首先，选取不同物种的Protein数据集：Arabidopsis_thaliana.fa；Citrus_grandis.fa；Dimocarpus_longan.fa；Durio_zibethinus.fa；Prunus_persica.fa； Vitis_vinifera.fa；Citrus_clementina.fa；Citrus_sinensis.fa；Diospyros_oleifera.fa；Malus_domestica.fa；Oryza_sativa.fa；Pyrus_communis.fa 然后进行数据处理，去冗余，只保留最长转录本，去除可变剪切： python3 removeRedundantProteins.py -i input.fa -o output.fa removeRedundantProteins.py 将处理好的数据置于一个文件夹中“Dataset” OrthoFinder这个软件，之前有一篇文章已经介绍过了，这里就不在赘述，这个软件安装十分友好，直接conda安装即可； nohup orthofinder -f Dataset -M msa -S diamond -T iqtree -t 24 -a 24 2> orthofinder.log & orthofinder参数详情： -t 并行序列搜索线程数（默认= 16） -a 并行分析线程数（默认值= 1） -M 基因树推断方法。可选：dendroblast和msa（默认= dendroblast） -S 序列搜索程序（默认= blast）选项：blast，mmseqs,，blast_gz，diamond（推荐使用diamond，比对速度很给力） -A 多序列联配方式，需要添加参数-M msa时才有效；（默认= mafft）可选择：muscle，mafft -T 建树方法，需要添加参数-M msa时才有效，（默认 = fasttree）可选：iqtree，raxml-ng，fasttree，raxml -s <文件> 可指定特定的根物种树 -I 设定MCL的通胀参数（默认 = 1.5） -x Info用于以othoXML格式输出结果 -p <dir>将临时pickle文件写入到<dir> -l 只执行单向序列搜索 -n 名称以附加到结果目录 -h 打印帮助文本 如果只需要查找直系同源基因，只需接“-f” 参数即可；此步也可建树，采用默认的建树方法fasttree，为无根树。 nohup orthofinder -f Dataset & 如果添加-M msa -T iqtree设定制定参数，可按照设定的参数使用最大似然法构建有根的物种进化树，构建的树为STAG树。 nohup orthofinder -f Dataset -M msa -S diamond -T iqtree -t 24 -a 24 2> orthofinder.log & 关于构建系统进化树，有很多种做法，常见的有利用物种全部的蛋白序列，构建STAG物种树；也有使用单拷贝直系同源基因构建的物种进化树，关于这一点，OrthoFinder查找同源基因，可以输出直系单拷贝同源基因的序列结果，后续也可使用其他构树软件及算法进行进化树构建。关于建树方法，则有距离矩阵法、最大简约法、最大似然法以及贝叶斯；当然目前主流采用的基本为最大似然法和贝叶斯，其中贝叶斯算法计算量巨大，耗时最久，其构建的树也认为最为“逼真”，但文章中使用较多的还是最大似然法，其耗时也需蛮久。 OrthoFinder输出的结果会在OrthoFinder文件夹下面的以日期命名的文件夹中，如：~/OrthoFinder/Results_May08其中，我们可以用Orthogroups.GeneCount.tsv来作为CAFE的输入文件，分析基因家族的扩张与收缩；使用SpeciesTree_rooted.txt作为推断的物种树，并使用r8s，从中提取超度量树（ultrametric tree）即时间树； python cafetutorial_prep_r8s.py -i SpeciesTree_rooted.txt -o r8s_ctl_file.txt -s 6650255 -p "Oryza_sativa,Arabidopsis_thaliana" -c "152" 参数： -i path_tree_file: path to .txt file containing tree in NEWICK format -s n_sites: number of sites in alignment that was used to infer species tree -p list_of_spp_tuples: list of tuples (each tuple being two species IDs whose mrca"s age we are constraining; e.g., [("ENSG00","ENSPTR"),("ENSFCA","ENSECA")] -c list_of_spp_cal_points: list of flats, one for each tuple in list_of_spp_tuples (e.g., [6.4,80]) -s 即用于推断物种树的比对序列碱基数目； -p 已知物种树中的一对物种； -c 已知一对物种的分化年限： 可在 timetree 网站查询：为152 myaconda install cafe cafetutorial_clade_and_size_filter.py vim cafetutorial_run.sh tree即为r8s提取的超度量树； python cafetutorial_report_analysis.py -i reports/report_run.cafe -o reports/summary_run summary_run_node.txt：统计每个节点中扩张，收缩的基因家族数目； summary_run_fams.txt：具体发生变化的基因家族 python3 /home/Tools/CAFE_fig/CAFE_fig.py resultfile.cafe -pb 0.05 -pf 0.05 --dump test/ -g svg --count_all_expansions 输出svg格式的文件，可导入AI编辑美化； CAFE_fig运行报错：（module "ete3" has no attribute "TreeStyle"） 报错解决： vim /home/Tools/CAFE_fig/CAFE_fig.py 程序还在运行，后续贴出结果图。 OrthoFinder timetree http://www.chenlianfu.com/?tag=genomecomparison https://www.jianshu.com/p/146093c91e2b r8s 【OrthoFinder】 Emms, D.M., Kelly, S. OrthoFinder: solving fundamental biases in whole genome comparisons dramatically improves orthogroup inference accuracy. Genome Biol 16, 157 (2015) ( https://doi.org/10.1186/s13059-015-0721-2 ) Emms, D.M., Kelly, S. OrthoFinder: phylogenetic orthology inference for comparative genomics. Genome Biol 20, 238 (2019) https://doi.org/10.1186/s13059-019-1832-y ) 【CAFE v.4.2.1】 Han, M. V., Thomas, G. W. C., Lugo-Martinez, J., and Hahn, M. W. Estimating gene gain and loss rates in the presence of error in genome assembly and annotation using CAFE 3. Molecular Biology and Evolution 30, 8 (2013) 【iqtree v. 1.6.12】 Lam-Tung Nguyen, Heiko A. Schmidt, Arndt von Haeseler, and Bui Quang Minh (2015) IQ-TREE: A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum likelihood phylogenies. Mol Biol Evol, 32:268-274. https://doi.org/10.1093/molbev/msu300 【modelFinder】 Subha Kalyaanamoorthy, Bui Quang Minh, Thomas KF Wong, Arndt von Haeseler, and Lars S Jermiin (2017) ModelFinder: Fast model selection for accurate phylogenetic estimates. Nature Methods, 14:587–589. https://doi.org/10.1038/nmeth.4285 【R8s v. 1.81】 Sanderson M J. R8s: inferring absolute rates of molecular evolution and divergence times in the absence of a molecular clock. Bioinformatics, 2003, 19(2): 301-302. 【STAG tree】 Emms D.M. & Kelly S. STAG: Species Tree Inference from All Genes (2018), bioRxiv https://doi.org/10.1101/267914 直系同源低拷贝核基因（orthologous low-copy nuclear genes, LCN）：在进化过程中，新基因通常来自事先存在的基因，新基因的功能从先前基因的功能进化而来。新基因的原材料来自基因组区域的重复，这种重复可包括一个或多个基因。作为物种形成的伴随事件而被重复，并继续保持相同功能的基因，称为直系同源基因（orthologous）。新的基因功能可由在单个物种的基因组中发生的重复引起的。在一个基因组内部的重复导致旁系同源基因（paralogous gene）。 最大似然法（maximum likelihood method）：使用概率模型，寻找能够以较高概率产生观察数据的系统发生树。 外群的选择：大多数的种系发生重建方法会产生无根树，但是观察树的拓扑结构无法识别树根应在哪一分支上。实际上，对于要证实哪一个分类单元的分支先于其他的分类单元，树根必须确定。在无根树中设定一个根，最简单的方法是在数据集中增加一个外群（outgroup）。外群是一种分类操作单元，且有外部信息表明外群在所有分类群之前就已分化。研究演化历史，一般选择比目标序列具有较早进化历史的序列作为外类群。 Bootstrap support: bootstrap是统计学上一种非参数统计方法，通过有放回的随机抽样，构建分类回归树。Jackknife与bootstrap类似，只是每次抽样时会去除几个样本，像小刀一样切去一部分。所谓bootstrap法就是从整个序列的碱基（氨基酸）中任意选取一半，剩下的一半序列随机补齐组成一个新的序列。这样，一个序列就可以变成许多序列，一个序列组也就可以变成许多个序列组。根据某种算法（距离矩阵法、最大简约法、最大似然法），每个多序列组都可以生成一个进化树。将生成的许多进化树进行比较，按照多数规则（majority-rule）就会得到一个最“逼真”的进化树。
