮助!

ELISA是一种广泛应用在测定液体样本中的蛋白、抗体、或激素的免疫分析技术。酶联免疫吸附试验的标准程序，通常是把蛋白、抗体、或激素等（即抗原）直接或是以捕捉抗体（capture Ab）固定在固相载体上，再加入一级检测抗体（primarydetection Ab），形成一个抗原抗体的复合物。如果该抗体已经用酶（enzyme）标记了，即可用来直接测定抗原的量，若无，则可利用另一个酶标记的二级抗体来测定抗原的量。测定抗原量的方法是加入该酶的底质（substrate），作用后产生出现的颜色深浅和样本中的抗原量呈正比的关系，依此原理计算出样本中的抗原总量或浓度。1.直接法（direct ELISA）将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。缺点：试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。2.间接法（indirect ELISA）此测定方法与直接法类似，差别在于一级抗体没有酶标记，改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。缺点：交互反应发生的机率较高。3.双抗体夹心法（sandwich ELISA）被检测的抗原包被在两个抗体之间，其中一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量；或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体必须小心选取，才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。4.竞争法（competitive ELISA）样本里的抗原（自由抗原）和纯化并固定在固相载体上的抗原（固定抗原）一起竞争相同的抗体，当样品里的自由抗原越多，就可以结合越多的抗体，而固定抗原就只能结合到较少的抗体，反之亦然。经清洗步骤，洗去自由抗原和抗体的复合物，只留下固定抗原和抗体的复合物，拿来与只有固定抗原的对照组结果相比较，根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量。优势：可适用比较不纯的样本，而且数据再现性很高。缺点：整体的敏感性和专一性都较差。5.最新ELISA技术：基于细胞法（cell-based ELISA）：是一种新的定性蛋白检测技术，将细胞直接在微孔板里培养，待检测时，不需抽提蛋白和裂解细胞，便可直接测量微孔板里蛋白经刺激或抑制作用后的变化。优势：无需裂解细胞，所以目标蛋白损失最少，可测定完整细胞、黏附细胞、还有非粘附细胞。缺点：不能测定抗原量。

elisa 英[u026a"lau026azu0259] 美[u026a"lau026azu0259] abbr.enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附测定法 [例句]Rapid tests are the speedy alternative to the eia and elisa tests - and they "re just as accurate. 快速检测快速检测是一种相对于eia检测和elisa检测来说更快捷的检测方式,它们准确

EILSA主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持其免疫活性和酶催化活性的基本原理。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。ELISA实验步骤及注意事项:1、固相载体选择聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。2、包被①板孔的选择：ELISA级别的微孔板。②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度。③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液。④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h。⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。3、封闭①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）。②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）。4、加样及孵育①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm。③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示。④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性。⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。5、显色和终止①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明。②显色底物需现配现用，避免污染。③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。

　　1、ELISA是酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的简称。它是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 　　2、原理如下： 　　（1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 　　（2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，简写ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法；酶联免疫吸附测定（ELISA）为免疫学中的经典实验。基本原理为：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。扩展资料结果判断——1、定性测定：定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。2、定量测定：ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。参考资料来源：百度百科-ELISA

人名 译文：艾丽斯

抗原和抗体的结合

1.　ELISA的原理 　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记.结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性.在测定时,受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开.再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上.此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例.加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析.由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度. 操作步骤: 1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条,未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条,密封口袋,放回4℃. 2．空白孔加标准品和标本稀释液,其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔),用封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱孵育90分钟. 3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液. 4．洗板5次. 5．空白孔加生物素化抗体稀释液,其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔).用新封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱孵育60分钟. 6．提前20分钟准备酶结合物工作液.避光室温(22-25 ) ℃ 放置. 7．洗板5次. 8．空白孔加酶结合物稀释液,其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔).用新封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱,避光孵育30分钟. 9．打开酶标仪电源,预热仪器,设置好检测程序. 10．洗板5次. 11．加入显色底物(TMB)100ul/孔,避光36℃孵箱,避光孵育15分钟. 12．加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测量OD450值(3分钟内).在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果. 13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束. 建议保存酶标板框,以备下次或者今后试验使用.,10,检测原理: 本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，操作步骤: 1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和,1,1.　ELISA的原理 　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此...,1,

elisa实验原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA技术作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速、定性或者定量甚至定位的特点。ELISA可用于测定抗原，也可以测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检验方法。检测方法一、双抗体夹心法该方法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。二、竞争法该方法一般用来检测具有较少表位的小分子物质，当然，这种方法也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。三、间接法测抗体本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。主要用于对病原体的检测而进行传染病的诊断。四、双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法与间接法都可以对抗体进行检测。五、捕获法测抗体将抗IgM抗体包被于固相微孔板，用无关蛋白载体对未结合位点进行封闭后，加入待测样本，接着加入抗原物质，然后加入针对该抗原的经生物素标记的特异性抗体和HRP标记的链霉亲和素，经TMB底物显色和终止反应后即可计算浓度。

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ELISA，即酶联免疫吸附实验，其基本原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA可用于测定抗原，也可以测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：1、固相的抗原或抗体；2、酶标记的抗原或抗体；3、酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检验方法。分类：一、双抗体夹心法双抗体夹心法，其基本原理是将一定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，然后加入含有抗原之待测样品，通过加入酶标记特异性抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。该方法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。二、竞争法竞争法一般分为直接竞争法和间接竞争法，这里我们以直接竞争法为例进行原理讲解。直接竞争法，其基本原理是：将合适浓度的包被抗体包被于微孔板中，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，加入标准品（样本）和生物素标记的抗原物质进行竞争结合，经合适的温度和一定时间的孵育，洗涤后，加入HRP标记的链霉亲和素进行反应，TMB显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。该方法一般用来检测具有较少表位的小分子物质，当然，这种方法也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。三、间接法测抗体间接法一般用来检测抗体。其基本原理是：将一定量的抗原物包被于聚苯乙烯微孔板，加入无关蛋白载体封闭未结合位点后，加入待测样本，然后加入酶标二抗，经孵育和洗涤后，加底物显色。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。主要用于对病原体的检测而进行传染病的诊断。注意事项1、操作前应对实验的物理参数有充分的了解，如环境温度(保持在18 C～25℃)、反应孵育温度和孵育时间、洗涤的次数等，要先查看水育箱温度，是否符合要求。2、正确使用加样器加样器应垂直加入标本或试剂，避免刮擦包被板底部。加样过程中避免液体外溅，血清残留在反应孔壁上，加样器吸头要清洗干净，避免污染，加样次序要与说明书一致，否则可导致结果错误，实验重复性差。3、手工洗板加洗液时冲击力不要太大，洗涤次数不要超过说明书推荐的洗涤次数，洗液在反应孔内滞留的时间不宜太长。不要使洗液在孔间窜流，造成孔问污染，导致假阴性或假阳性。4、要保证加液量一致 我们在使用时感觉滴瓶加液不如加样器好，滴瓶不易控制加液量不准，造成显色不统一，判断错误。5、显色液量不可过多 加样的工作环境不能处于阳光直射的环境下，加显色系统后要避光反应，显色液量不能过多，以免显色过强。6、试剂的影响因数：应选用有国家批准文号，质量靠得住的产品，不能图便宜，忽视质量保证。试剂应妥善保存于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。ELISA实验基本方法：将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。扩展资料：ELISA实验基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。

诚至生物 6月20日 酶联免疫吸附测定ELISA酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。基本原理是：1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。由于酶的催化频率很高，故可放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，再用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应底物后，底物被酶催化为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据反应后颜色的深浅进行定性或定量分析。实验流程客户提供1.含待测样品的标本（血清、血浆等）2.ELISA试剂盒 我们提供1．基本实验步骤2．EXCEL原始数据3．标准曲线实验结果展示1) ELISA标准曲线

找德元国际，他们做这方面实验

临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于elisa试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性

该法由种类和变化可分为以下几种：（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA

抗原与抗体的特异性反应

1、ELISA是酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的简称。它是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 2、原理如下： （1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 （2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

如果盒子没有什么问题，我个人觉得前处理和甩板比较关键，特别是呋喃、孔雀石绿这些项目的前处理，麻烦得要死

需要做一条标准曲线啊，然后标准曲线作图，在图上找点呗，当然其实EXCEL的xy散点图也可以做的。

　　酶联免疫吸附剂测定　　enzyme linked immunosorbent assay，ELISA。指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。　　基本原理　　1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。　　方法类型和操作步骤　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。　　（一）双抗体夹心法　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：　　（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。　　（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。　　（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。　　（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。　　（二）双位点一步法　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。　　在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。　　（三）间接法测抗体　　间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：　　（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。　　（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。　　（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。　　（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。　　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。　　（四）竞争法　　竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：　　（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。　　（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。　　（五）捕获法测IgM抗体　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：　　（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。　　（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。　　（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。　　（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。　　（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。　　（六）应用亲和素和生物素的ELISA　　亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。　　亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。　　ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.

ELISA的英文全称是enzyme-linked immunosorbent assays 即酶联免疫吸附测定。顾名思义，该方法涉及到用酶标记（联接）抗体或抗原和免疫吸附（一般指抗原抗体的反应）过程。该方法可以广泛地用于测定各种生物分子。

　　常见的ELISA试剂盒都有:一、食品安全检验ELISA试剂盒是指食品中的激素、药物、霉菌毒素、过敏原残留、转基因产品的检测试剂盒，以及微生物、维生素等的检测产品。包括植物病毒、细菌、真菌、植物激素和转基因作物的农业诊断试剂盒，以及动植物疾病诊断类如猪、牛、羊、马等家畜和禽类以及宠物类检测试剂盒。二、生物原装ELISA试剂盒以及各类国产ELISA试剂盒1、细胞因子检测试剂盒：如白介素、选择素、集落刺激因子，肿瘤坏死因子，干扰素，转化生长因子，趋化因子，细胞因子受体，粘附分子，生长因子，凋亡因子等等2、心肌梗塞检测ELISA试剂盒如肌钙蛋白，肌红蛋白，C-反应蛋白等等3、内分泌检测ELISA试剂盒如甲状腺，胰腺，性激素，孕酮，睾酮，生长激素，生长抑素，内皮素，皮质醇，骨钙素，催乳素，促肾上腺皮质激素，促卵泡素，雌二醇，雌三醇，5-羟色胺，17-羟孕酮等等4、肝纤维化检测ELISA试剂盒如纤维连接蛋白，透明质酸，胶原，基质金属蛋白酶抑制因子，基质金属蛋白酶，层粘蛋白等等5、自身免疫检测ELISA试剂盒如甲状腺，盐水可提取核抗原抗体(ENA)，抗核抗体，DNA，抗心磷脂抗体，类风湿因子，循环免疫复合物，抗胰岛细胞抗体，胰蛋白酶原，Sm，大疱性类疱疮，蛋白酶，短膜虫法，肝-肾，肝-肾-胃，肌内膜抗体，角蛋白抗体，抗核抗体，抗核糖体蛋白抗体，抗聚角蛋白微丝蛋白抗体，抗链O，抗卵巢抗体，抗平滑肌抗体，抗线粒体抗体，等等7、优生优育检测ELISA试剂盒如早早孕，新生儿TSH，胎膜早破检测，抗子宫内膜抗体，抗心磷脂抗体，抗透明带抗体，抗卵细胞透明带抗体，抗卵巢抗体，抗精子抗体，巨细胞病毒，弓形体，风疹病毒，分娩预测，单核白细胞增多症，单纯疱疹病毒，促卵泡素，促黄体生成素，便隐血试纸，HCG等等8、传染病检测ELISA试剂盒如幽门螺杆菌，乙脑，乙肝，丙肝，丁肝，戊肝，庚肝，衣原体，性病，腺病毒，微小病毒B19，天疱疮，水痘-带状疱疹病毒，生殖支原体，伤寒，沙眼，腮腺炎，人型支原体，麻疹，轮状病毒，流行性出血热，淋球菌，莱姆病，柯萨奇，抗解尿支原体，军团菌，结核，胶原，尖锐湿疣，甲肝，脊髓灰质炎，急性胰腺炎尿胰蛋白酶，霍乱，呼吸道合胞病毒，肝吸虫，副流感，肺炎，带状疱疹，传染性单核细胞增多症，层粘蛋白，布鲁氏杆菌，百日咳，白喉，艾柯病毒，EB 病毒，A族链球菌等等9、特种蛋白检测ELISA试剂盒如免疫球蛋白，抗链O-aso，类风湿因子RF，C反应蛋白，微量白蛋白，β-2微球蛋白human，铁蛋白，转铁蛋白transferrin等等10、肿瘤标志物检测ELISA试剂盒如肿瘤标志物，组织多肽抗原，肿瘤相关因子，胰腺癌，直肠癌，细胞角蛋白片段，胃肠癌，铁蛋白，糖链抗原，神经特异性稀醇化酶，上皮膜抗原，乳腺癌，人抗小鼠抗体，前列腺，甲胎蛋白，肝癌，大肠癌，肺癌，大小便隐血检测，癌胚抗原，β-2微球蛋白等等

enzyme linked immunosorbent assay,ELISA.指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上,进行免疫反应的定性和定量方法.这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性.②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性.在测定时,把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例.加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析.由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度. 聚合酶链式反应,简称PCR.聚合酶链式反应,其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点.它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术.

1、包被的浓度：高浓度或低浓度会产生不一样的结果； 2、封闭：封闭的好与不好决定显色后底色会不会有，或者有多少； 3、孵育时间和温度：不同的孵育时间和温度出现的结果也会不同； 4、显色时间和温度：不同的显色时间和温度会造成不一样的结果； 5、整个缓冲液体系的配方：有的缓冲液能起到减少底色的作用。

临床上疾病的辅助诊断手段采用ELISA方法：HBsAg HBeAg HBcAb-IgG HBcAg-IgM HBeAb HBsAb AFP、hCG

　　在国内生物研究蓬勃发展的现在，假冒无视科学研究的严谨性和严肃性，让广大的科研工作者被动造假，严重破坏了科研氛围，扰乱了市场秩序，联科生物整理了一些鉴别这些假冒伪劣ELISA试剂盒的方法，供广大的科研工作者和用户参考，让希望对广大科研工作者有所帮助。　　购买前　　【方法一】向厂家索要或从其网站下载说明书，查找ELISA的性能指标：准确度(加标回收率、稀释线性)、精密度(板内差、板间差)、灵敏度、样本值、特异性、校准。一般来说，除了校准不一定每份说明书都有外，其余的指标一般都需要罗列(部分样本需要高倍稀释的，可能没有准确度这个指标)。如果无法提供这些性能指标，则说明该试剂盒可能是假货，或者试剂盒开发过程不够科学严谨，有可能无法检测出真实的样本值。　　【方法二】对于夸大ELISA涵盖的指标的范围，尤其是不常见的种属，可先去国际知名ELISA试剂盒供应商(如eBioscience、R&D)网站上搜索，如果搜索不到该种属的ELISA试剂盒，则有可能是假货，需要小心谨慎。　　【方法三】将“厂家名”、“ELISA”和“假货”等关键词在网上搜索，有的网站或论坛如丁香园等会有打假曝光台。　　购买后　　【方法一】检查说明书、包装盒的质量，通常假冒伪劣产品为了降低成本，印刷的质量会比较差。其次仔细阅读说明书，如上所示查找ELISA的性能指标。　　【方法二】　　Ⅰ.利用干扰实验即可鉴别ELISA试剂盒是否检测目的抗原，方法如下：　　(1)将针对试剂盒特异性的重组蛋白抗原和试剂盒中的检测抗体配置成antibody:antigen=1:2的混合孵育液　　(2)37℃孵育15分钟后，代替原试剂盒中的检测抗体　　(3)后续操作按照试剂盒说明书进行，加检测抗体、酶复合物和底物　　(4)实验完毕后，检测其标准曲线，如果标准曲线良好则说明加入的目的抗原和试剂盒抗体不匹配，试剂盒检测抗体针对的是非目的抗原，该试剂盒为伪劣假造ELISA试剂盒。　　(5)如果标准曲线无线性，则说明试剂盒检测抗体已被目的抗原中和或干扰，影响了其实际试剂盒抗体的检测作用，则该试剂盒检测抗体针对的是目的抗原。　　Ⅱ.如果购买了两盒同一公司的ELISA试剂盒A和B，利用交叉实验即可鉴别ELISA试剂盒是否造假，方法如下：　　(1)取出购买的试剂盒A的包被板两条。　　(2)一条包被板加试剂盒A的标准品做标准曲线。　　(3)另一条包被板加试剂盒B的标准品做标准曲线。　　(4)后续操作按照试剂盒说明书进行，加检测抗体、酶复合物和底物。　　(5)实验完毕后，检测两条标准曲线，如果两条标准曲线一致则说明两个ELISA试剂盒检测的同一个指标而非A和B，即该试剂盒为伪劣假造ELISA试剂盒。　　(6)如果两条标准曲线不一致则说明两个ELISA试剂盒检测的不同指标，试剂盒A只能检测A，不能检测B，即该试剂盒为正常的ELISA试剂盒。

Elisa Kit使用方法（以人IL-4 ELISA KIT为例）：检测原理:本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可 通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。试剂盒组成：1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6）2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支）3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml）4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支）5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支）7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）8．浓缩洗涤液 20× （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml）9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）11．封板胶纸（6/3 张）12．产品说明书（1 份）标本收集:1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。注意事项:1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后 再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻 融。5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试 验结果。9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时， 请按国家生物试验室安全防护条列执行。 检测前准备工作:1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。3. 标准品: 加入标准品/标本稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。复溶标准品原液（1000 pg/ml）若未用完请分装后放入-20℃以下电冰箱内保存，保存两个月。已稀释的标准品请废弃。4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致生物素化 抗体量不足，可向我们公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以酶结合物稀释液稀释浓 缩酶结合物(1:30) 成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足， 可向我们公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号） 洗涤方法:1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350ul，注入与吸出间隔15－30秒。洗板5次。2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。操作步骤:1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。4．洗板5次。5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。7．洗板5次。8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。10．洗板5次。11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。结果判断:1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。灵敏度、特异性和重复性:● 灵敏度：最小可测人IL-4达7pg/ml。● 特异性：不与IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反应。● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。IL-4简介：IL-4是一种由活化的T细胞产生的细胞因子，以往称为B细胞生长因子1。在B细胞生长的早期活化B细胞，并使被抗原、抗IgM或脂多糖活化的B细胞进入细胞周期G1期。IL-4增强MHCII类抗原的表达和CD23（FceRII）在B细胞上的表达，诱导同种型（isotype）转换，如促使小鼠B细胞从分泌IgM、IgG3、 IgG2b转变成分泌IgG1、IgG2a、IgA和IgE。也增强单个核吞噬细胞表达MHCII类抗原，但对炎症性细胞因子（如IL-1,TNF,IL-8）的释放和这些细胞的杀菌活性有抑制作用。IL-4 也活化细胞毒性 T细胞，它被认为是典型的由TH2细胞产生的细胞因子，对于T,B淋巴细胞的发育以及驱动体液免疫反应和抗体产生都是十分重要的。

临床ELISA测定现通常为采用手工操作的以微孔板条为固相的测定模式，测定操作非常简单，一般涉及到标本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。现分述如下。 一.临床标本的收集和保存 用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的最适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面： （1）要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。 （2）样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 （3）血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。 （4）冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。 （5）标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。 二、试剂准备 在临床实验室，对试剂准备一般不太注意，通常的做法是，在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来，在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，当试剂盒以OPD为底物时，则底物溶液应在反应显色前临时配制。 三、加血清样本及反应试剂 在现在的ELISA商品试剂盒中，血清样本的加入几乎是唯一的要使用微量加样器加入样本的步骤。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。试剂的加入在国产试剂盒中基本上均是从滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。 四、温育 温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。 温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟～1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1～2小时才能有较完全的结合，低于1小时，可能会影响测定下限。因此，关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点： （1）要保证在设定的温度下有足够的反应时间。一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。曾有一地处南方的血站同行提出了一个问题，就是在每一年的冬季总有那么一个多月的时间，在做HBsAg测定的室内质控中，测定由卫生部临床检验中心供应的1 ng/ml弱阳性样本时，总是测不出来，不知原因为何？这可能就与南方冬天室内温度较低有关，此时微孔板转入温箱后37℃温育时间不够，以致弱阳性样本测定为阴性。因此，为保证37℃下足够的温育时间，临床实验室可自行确定本实验室不同季节（不同室温下）微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。具体的做法是，用一小温度计放置板孔反应溶液中测量观察即可。 （2）温育温度的选择。在有的ELISA试剂盒的说明书中，指出温育温度可有两种，例如，一种是37℃下1小时，另一种则为43℃下45分钟。从免疫测定的抗原抗体反应的本质来看，在较低的温度下反应较长的时间最为完全。如2～8℃下反应24小时。较高的反应温度，由于分子运动的加怜惜，反应时间缩短，这一点对分子含量较多的强阳性样本的测定没有问题，但对分子含量少的弱阳性样本则有漏检的可能。因此，我们建议在临床ELISA测定中尽量使用较低温育温度较长反应时间的条件。 （3）“边缘效应”的排除。以前在使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深，产生这种“边缘效应”的原因可能为96孔板周孔与中心孔表面或热力学特征的不同。但有研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。 总而言之，在临床ELISA测定中，要保证好的测定效果，可采用下述简单办法来确保温育条件，即尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上，或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中，这样就会因为板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，以及水浴箱或湿盒内的高温度，而使反应溶液的温度迅速与温室平衡。 五、洗板 固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。因此，洗板对于ELISA测定来说，也是极其关键的一步。以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是，借助其疏水基团与经疏水性相互作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的目的，但由于抗体或抗原的包被通常也是通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。 在临床实验室中，ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。手工洗板即是在每次反应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放置2～3分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重复上述洗涤步骤3～4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下一步测定操作。洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板机进行，使用洗板机洗板的一个特点是，每次洗板后不能拍干，故有较多的液体残留，液体残留量小的洗板机洗板至彻底所需的次数要少于残留量大的洗板机。在特定临床实验室所使用的洗板机，到底洗多少次能达到要求，可进行下面这个简单的实验：选择4×8 HBsAgELISA包被板条，每2×8孔分别加入相同一份弱阳性和一份阴性样本，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育后，洗板孔时按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物显色测定，如洗3次后，显色不再改变，即洗3次的板孔比色测定与4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，阳性/阴性值保持最大不变，则可以认定该实验室所用洗板机3次洗板即可达到要求。 六、显色 在目前的以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。一般商品试剂盒显色反应条件为37℃或室温反应15～30分钟。从理论上说，37℃30分钟才可以使HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在37℃下反应25～30分钟后，终止反应比色测定。 此外，在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。以OPD为底物，配好后应为无色，否则就不能使用。以TMB为底物，整个显色反应过程无需避光，而以OPD为底物，则需避光进行。关于TMB和OPD的显色反应特点及注意点可参考前面有关章节内容。显色反应完成后，加入酸终止反应，振荡混匀后即可进行下面的比色测定或肉眼判断结果。 七、比色 ELISA的比色测定由酶标仪进行，有的同行可能会认为，既然由酶标仪进行，那么此时便可以万事大吉了，其实不然，因为当代较为先进的酶标仪器仪表，均有较多的功能，使用不当，会得到令人难以理解的结果。如使用酶标仪比色测定后，有许多阴性测定孔的吸光度值为负数或测定假阳性率大大增加等等。这主要是没有正确地理解和使用酶标仪所致。至于如何正确理解和使用酶标仪详见后面有关章节。此处，只是强调下面两点： （1）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。由于有的临床实验室在进行ELISA测定时，以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。 （2）单波长或双波长比色选择的问题。中档以上的酶标仪基本上都同时具有单波长和双波长比色功能。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，一般不必设空白孔。如在使用双波长比色时，仍设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。 八、结果判定 临床ELISA测定按其表示测定结果的方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。可见定性测定通常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病原体感染的存在与否。而定量测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数值表示。定量测定基本上是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因子、肿瘤标志物、小分子药物等。目前国内在临床上应用的ELISA试剂盒绝大部份是用于传染性病原体的抗原或抗体的定性测定，也有少部份用于αFP、hCG、细胞因子等的定量测定。ELISA定性测定的“阳性”和“阳性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判定值（Cut-off）。定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线（又称标准曲线）。有关ELISA定性和定量测定结果的数据处理后面将有专门章节讨论。本处只想强调的一点是，ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”结果的判定依据只能是试剂盒本身所确定的Cut-off值，而不能以卫生部临床检验中心供应弱阳性定值质控血清。为什么要强调这一点呢？主要是因为以前有很多基层实验室均使用部中心供应的弱阳性定值质控血清（以前也称“临界值”血清）的测定吸光度来判定结果，高于其判为阳性，反之为阴性，而不管试剂盒Cut-off值为何。到目前为止，仍有一些实验室在坚持这种错误的做法。试剂盒的Cut-off值的设立是建立在一系列科学试验及统计学研究的基础上的（详见后述），而部中心供应的弱阳性定值质控血清主要是供临床实验室进行室内质控时使用。 下面再解释一下在ELISA定性测定结果判定中常用的一些缩写。 （1）S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。 （2）S/N或P/N：其中S同（1），N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或P/N≥2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1倍视为Cut-off值而已。 九、结果报告及解释 临床ELISA测定结果的报告较为简单。定性测定报阴性或阳性即可；定量测定则报出具体的数值。结果解释比较起来要复杂的多，它要求实验室技术人员对所测定的项目有较为全面的知识基础。例如，对乙肝“两对半”结果的解释，不但要求检验者要知道不同的结果模式的临床意义，而且必须对乙肝病毒的分子生物学、分子的变异及其对表型的影响有更深层次的了解。现在，检验不再是单纯的实验室测定，而已成为一门临床医学学科，即检验医学，这就要求从事医学检验工作的检验医师，对所做的测定项目除了知其然，还要知其所以然，否则就难免为时代所淘汰。 综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因，特对常见问题及原因归纳总结于下表。临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因问 题可能的原因（非试剂盒本身的原因）1．弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题2．测定的重复性差（相同样本两次测定结果不一致）这是典型的由测定操作引起的问题，包括（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；（2）加样过快，孔间发生污染；（3）加错样本；（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；（5）不同批号试剂盒中组分混用；（6）温育时间、洗板、显色时间不一致；（7）孔内污染杂物；（8）酶标仪滤光片不正确；（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。3．白板（阳性对照不显色）（1）漏加酶结合物；（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。（3）漏加显色剂A或B；（4）终止剂当显色剂使用。4．全部板孔均有显色（1）洗板不干净；（2）显色液变质；（3）加底物的吸光受酶污染；（4）洗板液受酶等污染。摘自《检验诊断与实验室自动化》2004年第4期

1、类型夹心法常用于检测大分子抗原，将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体，重复两次，洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。间接法常用于检测抗体，将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原，重复两次。洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器测定塑胶盘中的吸光值，以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体；加入待测检体、带有酶的抗原，与塑胶孔盘上的抗体专一性键结。塑胶孔盘上固著抗体数量有限，检体中抗原量越多，带有酶的抗原可键结固著抗体就越少。2、原理在测定时把受检标本和酶标抗原或抗体，按不同步骤与固相载体表面抗原或抗体起反应。用洗涤方法使固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。扩展资料：Elisa应用Elisa生物试验敏感性高，特异性强，重复性好。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒适用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒IgM抗体ELISA检测。参考资料来源：百度百科-ELISA

　　1.储存。　　收到试剂盒后应尽快放入冷藏室内保存，保存温度为4℃-8℃。　　2.回温。　　试剂盒在使用前应于室温（22-27℃）下充分回温，回温时间为40-60分钟。回温过程中勿将酶标板的包装袋开封，回温结束后再将其从包装袋中取出使用。　　3.样品稀释。　　样品稀释应严格按照说明书要求的稀释倍数进行稀释。如稀释倍数过大，可采用多步法进行样品稀释。例如：试剂盒要求样品需进行500倍稀释，可吸取5μl样品加入245μl样品稀释液中，充分混匀后，再吸取10μl混合液加入90μl样品稀释液中即可。　　4.加样。　　稀释好的样品在加入酶标板进行孵育的过程中，尽可能缩短第一次加样和最后一次加样的时间间隔，样品加好后马上开始计时。　　5.洗板。　　样品孵育时间结束后，马上甩去孔内液体。如多块酶标板需同时洗涤，可先将板内液体甩去，倒扣于吸水纸上，再依次进行洗涤。使用洗板机洗涤时，建议洗涤次数增加一次。未用完的洗涤液可在4℃-8℃下密封保存1月。　　6.显色。　　底物药片可在显色前3-5分钟加入底物缓冲液中，混合直到完全溶解。本试剂最好是现用现配，未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周。　　7.终止及读数。　　提前打开酶标仪，加入终止液后立即读数。　　8.同批号试剂盒中的试剂，除酶标二抗及阳性对照外，其余均可通用。　　9.移液器的正确使用、保存、清洁、校对。　　10.实验室管理　　桌面保持整洁，插枪头戴手套等。

ELISA试验要求一般可以看产品的说明书，说明书上一般都会介绍的比较详细。你可以看看人IL-1β ELISA试剂盒的介绍（pdf文件：www.neobioscience.net/Uploads/pdf/EHC002b.pdf）；如果像这种里面没有介绍全面的话，自己可以咨询购买ELISA试剂盒的厂家，基本上厂家都是有技术支持的。

主要就是抗原抗体的特异性反应。具体三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。ELISA，即酶联免疫吸附实验，其基本原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA技术作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速，定性或者定量甚至定位的特点。

这个

不

是日本歌手名字。LISA（1989年4月14日－）是神奈川县出身的女性歌手。Elite Model Management所属。2007年7月自“elite MODEL LOOK 2007”应募者3000人入选10人之一。在视听的审查员询问到关于模特的工作时回答“我并不想成为模特，而是歌手”，让她试唱后就决定一个月后出道。在LIVE中自称为“博士”。2010年4月29日举行的ELISA第三次LIVE“Rouge Adolescence”中，本人首次作词作曲的歌曲《真実の证》披露（其后收录于第三张专辑Lasei中）。于2008~2011年连续四届参演动画界最大规模的演唱会Animelo Summer Live。于2008~2011年连续四届参演动画界最大规模的演唱会Animelo Summer Live：《Animelo Summer Live 2008 -challange-》演唱曲目《euphoric field》《HIKARI》《Animelo Summer Live 2009 u2212RE:BRIDGE-》演唱曲目《Wonder Wind》《ebullient future》《Animelo Summer Live 2010 -evolution-》演唱曲目《Dear My Friend》《Real Force》《Animelo Summer Live 2011 -rainbow-》演唱曲目《God only knows》《集积回路の梦旅人》

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。ELISA实验步骤及注意事项:1、固相载体选择聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。2、包被①板孔的选择：ELISA级别的微孔板。②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度。③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液。④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h。⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。3、封闭①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）。②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）。4、加样及孵育①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm。③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示。④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性。⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。5、显色和终止①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明。②显色底物需现配现用，避免污染。③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。

1、ELISA是酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的简称。它是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 2、原理如下： （1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 （2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA可以用来检测血清样本，看有还是没有某个抗原或抗体，也可以看该抗原或抗体是多还是少，可以比较不同血清样本之间该抗原/抗体的含量高低。如果该抗原是一个病原，或该抗体是一个对某病原具有特异性的抗体，则ELISA检测该抗原或该抗体的结果，可以用来帮助判断，提供血清的个体，是否感染或曾经感染过这个病原。

ELISA酶联免疫吸附实验1.原理：免疫分析是一种利用特定抗体与抗原或半抗原发生的高选择性高特异性识别和结合原理，对待测抗体或者抗原进行分析测定的方法，酶联免疫吸附分析（下称ELISA）是免疫分析的一种，分三个部分组成：免疫识别，信号输出和数据处理。2.步骤：免疫识别是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗体，而后利用抗体识别待测的抗原（通常是疾病的蛋白质生物标记物，病毒，细菌等等，从复杂待测液中将抗原吸附到96孔板表面。接着用带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、荧光或放射性标记的抗体通过直接或者间接的方式输出识别信号。最后利用信号强度，标准样品浓度梯度等信息计算得出待测样中目标抗原的浓度。3.分类：根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等等。其中双抗体夹心法在商业应用上最常见。双抗体夹心法：①：抗体包被 在96孔板上包被抗体。由于酶标板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯环与抗体的氨基酸残基具有类似π-π堆积作用的引力，结合静电和疏水作用，可以将抗体吸附于其表面。然后，将未吸附的抗体用缓冲液清洗后，加入含有明胶或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分。加入封闭液的目的，是防止其他蛋白因静电或疏水作用吸附在96孔板上，造成假阳性信号，干扰后续实验的进行。②：免疫识别 在96孔板上包被抗体后，加入待测样，并在37°C环境下孵育一段时间，通常是1-2小时。此时酶标板上的抗体与待测抗原进行特异性识别结合。此处抗体的质量是关键，好的抗体既能特异性高效地结合抗原又不受待测样中其他生物大分子、蛋白质和无机盐等成分的影响。③：洗板 将未结合的抗原洗掉，加入该抗原所对应的识别抗体并在37°C下继续培养1-2小时，接着将未连接上抗原的抗体洗掉。④：酶标信号输出 加入带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的酶标二抗，用于和标准抗体结合。在培养30分钟后洗掉未连接的二抗，并加入显色剂显色。根据显色的结果判断抗原的浓度。一般认为，抗原浓度与显色后的发光强度呈正相关。免疫竞争法以抗原竞争抗体为例，在上述免疫夹心法操作步骤的第二步加入待测抗原后，立刻加入酶标抗原，使之与待测抗原竞争识别酶标板上的抗体。当待测抗原浓度越高，能够连上酶标板上抗体的酶标抗体就越少，输出的信号就越少。这样待测样浓度与酶显色信号就呈逆相关。

ELISA，即酶联免疫吸附实验，其基本原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA技术作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速、定性或者定量甚至定位的特点。ELISA可用于测定抗原，也可以测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①、固相的抗原或抗体；②、酶标记的抗原或抗体；③、酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检验方法。

ELISA即酶联免疫吸附测定，指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可用于疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。扩展资料 ：ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数值，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。ELISA也可应用于病毒抗体检测：流感病毒、腮腺炎病毒、麻诊、风疹、轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等，其敏感性都超过目前常用的检测方法。此外，还可用于鉴定病毒型别，例如疱疹病毒。参考资料：百度百科-ELISA

elisa[英][u026a"lau026azu0259][美][u026a"lau026azu0259]abbr.enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附测定法; 以上结果来自金山词霸网络释义百科释义1. 酶联免疫法2. 酶联免疫吸附试验收起例句:1.Rapid tests are the speedy alternative to the eia and elisa tests-and they"rejust as accurate. 快速检测快速检测是一种相对于eia检测和elisa检测来说更快捷的检测方式，它们准确性是相同的。article.yeeyan.org2.Elisa for detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. 口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒。putus.org.cn3.Mouse dehydroepiandrosterone, dhea elisa kit. 小鼠脱氢表雄酮试剂盒。www.gbdelisa.com4.Swine fever antigen elisa diagnostic kit. 猪瘟抗原酶免疫测定试剂盒。www.lookchem.cn5.Clinic meaning of detecting pneumonic mycoplasma and igm with themethods of elisa. 酶联免疫吸附法检测肺炎支原体igm抗体及临床意义。

人名 译文：艾丽斯

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Caliburn——必胜黄金之剑

你是要实现怎样的效果？非要这样做？用ExpandableListView不行吗？你这样子嵌套本身就存在很多问题，就像你说的获取焦点就是一头痛的问题，也不好控制。自己都理不清的时候，写起来就费劲了。考虑下能不能用ExpandableListView来做吧！

因为她的口音十分严重无法进入上流社会正逢赌局所以被改造成一口纯正英语的lady望采纳谢谢

454测序：DNA文库制备→emPCR→上机测序 Solexa测序：文库制备→Cluster扩增→边合成边测序 SOLiD测序：样品制备→Emulsion PCR和底物准备→测序反应→图像收集→

歌曲名:Swan歌手:Elisa专辑:Itunes Summer Of Music - Elisa Live「Swan」作词：真名杏树作曲：田中秀典编曲：横山裕章歌：May"n「もう信じない…」つぶやきながら　伏せた睫毛がすごく悲しいただ会いたくて　でも会えなくて　心の声　打ち消そうとしてる离れがたい指をからめて　寄りそって见た胧月忘れるなんて出来ないでしょう？恋に落ちて立ちすくむ白鸟みたい　あなたひとりぼっちでは空は远すぎてつい逃げ込んでしまう　键穴のない湖ねぇ　息をして今すぐに　その胸が叫んでる　「好き」とくちづけの後　ふいに浮かんだ疑いの影　振りほどいても情けないほど　その恋人だけを追いかけてた　淋しさはエンドレス时雨の道　肩まで濡れてサヨナラ告げた夜はもう忘れなければいけないのに恋はまるで泣き虫な白鸟みたい　みんないつもの今日を抱きしめ　さまよえば街の明かりは青く　水面のようにまぶしいあと少しだけそばにいる　もらい泣きさせないで　涙何も言わずに　やけに长い夜が明けるのを　待つのもいいねぎこちないほど澄んだ瞳でまた笑いかけてよ…あの日のあなたのまま恋に落ちて立ちすくむ白鸟みたい　私も独りぼっちでは空は远すぎてついにげこんでしまう键穴のない湖そう　息をして　今すぐにおなじ刹那を呼び続けてもう一度信じたら　きっとhttp://music.baidu.com/song/10251657

是这个??徐:要一见钟情 要一箭穿心 一瞬间就决定 才是真的爱情 刘:要想清楚 要一步一步 等缘分都停驻 才有真正的幸福 合唱:干嘛要想得很美想得很远 只要这秒有感觉 孔:吻一下 拥抱一下 都胜过誓言 徐:一恋爱我会撒娇又耍赖 刘:一恋爱我会体贴又关怀 刘/徐:看着情人小事也变得浪漫 听冷笑话都会笑到流汗 徐:一恋爱我的人会亮起来 刘:一恋爱我会活的更精采 刘/徐:热恋的人总会特可爱 微笑像有翅膀停不下来 大家来恋爱 Rap:Why you talki" that mess huh? Why you trippin"but love huh? Why can"t you just let it go Just don"t say no Give it to me now momma You must be dreamin"if you think love is so 完美 So you best stop dreamin"lemme tell you love is a game It"slike round n round spinnin here we go you be like "Is this really ture?" I say I don"t know can"t tell you right now But you can stii be my boo It"s just like somethih" about you makes me feel on so good So just don,t don"t fight the feeiing Wouidn"t stop if you could Rap:I look at love simply give me some please If you don"t want it pass it on move quickly Tese girls they need attention My time love and affection Day one all on stress Day two up in your neck Day three where did this come from Day four comes around baby girl I"m gone 还是....以下为Bossy歌词Ay uh…. You don"t have to love me You don"t even have to like me But you will respect me You know why? ‘Cause I"ma boss! Uh uh.... watch the beat go.... Uh uh.... watch the beat go.... Uh uh.... watch the beat go.... Uh uh.... watch that beat go.... [Hook:] I"m bossy, I"m the first girl to scream on a track I switched up the beat of the drum That"s right i brought all the boys to the yard And that"s right, i"m the one that"s tattooed on his arm I"m bossy, I"m the bitch y"all love to hate I"m the chick that"s raised the stake I told young stunna he should switch debate I"m back with an 808 cause i"m bossy [Verse 1:] Ooh lemme slow it down for ya so you can catch the flow Screw it up make it go extra slow Real girls get down on the flo" (On the flo" get down, on the flo‘) Ooh i gave you a taste you want some more Touch down on it like a pro I ride the beat like a bicycle, I"m icy cold [Bridge:] Ooh from the 6-4 hefers up in crenshaw The money makin" playas up in Harlem Don"t want no problem We gon" keep it bumpin" while the 808 is jumpin" [Pre-Hook:] Diamonds on my neck Di-diamonds on my grill Diamonds on my neck Di-diamonds on my grill [Hook:] I"m bossy, I"m the first girl to scream on a track I switched up the beat of the drum That"s right i brought all the boys to the yard And that"s right, i"m the one that"s tattooed on his arm I"m bossy, I"m the bitch y"all love to hate I"m the chick that"s raised the stake I told young stunna he should switch debate I"m back with an 808 cause i"m bossy [Verse 2:] Ooh (I bet I bet I bet) I betcha neva heard it like this before My baby be cruising" them phantom doors Got the bar poppin this that you can"t afford (Can"t afford) Ooh i"m drinkin" blastin" the crowds it"s all smoking" All the while i"m all open Me and my girls we stay fly and we love to stay high [Bridge:] Ooh from the 6-4 hefers up in crenshaw The money makin" playas up in Harlem Don"t want no problem We gon" keep it bumpin" while the 808 is jumpin" [Pre-Hook:] Diamonds on my neck Di-diamonds on my grill Diamonds on my neck Di-diamonds on my grill [Hook:] I"m bossy, I"m the first girl to scream on a track I switched up the beat of the drum That"s right i brought all the boys to the yard And that"s right, i"m the one that"s tattooed on his arm I"m bossy, I"m the bitch y"all love to hate I"m the chick that"s raised the stake I told young stunna he should switch debate I"m back with an 808 cause i"m bossy [Too Short:] It"s bout time that she get with me Can"t stop starin, she"s fine and she"s pretty Damn girl, don"t hurt ‘em If niggas don"t back down, you gon work em Put your mack down, i know your background What chu want girl, you gettin mad now That"s how you do it, huh? Well i"m the coolest one The bad bitches in the back bring ‘em to the front (Biatch) Tell that man you"s a boss bitch Make some noise, raise your hand if you"s a boss bitch I don"t think he understand you"s a boss bitch Get some help if you can cause he lost it Ain"t no refunds, she spent the cash mayne In your benz with her friends in the fast lane Flossin, you say "How much it cost me?" About a million dollars playa, she"s bossy [Hook:] I"m bossy, I"m the first girl to scream on a track I switched up the beat of the drum That"s right i brought all the boys to the yard And that"s right, i"m the one that"s tattooed on his arm I"m bossy, I"m the bitch y"all love to hate I"m the chick that"s raised the stake I told young stunna he should switch debate I"m back with an 808 cause i"m bossy Uh uh.... watch the beat go.... Uh uh.... watch the beat go.... Uh uh.... watch the beat go.... Uh uh.... watch the beat go.... Uh uh.... watch the beat go.... Uh uh.... watch the beat go.... Uh uh.... watch the beat go.... Uh uh.... watch the beat go....翻译瑷扛啊. 你不一定要爱我,你也不用像我这样,但你能尊重我,你知道 为什么? "事业i"ma老板! 嗯嗯…… 守望巡逻去.... 嗯嗯…… 守望巡逻去.... 嗯嗯…… 守望巡逻去.... 嗯嗯…… 守望,巡逻去.... [钩: ]我博西 我的女孩尖叫了我的轨道转起来的节拍鼓,那是我的权利 使所有男孩的小鹿,而公民的权利, 我的一点的纹身手臂我博西 我的荡妇同感爱恨我的小鸡说的提出要价,我告诉年轻stunna他应 开关辩论,我回来了808事业,我博西[一首诗: ]哇lemme缓慢下来,让雅 你可以捕捉流螺钉起来使其走额外缓慢真实女孩下床就芙萝" (关于芙萝"坐下,就 芙萝的" )哇,我给你品尝,你想多一些落地就好像一个亲我 坐击败喜欢自行车,我』 米冷冰冰[桥: ]哇,从6-4 hefers起来crenshaw钱makin " playas在哈林不想 没有问题,我们健在的不断bumpin "虽然是808的Jumpin "前钩: ]钻石在我的脖子上荻钻石对我国伽马 生病钻石对我的脖子荻钻石对我的晚餐[钩: ]我跋扈,我笔 他首先女孩尖叫了我的轨道转起来的节拍鼓那个时候我broug 羟所有男孩的小鹿,而公民的权利,我笔 他说,其中的纹身手臂我跋扈,我笔 他荡妇同感爱恨我的小鸡说的提出要价,我告诉年轻stunna他应该切换 小时辩论,我回来了808事业,我博西[韵文2 : ]哇(我猜我猜我猜)我betch 涅瓦一听到这样,我才抱着游玩的人幽灵门得到律师poppin这样,你三 模拟器负担(不起)哇,我饮酒" blastin "赛事的所有吸烟"的一切,而我全部开放,我 和我的女孩,我们留飞,我们爱留高[桥: ]哇,从6-4 hefers起来铬 enshaw钱makin " playas在哈林不想没问题,我们健在的不断bumpin " ,而我808 收盘的Jumpin "前钩: ]钻石在我的脖子上荻钻石对我的烤钻石在我的脖子上荻钻石对我的烤 [钩: ]我跋扈,我次 e首先女孩尖叫了我的轨道转起来的节拍鼓那个时候我送来 笔所有男孩的小鹿,而公民的权利,我次 五,其中的纹身手臂我跋扈,我次 电子荡妇同感爱恨我的小鸡说的提出要价,我告诉年轻stunna他应该开关 辩论中,我回到了808事业,我博西[太短: ]它的布特时候,她会不会跟我不能 starin停止,她的优秀和她妈的漂亮女孩,不伤害"电磁如果niggas不退缩,你健在 统工作,把你的麦克下来,我知道你的背景是什么麟想要女孩,你gett 在疯了,现在的您是怎么做的吧? 好我的冷淡一个坏的母犬在背部,使"电磁前线( biatch )告诉该男子 你的老板荡妇作出一些噪音, 手如果你的老板荡妇,我不觉得他明白你的老板荡妇得到一些帮助 如果你能导致他失去这不是不退款, 她用现金Mayne先生,在你的奔驰与友人在快车道flossin , 你说"多少钱"我? 约100万美元Playa的,她的跋扈[钩: ]我博西 我的女孩尖叫了我的轨道转起来的节拍鼓,那是我的权利 使所有男孩的小鹿,而公民的权利, 我的一点的纹身手臂我博西 我的荡妇同感爱恨我的小鸡说的提出要价,我告诉年轻stunna他应 开关辩论,我回来了808事业,我博西嗯嗯…… 守望巡逻去.... 嗯嗯…… 守望巡逻去.... 嗯嗯…… 守望巡逻去.... 嗯嗯…… 守望巡逻去.... 嗯嗯…… 守望巡逻去.... 嗯嗯…… 守望巡逻去.... 嗯嗯…… 守望巡逻去.... 嗯嗯…… 守望巡逻去....

ELISA是酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 的简称。它是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。原理如下：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

Melissa Lauren作品列表：(一共 68 个作品)I Wanna Get Face Fucked Innocence: Baby Blue Interracial P.O.V. 2 Jack"s Playground 14 Just Over 18 10 Legal Tender 3 Lewd Conduct 21 Lipstick and Lingerie 2 A Load in Every Hole 10 Mr. Pete Is Unleashed Multiples My Ass Is Haunted One in the Pink and One in the Stink 5 Plastic Penetrations Semen Sippers 3 Service Animals 18 Sexe & internet Sexy Euro Girls 2 Sixpaxk Straight Up the Pipe Sweet Cheeks 5 Teenage Spermaholics 2 Teenage Spermaholics Teens Need Chocolate Cum Ten Little Piggies 4 Toxic Anal Un-Natural Sex 12 Wetter the Better Wild Side XXX Platinum Blondes 2 POV Pervert 3 2 On 1 #17 5 Guy Cream Pie 14 A.n.a.l. 4: Wrong Hole Absolute Ass 2 Anal Addicts 17 Anal Retentive 4 Angel Plush Artcore House of Whores Ass Slaves 2 Ass-troyed Assault That Ass 4 Assed Out 2 ATM City Barely Legal 48 Big Cock Seductions 13 The Black in the Blondes Pussy Whipped 3 Blowjobs Gone Wild Chasing the Big Ones 23 Craving Big Cocks Cum Guzzlers 1 Cumstains 3 Double Her Pleasure Double Stuffed 4 Dripping Wet Pink 5 Dual Invasion Feeding Frenzy 5 Fuck Doll Sandwich Fuck Dolls 3 Fully Loaded Gangland 50 Girlvert 7 Hardcore Models Hi-teen Club 8 Pretty Nina Virgin Surgeon 2 Célibataires, Les

这个ELISA检测基因突变比较意思。刚刚看了几篇文章，跟楼主分享一下。文章：Detection of four b-thalassemia point mutations in Iranians using a PCR-ELISA genotyping system.检测图中四个位置的基因突变。这个检测方法的四要素：a，DIG labed PCR products b，5"biotinylated oligos (probe) c，streptavidin-coated microtiter d，HRP conjugate anti-digoxigenin antibody 。 检测方法的本质是基于：a，allele-specific oligonucleotide hybridization b，biotin-streptavidin system c，Enzyme-linked immunosorbent assayFig 1 - Detection of four b-thalassemia point mutations in Iranians using a PCR-ELISA genotyping system.文章Molecular Detection of Galactosemia Mutations by PCR-ELISA 有step by step的protocol。Fig 2 - Molecular Detection of Galactosemia Mutations by PCR-ELISAPCR-ELISA的原理用于分子诊断方面：TrimGen公司的KRAS Mutation Detection Kit在96孔板里一次能实现7/8个KRAS突变位点的检测。另外基于相同原理的技术还有PPT-ELISA。这是用来筛截短突变的，相关文章见：1，Rapid screen for truncating ATM mutations by PTT-ELISA . 2，An ELISA-based high throughput protein truncation test for inherited breast cancer .Fig 3 - Rapid screen for truncating ATM mutations by PTT-ELISAFig 4 - An ELISA-based high throughput protein truncation test for inherited breast cancer

没什么区别的啊

分类: 音乐 解析: MILKSHAKE Kelis My milk shake brings all the boys to the yard, and they"re like, it"s better than yours,damn right it"s better than yours, I can teach you, but I have to charge My milk shake brings all the boys to the yard, and they"re like, it"s better than yours, damn right it"s better than yours, I can teach you, but I have to charge I can see you want it, the thing that makes me, what the guys go crazy for. They lose their minds, the way I wind, I think it"s time la la-la la la, warm it up. la la-la la la, the boys are waiting la la-la la la, warm it up. la la-la la la, the boys are waiting My milk shake brings all the boys to the yard, and they"re like, it"s better than yours, damn right it"s better than yours, I can teach you, but I have to charge My milk shake brings all the boys to the yard, and they"re like, it"s better than yours, damn right it"s better than yours, I can teach you, but I have to charge I can see you"re on it, you want me to teach thee the techniques that freaks these boys, it can"t be bought, just when things get caught, watch if your *** art, la la-la la la, warm it up, la la-la la la, the boys are waiting, la la-la la la, warm it up, la la-la la la, the boys are waiting, My milk shake brings all the boys to the yard, and they"re like, it"s better than yours, damn right it"s better than yours, I can teach you, but I have to charge My milk shake brings all the boys to the yard, and they"re like, it"s better than yours, damn right it"s better than yours, I can teach you, but I have to charge Once you get involved, everyone will look this way-so, you must maintain your charm, same time maintain your halo, just get the perfect blend, plus what you have within, then next his eyes are squint, then he"s picked up your scent, la la-la la la, warm it up, la la-la la la, the boys are waiting, la la-la la la, warm it up, la la-la la la, the boys are waiting My milk shake brings all the boys to the yard, and they"re like, it"s better than yours, damn right it"s better than yours, I can teach you, but I have to charge. My milk shake brings all the boys to the yard, and they"re like, it"s better than yours, damn right it"s better than yours, I can teach you, but I have to charge. FADE OUT

奶昔我的奶摇把所有的男孩在院子里，和他们一样，它比你的要好，该死的权利它比你的要好，我可以教你，但我要负责！我的奶摇把所有的男孩在院子里，和他们一样，它比你的要好，该死的权利它比你的要好，我可以教你，但我要负责！我知道你想要的话，最让我，什么人发疯了，他们失去了自己的头脑，就是我的风，我认为是时候拉拉- lalala，暖起来，拉拉- lalala，孩子们在等待，拉拉- lalala暖起来，拉拉- lalala，孩子们在等待，我的奶摇把所有的男孩在院子里，和他们一样，它比你的要好，该死的权利它比你的要好，我可以教你，但我要负责！我的奶摇把所有的男孩在院子里，和他们一样，它比你的要好，该死的权利它比你的要好，我可以教你，但我要负责！我可以看到你在上面一样，你要我教这些孩子的技术，怪胎，它不能被收买，只知道小偷被抓住，如果你很聪明的手表拉拉- lalala，暖起来，拉拉- lalala，<a href="http://pop.yinyueabc.com/lyrics_goodnight-nurse_song_milkshake_zh-CN/">Milkshake 歌词<a> <a href="http://www.yinyueabc.com">音乐 ABC<a>孩子们在等待，拉拉- lalala暖起来，拉拉- lalala，孩子们在等待，我的奶摇把所有的男孩在院子里，和他们一样，它比你的要好，该死的权利它比你的要好，我可以教你，但我要负责！我的奶摇把所有的男孩在院子里，和他们一样，它比你的要好，该死的权利它比你的要好，我可以教你，但我要负责！一旦你卷入，每个人都会这样看这么你必须保持你的魅力，同时保持你的光环，刚刚获得完美的融合，加上你所拥有的范围内，然后下一步他的眼睛是眯着眼睛，然后他拿起你的气味，拉拉- lalala，暖起来，拉拉- lalala，孩子们在等待，拉拉- lalala暖起来，拉拉- lalala，孩子们在等待，我的奶摇把所有的男孩在院子里，和他们一样，它比你的要好，该死的权利它比你的要好，我可以教你，但我要负责！我的奶摇把所有的男孩在院子里，和他们一样，它比你的要好，该死的权利它比你的要好，我可以教你，但我要负责！

小Q同学好可爱呦

介词OF没有什么意思,表示：由....组成的。with 介词。表示：和.....在一起。

Semper fidelis: 拉丁文, 翻译成英文就是“Always Faithful"或"Always Loyal". 中文翻译: 【永远忠实】

semper fidelis永远忠诚双语对照词典结果：semper fidelis永远忠诚(美国海军陆战队的座右铭); .很高兴为你解答！如有不懂，请追问。 谢谢！

现在6个月过去了，楼主最后选的哪家的试剂盒？

48t可测42个标本，96T可测94个样本，，上海恒远生物科技有限公司是一家生物高新技术企业，主要从事免疫学、分子生物学和常规生化试剂的研发、销售。公司专业代理美国R&D、Amresco、Sigma、Pharmacia、Abcam等各大品牌高质量试剂盒和生物科研试剂，产品涵盖ELISA试剂盒、生物试剂、抗体、对照品、血清、细胞、培养基、实验耗材等，公司产品几乎涉及所有领域，代表了最高品质。

abcam不错，该品牌质量一直很好啊，毕竟进口elisa试剂盒，质量不会差

deliSpecialBarTenderUltraLite打印一直是之前的文字，可能是运行错误。目前条码打印机市场，很多品牌的条码机厂商都选择与Seagull公司合作，采用Seagull公司最经典的条码设计软件—Bartender条码软件，比如TSC条码打印机、TEC条形码打印机、Datamax标签打印机等，Bartender条码设计软件易学易懂，使用简单方便，颇受条码业内人士以及初学者欢迎。UltraliteBartender条码制作软件在安装使用的时候需要注意两点：第一，在Bartender条码软件安装完成后，第一次运行的时候，会弹出一个选择框，上面有两个选项，一个是仅运行Ultralite版，另一个是运行Bartender软件标准版，这时候应该选择仅运行Ultralite版，才能保证Bartender条码软件正常使用，如果选择了运行标准版，那么自即日起30天时间内，是可以正常使用的，并且能使用Bartender所有的功能，但是30天以后该软件将会过期，过期以后，哪怕把软件卸载重新安装都不行，只有重新安装电脑的操作系统才行。第二就是在设计软件条码标签格式后，第一次点选打印按钮，这时候会弹出一个节目，选择忽略所有字体警告，原因是我们设计条码标签所采用的文字字体大多都是Windows系统自带的字体，而不是条码机自带的字体，如果不忽略字体问题，那么在打印出的标签上，文字字体将会出现乱码、误码等问题。

deli应该是指是得力生产的，star gel 应该指中性笔，14.01是生产日期，0.5是墨迹粗细程度。

歌曲名:By The Sea (Pelleas Et Melisande Op 46 No 2A)歌手:Paavo Berglund专辑:Luonnotar, Op.70/Pohjola S Daughter, Op.49 Etc.Ooh, Mr. Todd! (kiss)I"m so happy! (kiss)I could (kiss)Eat you up, I really could!You know what I"d like to do, Mr. Todd? (kiss)What I dream (kiss)If the business stays as good?Where I"d really like to go,In a year or so?Don"t you want to know?Do you really want to know?By the sea, Mr. Todd, that"s the life I covet,By the sea, Mr. Todd, ooh, I know you"d love it!You and me, Mr. T, we could be aloneIn a house wot we"d almost own,Down by the sea!Anything you say...Wouldn"t that be smashing?Think how snug it"ll be underneath our flannelWhen it"s just you and me and the English Channel!In our cozy retreat kept all neat and tidy,We"ll have chums over ev"ry Friday!By the sea,Don"tcha love the weather?By the sea!We"ll grow old together!By the seaside,Hoo, hoo!By the beautiful sea!It"ll be so quiet,That who"ll come by it,Except a seagullHoo, hoo!We shouldn"t try it,Though, "til it"s legal for two-hoo!But a seaside wedding could be devised,Me rumpled bedding legitimized!Me eyelids"ll flutter,I"ll turn into butter,The moment I mutter I do-hoo!Down By the sea,Married nice and proper!By the sea,Bring along your chopper!To the seaside,Hoo, hoo!By the beautiful sea!http://music.baidu.com/song/2688867

不是 Alizee 么？有个法国女歌手叫这个名字 汉语 艾丽兹 百度上就能看到

ChrisDeAngelisChrisDeAngelis是一名副导演，主要作品有《风城火情》，《绯闻女孩》。外文名：ChrisDeAngelis职业：制作人，副导演/助理导演代表作品：《风城火情》，《绯闻女孩》合作人物：艾米·海克林主要作品电影作品电视剧作品人物关系

AnnaDeAngelisAnnaDeAngelis是一名演员，参演作品有《法比奥拉》。外文名：AnnaDeAngelis职业：演员代表作品：《法比奥拉》合作人物：AlessandroBlasetti

Angel 天使Sarah McLachlan 莎拉麦克劳兰Spend all your time waiting for that second chance 用全部的时间等待第二次机会For a break that would make it OK 因为逃避能使一切更好There"s always some reasons to feel not good enough 总是有理由说感觉不够好And it"s hard at the end of the day 在一日将尽之时觉得难过I need some distraction or a beautiful release 我需要散散心，或是一个美丽的解脱Memories seep from my veins 回忆自我的血管渗出Let me be empty and weightless 让我体内空无一物，了无牵挂And maybe I"ll find some peace tonight 也许今晚我可以得到一些平静In the arms of the angel 在天使的怀里Fly away from here，From this dark, cold hotel room 远离黑暗、阴冷的旅馆房间And the endlessness that you fear 和你惧怕的无穷无尽You are pulled from the wreckage of your silent reverie 你在无声的幻梦残骸中被拉起In the arms of the angel 在天使的怀里May you find some comfort here 愿你能得到安慰So tired of the straight line 厌倦了走直线And everywhere you turn 你转弯的每一个地方There"re vultures and thieves at your back 总有秃鹰和小偷跟在身後The storm keeps on twisting 暴风雨仍肆虐不止You keep on building the lies 你仍在建构谎言That you make up for all that you lack 以弥补你所欠缺的It don"t make no difference, escape one last time 但那於事无补，再逃避一次It"s easier to believe 会使人更容易相信In this sweet madness, oh this glorious sadness 在这甜蜜的疯狂、光荣的忧伤里That brings me to my knees 使我颔首屈膝In the arms of the angel 在天使的怀里Fly away from here 飞离此地Fly away from here 飞离此地From this dark, cold hotel room 远离黑暗、阴冷的旅馆房间And the endlessness that you fear 和你惧怕的无穷无尽You are pulled from the wreckage of your silent reverie 你在无声的幻梦残骸中被拉起In the arms of the angel 在天使的怀里May you find some comfort here 愿你能得到安慰In the arms of the angel 在天使的怀里May you find some comfort here 愿你能得到安慰～END～

小时候对天津站最深的印象就是这幅穹顶。以前真的以为画的是天使什么的，事后才知道是中国那嘎达的事。估计人家应该是无意看到过 也没闹清楚以为是他们自己的 所以就照抄过去了

LuigiDeAngelisLuigiDeAngelis，演员，主要作品《血之芬芳》。外文名：LuigiDeAngelis职业：演员代表作品：《血之芬芳》合作人物：马里奥·玛通电影作品

歌名：Angelis歌手：AngelisSpend all your time waitingFor that second chanceFor a break that would make it okayThere"s always some reasonTo feel not good enoughAnd it"s hard at the end of the dayI need some distractionOh beautiful releaseMemories seep from my veinsAnd may be emptyOh and weightless and maybeI"ll find some peace tonightIn the arms of the angelFly away from hereFrom this dark cold hotel roomAnd the endlessness that you fearYou are pulled from the wreckageOf your silent reverieYou"re in the arms of the angelMay you find some comfort hereSo tired of the straight lineAnd everywhere you turnCause vultures and thieves at your backThe storm keeps on twistingKeep on buliding the liesThat you make up for all that you lackIt don"t make no differenceEscape one last timeIt"s easier to believeIn this sweet madnessOh, this glorious sadnessThat brings me to my knessIn the arms of the angelFly away from hereFrom this dark cold hotel roomAnd the endlessness that you fearYou are pulled from the wreckageOf your silent reverieYou"re in the arms of the angelMay you find some comfort hereYou"re in the arms of the angelMay you find some comfort herehttp://music.baidu.com/song/2146026