SnapGene软件教程之分子克隆功能&技术原理

说明书上应该有写，一般就是按照说明书上的浓度溶解引物，使用的时候稀释10倍，反正达到它的终浓度就可以了

在过去的几十年里,分子生物学家已经开发许多可以用来更快地构建目的DNA序列结构的技术来简化和规范克隆过程。 你熟悉这些克隆技术吗?下面我们来看看这些技术的特点。 1, 限制性酶切与连接法 长期以来，限制酶切与连接法被认为是一种传统的克隆方法。这个方法便宜灵活，可以分为两步过程：酶切和连接。限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA片段上并切割双链DNA。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5"-磷酸和3"-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中，最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。这个方法原理较简单，我不做过多介绍。 2, Gateway 克隆技术 Gateway克隆发明于九十年代末，由walhout[2]等提出，一种通用性的克隆方法，与传统克隆方法相比，Gateway技术的优点是可以不必考虑目的DNA 是否有合适的酶切位点，也不必进行繁琐而费时费力的酶切和连接反应，就可以按确定的方向和读码框快速而准确地将目的基因克隆到各种与Gateway技术兼容的目的载体上。 它利用λ噬菌体与大肠杆菌染色体之间发生的位点特异性的重组整合与切除反应，即LR和BP。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR 反应是一个attR入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或多个目的载体。重组位点attB、attP、attL和attR 由噬菌体λ和大肠杆菌编码的酶合剂特异识别。 Invitrogen公司开发了包括运用于原核、酵母、昆虫和哺乳动物等不同宿主的表达载体，大大提高了Gateway技术的适用性。Gateway技术已被广泛用于高通量载体的构建 3, Gibson Assembly 传统的限制性内切酶克隆技术，会在两个片段的结合位置上形成一道“疤”或“缝”，这种瑕疵可能会对DNA片段的行为产生微妙的影响。这一点特别令合成生物学家头疼，因为他们常常要将启动子和终止子这样的DNA片段转变为可预测的独立元件。Now我给大家介绍一下Gibson Assembly，一种无缝克隆方法。 Gibson组装最早由Daniel Gibson博士和他的同事J. Craig Venter在2009年提出[3]。Gibson组装非常适合用于拼接多个线性DNA片段，当然也适合将目的DNA插入载体中。如下图所示，首先，需要在DNA片段的末端加上同源片段（通过PCR法加上）；然后，将这些DNA片段和一种master mix（含有三种酶）混合孵育一个小时就可以了。这种master mix含有三种不同类型的酶：1）一种外切酶，从5"端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合。2）一种聚合酶，用于修补gap。3）一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。 这个系统最厉害的是，这三种酶都可以在同一个温度下很好的发挥功能，所以整个反应在50摄氏度条件下一个小时就可以完成。一小时后，样品可以直接用于转化。当然Gibson Assembly也有缺陷，这一过程并没有生成限制性酶切位点，因而不方便将拼接片段转移到另一个载体上。建议最好是事先设计好限制性位点。需要注意的是，如果一次性组装超过5个片段，成功率会大大降低。 4, Golden Gate 拼装法 Golden Gate 拼装法主要是依赖于一种II型限制性内切酶(ⅡS 型酶，如 BsaⅠ和 AarⅠ)，这种酶能够在其DNA 识别处的相邻位置进行剪切[4]。如果人为设计识别位点不同的相邻序列，就可利用同种限制酶产生不同的粘性末端，从而一次组装多个片段，这克服了传统多片段组装时限制酶种类的限制。 具体到原理：一般的内切酶分为三种，通常用的是2类的酶，识别特定的回文序列，并从中切开。而golden gate一般用的是3类酶，一般以bsmb 1，Bsa1, Bbs1这三种酶，识别特定的序列，并在特定序列以后隔几个任意的碱基切开，这样子就可以克服2类酶必须要回文序列才能用的缺点，实现片段的连接。 另外，要说的是连接部分，传统的连接酶是T4用的比较多，T4可以连接黏性末端跟平末端，而golden gate里用的是T7，它的特点是只能实现连接黏性末端。因为T7的这一特性，所以在连接的时候可以把片段跟切好的载体混到一种特殊的buffer里，在这里内切酶跟T7都可以保持比较高的活性，通过温度的调节，实现克隆的构建。因为用的是T7，所以不用担心PCR片段自连降低克隆效率，又因为是用的三类酶，可以通过黏性末端的设计，可以一种酶切多个片段，又不用担心这几个片段之间的乱连，来达到分子克隆的目的[5]。 5, TOPO克隆(TA克隆) TOPO克隆使用DNA拓扑异构酶I，该酶同时具有限制酶和连接酶的特性。这种酶在复制期间切割并重新连接DNA，整个克隆过程可以在室温下完成，且仅需5分钟。TOPO克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。 Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA 拓扑异构酶I。 pCR-TOPO 载体也是一种 T 载体，只是在其 3"末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 Ⅰ ，当带 3′ 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 Ⅰ 就将该缺口连接起来。 自沃森，克里克在1953年发现DNA双螺旋结构不过60余年，如今的DNA克隆技术却已发展到如此的程度。合成生物学正处在高速发展时期，这些进步技术的进步必将推动生物革命浪潮的到来。你都掌握了吗？ Reference [1] 李华琴,林陈水,张文倩. 不依赖连接反应的高通量克隆方法. 氨基酸和生物资源.2013,35(4):43-46 [2] Walhout A J M, Temple G F, Brasch M A, et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes[J]. Methods in enzymology, 2000, 328: 575-IN7. [3] Gibson, D.G., et al. (2009) Nat. Methods 6, 343-345. [4] Morbitzer R, Elsaesser J, Hausner J, et al. Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning[J]. Nucleic acids research, 2011, 39(13): 5790-5799. [5] https://www.zhihu.com/question/49568914/answer/116646832

首先要强调的是，无缝克隆有两个主要的流派：Gibson assembly和Golden Gate assembly。由于Golden Gate assembly依赖于Type IIS限制性DNA内切酶（如BsaI，BbsI等），一旦载体不携带相应的识别序列，这种方法就走不通了。而假设通过PCR引入Type IIS内切酶识别序列，那便不是真正意义上的“无缝”了。因此本文所提的“无缝克隆”，特指Gibson assembly流，不涉及任何Golden Gate及其他流派。目前，无缝克隆比较著名的商品化名字有NEB家的Gibson Assembly和NEBuilder HiFi DNA Assembly，Clontech家的In-Fusion，以及Invitrogen家的GeneArt等。但无论叫什么名字，其基本原理都和早期的Gibson assembly的是一样的。与传统的双酶切克隆一般，无缝克隆同样需要依赖于dsDNA的黏性末端进行互补配对，并利用DNA连接酶催化形成磷酸二酯键修复缺口（nick）。但是，无缝克隆并不使用“内切酶”来制造黏性末端，而是通过“外切酶”来产生的。（Tips 1：“内切酶”是在核酸链内部进行“一刀两断”剪切的酶，而“外切酶”是在核酸链的末端、即外部进行“逐个碱基”剪切的酶）在无缝克隆中使用的外切酶是T5核酸外切酶，它能沿着5"→3"方向，降解dsDNA，从而产生黏性末端。（Tips 2：T5外切酶同时具有ssDNA外切酶活性，但并不降解超螺旋dsDNA。

细胞保存一般都是逐步冷却法保存在液氮中！至于脂肪细胞是不是特例，你可能要看看你研究相关的文献中，比较准确一点！trizol试剂盒的话，现在市面上公认的肯定是invitrogen公司的最好，不过价格偏贵，现在takara的trizol也抢占不少市场！价格在促销的时候还是很有优势！

培养液厚度为0.1mm稀释倍数为1:1000。培养液,滴于盖玻片边缘,让培养液自行渗入到计数板小方格内,显微观察计数一个小方格内的菌种数,已知小方格的培养液厚度为0.1mm,计算出培养液。培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 1000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。紫外线照台30min。2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4生长，配制好后PH值会升高0.2～0.3，故配时调PH至7.0左右）。5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水 溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水 溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。3.1.2 PBS（平衡盐溶液）的配制NaCl 8gKCl 0.2g ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000mlNa2HPO4*H2O 1.56gKH2PO4 0.2g（1） 无需调PH值，其成分溶解后PH为7.4，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!）（2） Na2HPO4*H2O 1.56g 则Na2HPO4*12 H2O需3.4888g（3） 如欲配制500ml，以上成分减半即可3.1.3 0.25%胰蛋白酶的配制胰蛋白酶粉 2.5gEDTA（乙二胺四乙酸二钠） 0.3gNaCl 8.0gKCl 0.4g ` +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000MLNaHCO3 0.5gGlucose(葡萄糖) 1.0g酚红 0.06g（1）配出来的PH值为7.6，在PH值7.6～7.8范围内，故不需调PH值。（2）用0.22um的除菌滤膜过滤分装，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存备用。4℃可连续使用1月左右。（3）用于分装的玻璃瓶必须事先高压灭菌！而烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。（4）如欲配制500ml，以上成分减半即可3.2 细胞复苏1、准备：紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基5ml加入试管中（一滴约为50ul）。3、戴手套，从-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（慢冻快融）4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管，800rpm离心2min（用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS浓度为20％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培养瓶放入CO2培养箱。（注意：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。）6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。

非编码RNA（Non-coding RNA）是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA 和microRNA 等多种已知功能的 RNA，还包括未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA 水平上就能行使各自的生物学功能了。非编码RNA 从长度上来划分可以分为3类：小于50 nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50 nt到500 nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA 等等；大于500 nt，包括长的mRNA-like 的非编码RNA，长的不带polyA 尾巴的非编码RNA等等。 基本介绍 中文名 ：非编码RNA 外文名 ：Non-coding RNA 属性 ：RNA 包括 ：rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA 基因概况,种类介绍,技术进展,展望, 基因概况 细胞中含量最高的是rRNA 和tRNA 这两种常见的非编码RNA。广义上的非编码RNA是包括这两种RNA的，研究的比较透彻。狭义上的非编码RNA往往不包括rRNA 和tRNA，因此在这里就不做介绍了。这里介绍的非编码RNA种类，是在狭义上的非编码RNA 的定义，即，不包括mRNA，tRNA 和rRNA 的其他RNA分子。在此主要介绍一下表达量相对比较高的snRNA、snoRNA 和作为研究热点的microRNA。 种类介绍 snRNA snRNA 是 *** all nuclear RNA的简称，也称作小核RNA。其功能是与蛋白因子结合形成小核核糖蛋白颗粒（ *** all nuclear ribonucleo-protein particle，简称snRNPs），行使剪接mRNA的功能。snRNA 主要包括5 种：U1，U2，U4，U5 和U6。存在于所有snRNP 中的蛋白叫做通用蛋白，也称做 *** 蛋白。通用蛋白和snRNA的结合位点已经研究清楚了。除U6 外，Sm蛋白可以结合到所有的其他snRNA 的保守序列AAU4-5GGA上，这段序列被称为Sm蛋白的结合位点，这也可以作为判断一个RNA是否是snRNA 的一个特征。 snoRNA snoRNA 是最早在核仁发现的小RNA，称作小核仁RNA，最初发现它们的生物功能是用来修饰rRNA的。大多数小核仁RNA可以分为两类。一类是C Dbox snoRNA，这一类snoRNA是对RNA的碱基进行甲基化修饰的。其特点是含有4 个Box：Box C、Box D、BoxC"和BoxD"。事实上对C D box snoRNA 的预测已经有很多已经发表的软体，比如说snoscan。另一类是H/ACA box，这一类snoRNA 对RNA的碱基进行甲尿嘧啶化修饰。其特点是形成一个双stem，中间加一个loop 区，中间的loop 区中有一个boxH。而在尾部的tail 有个boxACA。由于boxH 和boxACA 的一级序列特征的界定比较松。比如BoxH 是ANANNA，很多A rich 的区域都能满足这个特征。而boxACA 是ACANNN，只有3 个碱基的明确信息。所以单单从一级序列特征上判断一个RNA 是否为snoRNA 是比较容易出错的。好在，HACA snoRNA 的二级结构是非常明确的。所以，用二级结构结合尾部的Box ACA的特征，联合判断一个RNA是否为HACA snoRNA 是切实可行的。 microRNA MicroRNA 是一类21~23 nt 的小RNA，其前体大概是70~100 nt 左右，形成标准的stem 结构，加工后成为21~23 nt 的单链RNA。microRNA 的作用机制是与mRNA 互补，让mRNA 沉默或者降解。现在流行的RNAi 技术就是利用了细胞体内的这个机制，在体外人工加入类似microRNA 的 *** allRNA 来沉默对应的mRNA circularRNA 环状RNA与已知的线状RNA不同，形成一个共价闭合的连续循环。在环状RNA中，RNA分子的3"和5"末端通常是连线在一起的。这种特性赋予了环状RNA许多特性，其中许多特性是最近才被识别出来的。 许多环状RNA来源于蛋白质编码基因，但是细胞中产生的环状RNA还没有被证明可以编码蛋白质。因此它们被归类为非编码RNA。最近，一些环状RNA显示出了作为基因调节器的潜力。像许多其他非编码亚型一样，大多数环状RNA的生物学功能尚不清楚。 由于环状RNA没有5"或3"端，它们对核外酶介导的降解具有抵抗性，并且可能比细胞中的大多数线性RNA更稳定。 技术进展 非编码RNA的工作主要分为两个方面，一是大规模的鉴定新的非编码RNA，二是通过各种方法研究非编码RNA的功能。大规模鉴定非编码RNA的方法可以分为用理论预测和实验发现两种。前者主要借助计算机，从已有的非编码RNA中提取特征信息，然后以特征信息做全基因组搜寻，比较成功的预测软体有：预测snoRNA 的snoScan和snoGPS，预测tRNA 的tRNAScan，预测microRNA 的mirScan，另外如RNAz，RNAmotif 等也都是很好的非编码RNA预测工具。理论预测方法简便快捷，但是最终的确定还是依赖于实验，因此理论预测与实验验证通常是相辅相成的。 很多实验有鉴定非编码RNA的方法，这些方法被称作“RNomics”。RNomics 的核心在于构建非编码RNA 的cDNA 文库，根据长度不同，非编码RNA的cDNA文库可以主要分为小于50 nt，50~500 nt以及大于500 nt 3 种，另外对于大于500 nt 的还可以分为带polyA 尾巴和不带polyA 尾巴这两种。Ambion 公司、Invitrogen 公司以及Qiagen 公司都推出了可以用来构建非编码RNA 的cDNA 文库的试剂盒。得到非编码RNA的cDNA文库以后，有多种方法可以用来鉴定文库中的非编码RNA。比较传统的是克隆测序，这种方法工作量很大，且对低丰度的非编码RNA 检测效率较差，但是这种方法操作流程比较简单，且对仪器设备要求不高，成本相对较低，因此仍被广泛使用。随着测序技术的发展，得到非编码RNA的cDNA 文库以后，不用克隆就可以直接测序，这种方法简单快捷，工作量小，可以检测到大量低丰度的非编码RNA，但是对仪器要求较高，成本也很高，使用的测序仪主要有454 和solexa 两种。随着技术的改进和成本的降低，这种直接测序的方法将成为主流。 另外一种广泛使用的非编码RNA 检测技术，是2000 年以后发展起来的全基因组tiling 晶片技术，这种技术的核心在于构建高密度的覆盖全基因组的晶片，生产这种晶片的主要有affymetrix 公司和agilent 公司，这种技术的优点在于不用构建cDNA 文库，更不用做克隆，只要有分离纯化的非编码RNA就可以检测，操作简单，成本很低，可以检测到大量低丰度的非编码RNA，这种方法的缺点在于不能准确的确定非编码RNA的转录起始终止位点，也很难区分剪下加工产物。非编码RNA的功能研究主要集中在microRNA 和siRNA，主要原因在于这两种小RNA的功能作用方式，都是通过同目标基因进行碱基配对，寻找这些小RNA的靶点相对来讲比较容易；而对于长的非编码RNA来讲，它们往往要形成复杂的二级甚至是三级结构，预测其靶点比较困难。随着研究的深入，也有为数众多的长的非编码RNA的功能被鉴定出来，例如Xist 和Khps1 就属于长的带polyA 尾巴的非编码RNA。 展望 大量研究数据表明，高等生物多达一半以上的DNA转录为RNA，其中绝大多数为ncRNA。甚至，有的科学家预言ncRNA在生物发育的过程中，有着不亚于蛋白质的重要作用。但是，今天对整个ncRNA的世界却了解甚少，主要任务是发现更多的ncRNA及其生物功能。毫无疑问，要了解ncRNA 的生物功能，也就是要弄清每个细胞类型在特定的时间内所有蛋白和所有ncRNAs 的功能以及它们之间、它们和DNA之间的相互作用。这一研究的道路还很长，远比基因组计画更为艰巨。因此，要彻底弄清ncRNA 的调控网路，将是揭示生命奥秘的最终突破。

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可以用TRIZOL或者plant trizol，从植物组织中提取RNA需要克服几个困难：1.破碎和裂解植物细胞壁。2.抑制rna酶3.去除植物多糖和多酚。树脂 淀粉和纤维材料。4.去除许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA分离。除了干扰RNA分离之外，植物多糖和多酚及次级代谢产物还能明显抑制下游RNA反应如转录和PCR.

1 Thermo Electron US 2 Fisher Scientific US 3 Applied Biosystems US 4 Danaher US 5 VWR International US 6 Agilent Technologies US7 Waters US 8 PerkinElmer US 10 Becton Dickinson US 11 Varian US 13 Invitrogen US 14 GE Healthcare BioScience US 15 Smiths Detection US

河北博海生物工程开发有限公司是1994-09-29在河北省石家庄市注册成立的有限责任公司(自然人投资或控股)，注册地址位于河北省石家庄市高新区长江大道319号。河北博海生物工程开发有限公司的统一社会信用代码/注册号是91130100601901066D，企业法人李彬，目前企业处于开业状态。河北博海生物工程开发有限公司的经营范围是：生物和基因遗传工程技术的研究、开发及技术咨询（国家限制项目及产品除外）；医疗器械、化工产品（不含：危险化学品及其它前置性行政许可项目）、实验室设备、电子产品、通讯设备（无线电发射装置、卫星地面接收设施除外）的销售；自营和代理各类商品和技术的进出口业务；化学试剂、医疗器械的生产；房屋租赁。（依法须经批准的项目，经相关部门批准后方可开展经营活动）。在河北省，相近经营范围的公司总注册资本为420275万元，主要资本集中在100-1000万和1000-5000万规模的企业中，共1061家。本省范围内，当前企业的注册资本属于良好。河北博海生物工程开发有限公司对外投资4家公司，具有1处分支机构。通过百度企业信用查看河北博海生物工程开发有限公司更多信息和资讯。

严格来说Trizol是Life Technologies（之前的Invitrogen）（买下的Ambion公司）的注册商标，所以Takara是不会有Trizol的。Takara大连的RNA提取产品的商品名为RNAiso，可以去其官方网站以RNAiso为关键词作产品名搜索。

gibco公司创立于美国纽约州的大岛(Grand Island) ，后合并到Invitrogen生命技术有限公司该公司现在的总部在美国加利福尼亚州

1 纽约（New York） 纽约是世界特大城市之一，美国第一大城和最大海港，是美国最大的金融、贸易和文化中心。 位於美国东北部海岸哈得逊河口。 纽约是美国大公司的集中地，大银行、保险公司、律师事务所林立。世界各国大企业大多在纽约设有机构。联合国总部也在纽约。纽约证劵交易所、纳斯达克和美国证劵交易所集中了全国80％以上的证劵交易。纽约作为美国经济中心与商品流通中心，商品上市量居全国之首。大纽约地区对外贸易总值约占全国的40％， 沿海贸易额居全国第一位。 纽约工业也十分发达，是仅次於芝加哥、洛杉矶的美国第三大工业中心。它是世界服装中心、它占有全国六分之一的印刷能力与三分之一的出版物、化妆品均居全国首位；机器制造，石油加工和食品加工等也占有重要地位。 纽约是全美运输业最发达的地区，市内多数河流都通大西洋， 港口规模巨大，设备优良，而且宽、深、潮差小，终年不冻。货运量排名全美第二（次於新奥尔良）， 一 2 洛杉矶（Los Angeles） 洛杉矶是美国的第二大城市和重要海港。位於加利福尼亚州西南部、洛杉矶河边。 洛杉矶是美国西部工商业第一大城，石油加工、宇航、化学、机械工业相当发达，飞机制造业尤其突出，美国三大飞机制造公司中的洛克希德与道格拉斯公司设在该市。轻工业以服装、食品、印刷为主。罐头食品、女式服装与运动服生产驰名於世。 在太平洋沿岸各港口中， 洛杉矶远洋货轮的吞吐量占第一位。 洛杉矶也是美国西部的旅游中心，迪士尼、好莱坞闻名世界。 3 芝加哥（Chicago） 芝加哥是美国第三大城市和美国最大的制造业中心，位於密歇根湖的西南岸、 芝加哥河河口，处於美国东部工业区和西部农牧区的中心位置。它是美国最重要的航空中心和最大的铁路枢纽，并是五大湖地区重要湖港。以芝加哥为中心的500公里范围内，集中了全美百分之二十的人口。 芝加哥工业构成中以重工业为主，轻工业也很发达，它是全国最大的钢铁与肉类加工业基地。运输机械、石油加工、电机、印刷等也居领先地位。 芝加哥是美国重要的商业、金融中心之一，批发零售业在国内名列前茅，并有全国最大的谷物、牲畜市场。 4 休士顿（Houston）--石油城 休士顿是美国第四大城市，南方最大的城市，世界著名的新兴石油化工城， 是仅次於和新奥尔良和纽约的美国第三大港口。位於德克萨斯州东南部，距墨西哥湾80公里。 休士顿有"世界石油之都"的称号。是美国最大的炼油中心，美国的乙烯、合成橡胶等石油化工产品大部分都由这裏生产。此外，它还是美国西南部的铁路枢纽和航空港。休士顿港系人工港，是全国最大的石油与小麦输出港。进出口贸易居全国第二位。 休士顿也是美国重要的金融中心，商业批发与零售居南方各城之首。 休士顿是美国的宇航中心，美国国家航空和航天局在此设有航太中心。 5 费城（Philadelphia） 费城是美国第五大城市，正式译名为"费拉德尔菲亚"，位於美国东北部宾夕法尼亚州的特拉华河口。 费城是美国历史名城，也是美国主要的经济、交通、文化中心之一。费城重化工业发达，为美国东岸主要炼油中心和钢铁、造船基地。纺织、 电机、机车车辆、化工等工业也很发达。费城是美国东部地区重要金融中心，美国第一家银行与证券交易所即诞生於此。 费城是世界上最大的淡水港之一，并设有面积约29公顷的自由贸易区。费城还是全国重要的铁路枢纽。 6 底特律（Detroit）--汽车城 底特律是美国北部的大城市，是五大湖区仅次於芝加哥的第二大工业城市，素有"汽车城"之称。它位於密歇根州东南部，圣克雷尔湖和伊利湖之间，是美国大湖区重要港口。 底特律依靠附近有铁矿砂和炼钢厂的有利条件， 逐步形成庞大的汽车工业，作为"美国汽车之都"，汽车产量占全国四分之一。市内有福特、通用、克莱斯勒和阿美利加四家美国最大的汽车制造公司总部及所属企业。底特律有众多与汽车制造有关的研究机构与大学，从而成是世界最大的汽车工业中心。此外，底特律的钢铁、飞机、 机器制造、化工、五金、医药等工业也很发达 7 三藩市（San francisco） 三藩市音译为"圣法兰西斯科"，或称"三藩市"，位於加州西北部，美国西海岸中点。 它是美国西部金融中心和太平洋沿岸仅次於洛杉矶的第二大港口，是美国西部人口密度最大的城市。三藩市经济以服务业、商业与金融业为主，包括矽谷在内的三藩市湾区是世界著名的高技术产业中心。 三藩市的工业比较发达，主要有飞机、火箭部件、金属加工、造船、仪表、电子设备、食品、石油加工、化学、印刷等部门。三藩市是美国横贯大陆铁路的终点之一。三藩市港口自然条件优越，内宽口窄，水深， 潮差小，港口设施优良，为美国对远东贸易的重要基地，素有“西海岸门户”之称。主要出口石油制品、食品、金属制品等， 进口原油、咖啡、茶叶、羊毛、橡胶等 8 波士顿（Boston） 波士顿是麻萨诸塞州首府，美国东北海岸的大城市和最古老的海港之一。波士顿港湾优良，港口距欧洲较美国东海岸其他城市近，欧美之间长期的海上贸易促进了波士顿城市的发展。 波士顿经济以银行、保险、投资管理、商业、金融为主。波士顿工业发达，主要有电子电脑、电子设备、造船、塑胶、化学。传统工业如纺织、皮革、制鞋、服装、食品、印刷出版等仍占重要位置 。它是新英格兰地区批发与零售中心，还是全国重要的羊毛贸易市场。 波士顿有世界著名学府哈佛大学与麻省理工学院。 9 匹兹堡（Pittsburgh）--美国钢都 匹兹堡是美国的钢铁中心，也是重要的内河货运中心，位於美国东部宾夕法尼亚州的西部。匹兹堡附近有优质大媒地，通过大湖和内河廉价运入苏必利尔的铁矿石，使其有发展钢铁工业优越条件，其钢产量约占全美钢产量的一半。 该市还是世界最大的铝、钢板、炼钢设备、窗玻璃、 空气制动器和安全设备的制造中心。匹兹堡也是许多美国大工业公司总部的所在地，著名的有美国钢铁公司、海湾石油公司、罗克韦尔国际公司、威斯汀豪斯公司等。′ 10 亚特兰大（Atlanta） 亚特兰大是美国东南部的最大城市，乔治亚州首府，位於该州西北部。它是美国东南部商业、运输业与工业中心。传统的棉纺织业和食品工业仍占重要地位，前者因它近棉花产区，后者以其是可口可乐总部所在地而名闻世界。重工业有飞机、汽车制造、机械、钢铁、化工等。航空工业发展很快，洛克希德飞机公司总部设於该市。 亚特兰大是美国重要交通枢纽，6条州际公路穿过市区，7条铁路汇集於此，环城公路长100公里，它也是重要的国际航空货运站。亚特兰大作为美国主要会议中心之一，拥有国内规模最大的会议设施。1996年第26届世界奥运会曾在亚特兰大举行。

invitrogen公司的一个TA克隆的质粒载体系列。看这里：http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf

保存在冻存液里的话可以放很久。。

显微镜观察增殖的一群细胞的核或染体情况

在做荧光定量PCR的时候用试剂盒比较方便。我们实验室之前用的BIOG荧光定量PCR试剂盒效果挺好的，反应很灵敏。最后实验做下来挺成功的。

你用过invitrogen公司的产品就知道他们公司一般的产品都是，RNase free的，也就是，处理过RNA酶的水。free就是处理过的，不存在的意思。后者RNAase-free Water 主要是在提取RNA中使用，像我们用的DEPC水，就是这种。知道这是什么，相信你自己也明白，那些时候可以相互代替，那些时候不可以了吧

说明不是引物之间形成二聚体,而是第一对引物的设计有问题（特异性很差）.如果一定要扩增那个区,建议引物的位置向两边放一放.如果你没有好的设计软件,建议到Primer3去试试（目前最好的免费引物设计）.如果还是不行,把序列发给我,我帮你设计（我有专业软件,ABI primer express 3 和 Invitrogen Vector NTI 10)通常是非特异扩增过多引起，提高退火温度试试PCR产物放置过久考虑产物降解；如果是PCR后及时上样，考虑引物特异性较差或者模板不纯（包括降解以及掺有别的DNA序列）如果用PCR产物做模板的话，量太大也会有这个现象。胶没煮好也会这样

按照Invitrogen公司的Tizro说明书，在提取RNA过程中进行到加入75%乙醇后，可使RNA沉淀在4度保存一个月，在-20度保存一年。1、以沉淀的形式保存在无水乙醇中；2、以溶液的形式冻存在-80冰箱，并且尽量少冻融；3、按试剂商提供的说法，保存在裂解液中可达2年；一般这种方法用的比较少，因为每次提RNA都是一气下来，中间没有停顿的，除非一次提很多，上午时间不够用，可进行到加入乙醇未知，然后放到-20度冰箱，下午可继续进行。背景反复冷冻-解冻引起冰晶的多次重新形成，损坏了肌细胞的结构、失去肌纤维的完整性，加速了脂肪氧化。冷冻畜肉在现代肉及肉制品加工工业中起着重要的作用, 是国家储备和调节肉食品市场的重要筹码, 也是肉类产品在进出口贸易和国内地区间流通的主要产品形态。相对与新鲜肉, 冷冻肉的低温条件能抑制大多数微生物生长繁殖、降低酶活性、延长货架期、增加肉制品消费的机动性和可支配性[ 2-3] , 但冷冻过程中会产生大小不一的冰晶。

很多做腺病毒扩增病毒的公司都有卖。腺病毒自己感染后的效率不高，建议还是送去公司做。Invitrogen，上海英为信、吉凯、汉恒等都有卖。

细胞培养的污染通常只能采用避免的手段,操作仪器的消毒杀菌,超净工作台等等,培养过程中发生污染的话,只能再来一次了

提连接后的质粒,酶切使其线性化,与酵母感受态细胞混合电击转化,在含抗生素的平板上筛选,再PCR筛选具体请看这个Invitrogen公司的Easyselect Pichia Expression KitA Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris

The Abridged Anchor Primer (AAP),Abridged Universal Amplification Primer (AUAP),Anchor Primer (AP)Universal Amplification Primer (UAP)

Components for Medium recipes for MCF-10A ER-Src cellsDMEM/F12 (Invitrogen No. 11039-021)Horse serum (Invitrogen No. 16050-122)Pen/Strep (100X solution, Invitrogen No. 15070-063)EGF (Peprotech, 1 mg): Resuspend at 100 ug/ml in sterile ddH2O. Store aliquots at -20°C.Hydrocortisone: (Sigma No. H-0888, 1-g bottles) Resuspend at 1 mg/ml in 200-proof ethanol and storealiquots at -20°C.Cholera toxin: (Sigma No. C-8052, 2-mg vials) Resuspend at 1 mg/ml in sterile ddH2O and allow toreconstitute for about 10 min. Store aliquots at 4°C.Insulin (Sigma No. I-1882, 100-mg vials) Resuspend at 10 mg/ml in sterile ddH2O containing 1% glacialacetic acid. Shake solution and allow 10–15 min to reconstitute. Store aliquots at -20°C.

Flp-In 应该是能够靶向插入目的基因的意思（flp重组酶），具体什么原理，楼主可以看下invitrogen说明书，很详细。293就是一种细胞系。该细胞就是能够将目的基因送入靶向位点的表达细胞

使用Multisitegateway技术构建载体的方法 Multisite gateway 实验步骤如下 设计含有attB位点的PCR引物建议使用Vector NTI Advance 软件来设计含有attB和attBr的引物。 上游引物必须同时满足以下条件 含有2225 bp的attB位点 至少1825 bp的模板或插入片段特异性的序列 multisitegateway引物序列的特异性 Fig specificsequences Multisitegateway 下游引物的设计也需满足以上三个条件。 因为我们要在E coli 体内表达蛋白 所以设计上游引物时 要在attB位点之前加上SD Shine Dalgarno 序列来保证翻译的准确性。同时为了保证阅读框的正确性 需要在attB位点之前加上两个核苷酸 但不能是AA AG和GA 因为它们会和attB位点末端的胸腺嘧啶核苷酸T形成终止密码子。 得到PCR产物并电泳检测PCR程序设置和电泳方法同上 需要指出的是 若PCR的模板是包含卡那抗性基因 kanamycin resistance gene 的质粒 需要在电泳检测和纯化PCR产物前对其进行消化 使用的酶是Dpn 作用是为了去除模板对后续反应的干扰。 消化的体系和过程 在50μl的PCR反应体系中 加入5 μl10X REact Dpn37 孵育15 min 65 热激15 min使Dpn BP反应得到entryclone 反应体系如下 BP反应的引物组分Table BPreaction Components Sample Negative control positive control attB PCR product 20 50 fmoles pDONRTMvector 150 ng pMSGW control plasmid 100 ng TEBuffer pH 其中携带attB位点的PCR产物的量可以用以下公式来计算 50 fmoles 2500 bp 660 fg fmoles ng106fg 82 PCRproduct required 实验步骤如下 按上面计算方法和反应体系加入合适体积的pDONRTMvector 和PCR产物 20冰箱里拿出BP Clonase II enzyme mix 放在冰盒上两分钟左右使其解冻。 轻轻涡旋BP酶两次每次两秒钟 BPClonaseII enzyme mix 并立即将其送回 20 冰箱里 样品轻轻涡旋几次使其混合均匀。 25孵育1 蛋白酶K37 孵育10 min。 之后进入转化环节后续实验流程同经典载体构建 最终得到含有attL位点的entry clone。 LR反应组分Table LRreaction Component Sample Negative Control attL4 attR1entry clone 10 fmoles attL2entry clone 10 fmoles attR2 attL3entry clone 10 fmoles pDEST R4 R3 Vector II 20 fmoles TEBuffer pH 使用Infusion方法快速大量构建载体的方法 fusion是一种不依赖于限制性内切酶Restriction Free 的克隆方法 引入此方法的最初动机是为了在一个载体的任意位置引入外源DNA片段。此方法基于DNA片度的扩增 得到的大量的DNA可以作为线性载体扩增的模板。这个方法可实现将多个不同的外源基因同时插入某一个特定的载体的任意我们感兴趣的位置 从而弥补了位点特异性重组系统中对特异位点和特殊系统的需求 为分子克隆和蛋白表达的调控提供广阔的思路和方法。这种方法的原理是DNA片段之间的同源重组 现在应用比较广泛的是由Clontech公司提供的In FusionTM system它可以实现以下克隆需求 同时克隆多个DNA片段 Simultaneous cloning 基因的替换 Gene replacement 多位点突变 Multisite mutagenesis 多组分重组 Multi componentassembly 同时插入和删除基因 Simultaneous insertionand deletion 引物设计及目的基因片段扩增该方法的原理和步骤同前in fusion PCR 只是这个方法中PCR产物需用Dpn 将模板消化。载体线性化载体线性化的方法既可以用特异性酶切消化也可以通过常规PCR 使用PCR的方式使载体线性化消除了对特异性酶切位点的依赖和限制 同时彻底实现载体和片段之间的无缝连接 消除后续由于特殊碱基序列的加入对实验结果的影响 同时大华 35大节省了时间和成本投入。fusion“连接”反应将纯化的DNA片段和载体按照2 1的摩尔比混合入250 EP管中必要时可以加入In fusionTM enzyme 由Clontech提供 和相应buffer 是反应总体系为10 μl。之后共同转入感受态细胞 进入筛选环节。 感受态细胞的制备在线虫载体构建的整个过程中 最重要的实验材料是各种促进反应进行的酶和高转化效率的感受态细胞。不同的载体因其携带筛选基因或者特异表达的宿主的不同 需要诸如DH5α、TOP10等不同类型的感受态细胞 例如在Multisite gateway反应中 通常需要借助ccdB的筛选机制 这种情况下就不能使用携带有ccdA基因的菌株 如TOP10F" 。所以 在不同方法的构建中 要严格选择感受态细胞类型。以下以实验室常用的感受态细胞DH5α为例 详述用氯化钙 CaCl2 法的制备过程。 用CaCl2法制备感受态细胞的原理是通过低渗的CaCl2溶液在低温 时处理快速生长的细菌从而得到感受态菌株细菌外形膨胀为球形 这样的形态结构有利于外源DNA分子形成抗DNA酶的羟基 钙磷酸复合物 这种复合物会粘附在细菌表面 如果热激 细胞对DNA的吸收将大大加强。 实验的关键是选取出于对数生长期的菌株 所有的操作必须尽可能保持在完全无污染无杂菌并且低温的条件下进行。实验材料及准备事项 100ml 胰化蛋白胨 CaCl2的制备称取22 CaCl2溶于200ml事先灭菌的水中 充分溶解后保存于4 冰箱中。 将浓度为100的甘油120 高温灭菌。 器材10 ml移液管 需灭菌玻璃大培养皿 内铺一张滤纸 需灭菌大、中、小枪头各一盒 需灭菌 50 ml离心管 mlEP管 用铁饭盒灭菌 100 ml SOB培养基需40个EP管 步骤如下 80冰箱里取出DH5α 常温使其冻融后通过接种环接种细菌与无抗培养皿中。将培养板放入3 将预先水浴锅灭菌的15ml离心管放在超净台中 紫外照射半个小时以上。从培养皿上挑取单个菌落 接种至离心管中 导入3 ml无抗培养基LB 37 摇床振荡过夜培养 转速为300 rpm 。次日取1 ml菌液接种至100 ml LB培养基中 以215 rpm的转速37 培养2 3小时。期间 要每隔半个小时测定一下600 nm的OD值。 停止培养将烧瓶置于冰上10 15分钟 同时将预先灭好菌的50 ml离心管也置于冰上冷却至0 在超净台中将菌液尽可能平均的分装入两个50 ml离心管中 以4000 rmp的转速离心10分钟。 弃上清将离心管倒置在滤纸上1分钟 以吸干残留的培养基。每个离心管中加入5 ml预冷的浓度为0 1M的CaCl2溶液 重悬菌体 并开始计时 可以用移液枪轻轻反复吹打30分钟。 将悬浮好的菌液再次以4000rmp的转速离心5分钟 去掉上清 吸干残余培养基后 每管加入2 ml预冷的浓度为0 M的CaCl2溶液反复吹打以重悬菌体 此时可以将两个离心管合为一个 放于冰上预冷20分钟 这期间 可以将已灭菌的1 mlEP管放于冰上预冷。 加入500 μl浓度为100 的甘油 mlEP管中。等全部分装完成时 投于液氮中1个小时 之后再转移到 80 冰箱中。 细菌转化效率的检测方法 设置阳性对照和阴性对照 阳性对照是为了估算细菌的转化效率 阴性对照是排除感受态细胞被污染的可能 及查明失败的可能因素。 阴性对照 只将感受态细胞涂于含某种抗性的平板上 而不加入任何DNA 正常情况下不应该有单菌落出现。 阳性对照 选择标准质粒 一般是pUC19 以50 pg、100 pg的量分别转化到感受态细胞里 将平板放于37 培养箱里过夜培养。数单菌落的个数以估计感受态的转化效率。 效率估算公式为 转化率 1000克隆 10pg DNA 当此值达到1 106时 可满足一般克隆的实验需求 当此值达到1 107时 可用作更复杂克隆的构建需求。 线虫的显微注射通过将外源基因显微注射到雌雄同体的线虫的性腺 gonad 能够获得有种系特异性的线虫。DNA片段可以通过染色体之间的同源和非同源的整合被传递到下一代中。显微注射的步骤如下 制作Pad将配置好的2 的琼脂糖放在水浴锅内防止其凝固。吸取100 μl于干净的载玻片上 并迅速将另一块载玻片轻压上面 待琼脂糖稍微干燥时取走载玻片 标记Pad的正反面之后放于干燥箱 80 中过夜。拉制电极常常用含有内芯的硼硅玻璃微电极作为注射用电极 该电极的外径为1 nm内径0 75 nm。用拉制仪拉制好的电极尖端是封闭的 在用之前需要打开一个开口 开口的大小要适宜。 准备注射液注射液的体系一般选取10 目的载体质粒的浓度范围为110 μl。其余体积用1TE补平。以12 000 rpm转速离心3分钟。 吸取1μl注射液到拉好的电极中 放置1520分钟 目的是为了使注射液通过内芯的虹吸作用流入电极尖端 并排除内气泡。 拿出注射要用的Pad在上面滴一滴油 保证有足够的油使线虫减慢干燥的过程 但不能太多以使其移动。 用一个干净的针needle 触碰到油上面 挑取N2时期的成虫 线虫挑取的区域应该远离菌斑所在位置 以避免将菌落带到pad上面。选择有容易辨别的gonad的线虫也同样重要。将线虫垂直放在pad上 使其gonad位于左侧 通常 线虫的阴部 vulva 会指向与needle的方向 两侧的gonad会直接与体壁对应。 当needle恰好位于载玻片上时将线虫聚焦在10 的物镜下 确定看到线虫的gonad。将线虫以和needle成15 到45 的角度摆放 通过轻轻降低needle使其和线虫出于同一水平。转换到40 物镜 聚焦到胞体的gonad 使用调试器上下移动needle 直到针尖对准胞体的gonad。 轻轻沿着needle移动线虫当needle插入线虫体内时 按照gonad和虫体壁处于相反位置的方式轻轻压线虫。轻旋调节器 knob 开始DNA注射液的流入 快速的开合 如果needle确定位于gonad处 此处部位会膨胀并充满液体。如果液体流动不畅 轻轻触碰桌面有助于解决此问题。要避免因加入液体过多导致液体沿着needle进入部位流散到线虫的其他部位。 将needle从线虫中拿出建议沿着逆时针方向。回到10 物镜下 滴一滴M9 buffer使线虫悬浮。使用眉毛挑将线虫放置于另外一个含有M9 buffer的板子上。这样做的目的是为了洗掉多余的油。再将线虫挑到含有细菌的板子上。一个板子上可以放置多条注射后的线虫。两三天后 数F1转基因线虫 并将折射成功的线虫单独转移到板子上以得到有稳定转基因种系的线虫。 显微注射线虫的gonadFig elegansgonad 3910 可能出现的问题及策略 注射后线虫破裂或者死掉的原因可能是needle太大了 或者线虫缺水死亡 方法可能是每注射一个线虫的gonad就换一个新的needle 如果线虫没有直立 原因可能是pad太薄或者需要没烘干 可以通过将板子放在罩子上几个小时来烘干 如果线虫干的太快 可以使用更薄的pad或者在注射前将线虫转移到较湿的板子上。 实验结果与讨论实验中用到的质粒的构建方法 在前言部分和方法部门已做了详细阐述 需要研究的相关基因的启动子的信息 诸如启动子大小 表达部位等 借助于相关文献的报道 在Wormbase中截取特定长度的DNA序列 在NCBI中查找此基因的上下游序列和基因方向 借助网页UCSC提供的序列信息最终得到启动子序列。但在设计启动子引物时 必须留意到序列中3"端和5"端的序列可以根据引物的匹配性在小范围内适当调整。还有一些神经元的位置因为缺乏确切表达谱的启动子而无法最终确定。线虫有302个神经元 标记这些神经元需要大量的质粒构建。在实验初期 我们通过传统酶切连接方法和改造的常用线虫载体组成的BP反应来实现。但随着课题的发展和方法的改进 我们发现Multisite gateway方法更为便捷和高效 特别是在购买了雌雄同体线虫启动子库后 这种技术不仅被用来标记线虫神经元 更多的用在rescue实验和钙信号的测定的构建中。同时 为了使整个课题有一套完整的体系 我们又花费大量的精力将之前不太标准的由gateway反应得到的构建进行了改造 得到一个可以通用的表达体系。 改造Multisitegateway 中的载体pDESTR4 R3为pPD49 26 R4 R3 在使用Multisite gateway 技术构建多克隆载体的过程中 我们发现 这个系统并不是完美的 因为这个系统中各个重组位点的序列有一定的相似性 所以如果想要插入载体的片段的序列 特别是与引物匹配的那一段 与重组位点有相似性时 可能会导致这个技术中所涵盖的反应失败。同时 当我们想用一个启动子驱动不止两个以上基因的表达时 不能直接只用Invitrogen公司提供的试剂盒中的pDESTR4R3 因为外源基因在线虫体内表达时 需要3"UTR稳定整个翻译过程中的顺利进行 但该公司试剂盒提供的载体中不含我们需要的3"UTR 因此 我们改造了一个新的LR反应的载体pPD49 26 R4R3 因为pPD49 26中含带unc54 3"UTR 而且实验证华 41明我们改造的载体同样有很高的反应效率 1在Multisitegateway反应中验证pPD49 26 R4 R3的有效性 Pgpa 4特异性标记ASI神经元 可以驱动TagRFP t在此神经元中表达。 为明场与荧光共定位的图。Fig pPD4926 R4 R3 LRreaction multisitegateway ASI can 改造attL1Promoter attL2为attL4 promoter attR1 验证adaptor clone 如前所述 我们将携带attB1 attB2位点的启动子进行改造得到了标准Multisite gateway反应中的第一个entry clone 在这个改造的过程中 需要引入一个中间反应物 adaptor clone。如果我们可以观察到改造后的启动子能够驱动荧光蛋白在特定部位表达 由此可以验证adaptor clone的有效性。在本课题中 我们使用改造后的启动子Pdaf 7驱动荧光蛋白在神经元ASI里表达 由此adaptor clone的有效性得到验证。

小鼠有质粒么?我记得好像没有吧.

格式没有要求。因为你的软件是试用模式，所以导入功能还没有被激活而已。

世界顶级生物技术公司排名http://www.360doc.com/content/12/1017/13/53246_242001928.shtml 你点进去看吧！很详细满意请采纳，你的采纳是我的动力1 Amgen安进总部所在地：千橡，加州，美国股价（或估值）：$554亿雇员数：17,500公司性质：公共（纳斯达克）业务领域：生物制药简介：Amgen创立于1980年，是世界上最早也是目前最大的生物制药企业之一，当之无愧的行业先行者。　20世纪后10年是生物技术飞速发展的10年，也是安进公司快速成长的10年。1989年6月安进公司的第一个产品重组人红细胞生成素(erythropoietin，简称EPO)获得美国FDA批准，用于治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和HIV感染治疗的贫血．1991年2月公司第二个产品重组粒细胞集落刺激因子(filgrastim，G-CSF)获得美国FDA批准，其适应证为肿瘤化疗引起的嗜中性白细胞减少症。安进公司的这两个全球商业化最为成功的生物技术药物EPO(商品名EPOGEN)和G-CSF(商品名NEUPOGEN)，不仅造福了无数血液透析患者和癌症化疗患者，也为公司带来了巨额的利润，公司也据此迅速发展壮大。（只是Amgen的当家EPO命运坎坷，在最糟糕的时候为了从强生融资1900万就把EPO的所有海外销售给了强生才得以生存，没有这1900万也很可能就没有现在这个约千亿市值的巨大的家伙。）1992年安进公司首次跻身财富500强，当年公司产品销售首次突破10亿美元。2000年财富500强排名，安进公司排在455位。网址：http://www.amgen.com/ 2 Gilead Sciences吉利德总部所在地：福斯特市，加州，美国股价（或估值）：$381亿雇员数：4,500公司性质：公共（纳斯达克）业务领域：生物制药简介：吉利德成立于1987年，是一家独立的生化公司，致力于为患者提供更快更好的治疗方案。其开发和销售的药物广泛应用在治疗病菌传染方面，包括病毒传染、真菌感染和细菌传染，公司还特别关注癌症的治疗。公司拥有liposomal药物专门对付技术，该技术的利用使药物对患者更加安全、简单和有效。网址：http://www.gilead.com/3 Biogen Idec生物基因总部所在地：剑桥，麻省，美国股价（或估值）：$335亿雇员数：5,000性质：公开（纳斯达克）业务领域：生物制药简介：百健艾迪利用尖端科学发现、开发、制造和销售重点用于治疗严重的神经系统疾病的生物制品。是世界上历史最悠久的独立生物技术公司和财富500强公司，收入超过50亿美元。网址：http://www.biogenidec.com/ 4 Celgene赛尔基因总部所在地：塞米特，纽约州，美国股价（或估值）：$300亿雇员数：4,460性质：公开（纳斯达克）业务领域：生物制药简介：主要从事与发明，开发及商品化口服、小颗粒治疗癌症及免疫疾病的药物。网址：http://www.celgene.com/ 5 Shire夏尔总部所在地：都柏林，爱尔兰股价（或估值）：$167亿雇员数：5,251性质：公开（纳斯达克）业务领域：生物制药简介：这家欧洲企业成立于1986年，最初的产品是针对儿童多动症的药物。网址：http://www.shire.com/shireplc/en/home 6 Alexion Pharmaceuticals亚力兄总部所在地：切希尔，康涅狄格州，美国股价（或估值）：$158亿雇员数：1,008性质：公开（纳斯达克）业务领域：生物制药简介：Alexion Pharmaceuticals致力于为罹患重症致命疾病的患者开发生产救命药物。Alexion公司从事治疗药物的探索、开发和推广，这些药物用于治疗种类广泛的严重疾病，包括血液系统和肾脏疾病、移植、癌症和自身免疫疾病。Soliris是Alexion公司首个上市的药物。Alexion公司正在评估Soliris治疗其他适应证的可能性、以及依库珠单抗其他剂型治疗附加临床适应证的可能性，其他处于早期开发阶段的抗体备选产品也正在开发。网址： http://www.alxn.com/ 7 Vertex Pharmaceuticals福泰总部所在地：剑桥，麻省，美国股价（或估值）：$130亿雇员数：2,000性质：公开（纳斯达克）业务领域：生物制药网址：http://www.vrtx.com/ 8 Regeneron Pharmaceuticals再生元总部所在地：塔里敦（Tarrytown），纽约州，美国股价（或估值）：$112亿雇员数：1,729性质：公开（纳斯达克）业务领域：生物制药简介：Regeneron Pharmaceuticals公司成立于1988年，从事研究，开发和销售治疗严重疾病的药物。直至2010年12月31日，公司拥有销售产品，包括在美国的处方药治疗冷凝比林相关的周期综合症的皮下注射剂ARCALYST (rilonacept)。网址：http://www.regeneron.com/ 9 Life Technologies 生命科技总部所在地：卡尔斯巴德（Carlsbad），加州，美国股价（或估值）：$76亿雇员数：10,400性质：公开（纳斯达克）业务领域：实验试剂与器材，测序技术简介：Life Technologies Corporation 是一家致力于改善人类生存环境的全球性生物技术公司。该公司的仪器、耗材和服务可协助研究人员加快推进科学和医学的发展，从而让人们的生活变得更加美好。该公司的客户遍及生物学各个领域，包括筛选与转化研究、分子药物、干细胞治疗、食品安全和动物保健以及21世纪的法医鉴定等。该公司生产供分子诊断和仅供研究使用的产品。Life Technologies的业界领先品牌，包括创新型Applied Biosystems和Ion Torrent品牌仪器以及Invitrogen、Gibco、Ambion、Molecular Probes和Taqman等被全球各地的生命科学实验室所广泛使用。公司持有将近3900项知识产权专利及专有许可证，堪称生命科学界最大规模的知识产权资产。网址：http://www.lifetechnologies.com10 Illumina伊鲁米那总部所在地：圣迭戈，加州，美国股价（或估值）：$53亿雇员数：2,200性质：公开（纳斯达克）业务领域：测序技术网址：http://www.illumina.com/

TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与一个具有3‘-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3"加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3"-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。　通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。

IS10是插入序列，他包括两端的反向重复，还有中间的一段序列，中间的这段序列包括了转座E。而Tn10是组合转座子，他的两端实际上就是两个IS10,因为IS10含有转座E,所以Tn10也含有该E。还有一种为复合型的转座子，他本身也含该E.这几种都是细菌含有的转座因子。真核生物的转座才出现了缺失转座E的情况，才更复杂。参考资料，王镜岩，大生化，下册

DNA提取产物经琼脂糖凝胶电泳条带有两条是怎么回事“从头拖到尾,另外一对引物就能做出来”说明不是引物之间形成二聚体,而是第一对引物的设计有问题（特异性很差）.如果一定要扩增那个区,建议引物的位置向两边放一放.如果你没有好的设计软件,建议到Primer3去试试（目前最好的免费引物设计）.如果还是不行,把序列发给我,我帮你设计（我有专业软件,ABI primer express 3 和 Invitrogen Vector NTI 10)

作为当代大学生，若是带着一脸茫然，踏入这个拥挤的社会怎能满足社会的需要，使自己占有一席之地?因此，我试着为自己拟定一份职业生涯规划，将自己的未来好好的设计一下。有了目标，才会有动力。 　　一、社会环境分析 　　中国政治稳定，经济持续发展。在全球经济一体化环境中的重要角色。经济发展有强劲的势头，加入WTO后，会有大批的外国企业进入中国市场，中国的企业也将走出国门。目前社会对于通信类人才需要还是比较大的，特别是我国的通信技术还不是很先进的情况下，具有一定能力的高水平毕业生一定会得到企业的青睐。所以说在校加强通信方面的专业知识学习，会在就业时有一定的专业优势。 　　二、职业环境分析 　　生物技术专业被认为是21世纪科学技术的核心之一，因此21世纪也被称为生物技术世纪。12月16日，《科学》杂志评出2010年十大科学突破。量子机械、合成生物学、尼安德特人基因组、艾滋病病毒预防、外显子组测序/罕见疾病基因、分子动力学模拟、量子模拟器、下一代基因组学、核糖核酸(RNA)重编程、基因剔除大鼠等突破位列其中。生命科学的突破占据了其中七席。从中可以看出生物技术对世界的重要性。生物技术成为全球发展快的科学之一，它的应用逐渐的走入人们的日常生活中，成为人们的得力助手。在环保、食品、化工等生物技术在欧美国家发展很快。目前，全球生物技术主要应用于医药和农业，行业也有广阔的应用前景。这是一个新兴产业，更是一个朝阳产业。 　　三、职业目标定位及其分解组合 　　1.职业目标的确定：在大型制药企业找到工作 　　2职业目标的分解与组合： 　　该专业的大学生可以从事以下几种工作： 　　(1)教育工作由于该领域的发展，将会有越来越多的大学开设该专业，所以对教育工作者的需求也逐渐增大，由于科技的进步的很快，对该领域的知识的更新也越来越快，所以对毕业求职者是很好的机会。 　　分析：从事该领域的教学工作是很难的，由于它是高端科技，所以要求从业者必须要有扎实的专业知识、技能，还必须时刻关注该领域的动向，不断地更新自己大脑中的知识。对于这一门槛，很多求职者都很难跨过，所以想要做一个教育工作者，要求必须要有对该专业的兴趣，有坚定的毅力和不怕吃苦的精神，还要有长远的发展眼光。 　　(2)生物技术外企随着世界科学和经济的发展，很多的生物技术公司也应运而生，一些著名的公司如:Promega公司、Invitrogen公司、Clontech公司等。这些公司对人才的需求量很大，是很好的去处。 　　分析：想要进入这些公司是很难的，他们的门槛是很高的，所以要求你必须要把这门专业学的很好，并且你至少要是硕博以上的大学生，本科生想要进入就好像中了彩票一等奖一样是非常难的，但是其待遇是相当高的，有着丰厚的薪水，是每一个生物技术学子的理想去处。 　　(3)国内生物技术企业中国生物技术集团公司、上海基康生物技术有限公司等，这是广大毕业生选择多的去向。分析：由于国内的生物技术公司很多，但绝大部分都是一些小公司，要有较好的发展，选择一些较大的公司是比较好的选择，但择优原则，所以必须要有很好的专业知识。其薪水好，待遇高，是大学生很好的去向。 　　(4)发酵公司中国有很多的酒厂、药厂、醋厂等需要发酵的公司，如五粮液、青岛啤酒等。在这些地方工作有很好的福利待遇，但发酵工程专业的毕业生比我们更有优势，所以有很大的竞争压力。 　　(5)国家公务员或事业单位中国有很多关于生物技术的事业单位，如疾病控制中心、食品检验中心、药品检验中心、药监局等。毕业生可以考取公务员，或者直接在其工作。分析：这些事业单位要求必须是硕士一上的学位，公务员每年招收的比例也极低，所以竞争很激烈，所以你必须很。但其有很好的福利，有稳定的薪水，也不失为一份完美的工作。 　　四、具体执行计划 　　首先，要认真听课，保证学习成绩。因为生物技术这一行经验比学历重要，要好好学习与计算机相关科目。但是，我认为，眼光应当放远一些，在我的大学时代多方面培养自己，丰富知识，提高综合素质，而不是急功近利，纯粹为了就业而学习。当然，学习中应当有所偏重，生物工程对计算机和实验操作动手能力求更高，更严格。到了后期要开始实习个自己多的锻炼和丰富的实际经验。 　　具体安排如下： 　　一年级目标：初步了解职业，提高人际沟通能力。 　　主要内容有：和师哥师姐们进行交流，询问就业情况;参加学校活动，增加交流技巧;学习计算机知识，辅助自己的学习。 　　二年级目标：提高基本素质。 　　主要的内容有：通过参加学生会或社团等组织，锻炼自己的各种能力，同时检验自己的知识技能;提高自己的责任感、主动性和受挫能力;英语口语能力增强，计算机应用能力增强，器械维修能力。 　　三年级目标：提高求职技能，搜集公司信息。 　　主要的内容有：撰写专业学术文章，提出自己的见解;参加和专业有关的暑期工作，和同学交流求职工作心得体会;学习写简历、求职信;了解搜集工作信息的渠道，并积极尝试。 　　四年级目标：工作申请，成功就业。 　　主要的内容有：对三年的准备做一个总结;然后，开始毕业后工作的申请，积极参加招聘活动，在实践中检验自己的积累和准;预习或模拟面试;参加面试等;积极利用学校提供的条件，了解就业指导中心提供的用人公司资料信息、强化求职技巧。 　　五、结束语 　　中国人常说“尽人事，听天命”。对于我们可以控制的，理当全力以赴;对于不可控制的，我们应当养成坦然接受的胸怀和气度。要抱着不做则已，要做就要做好的信念，这样，才能赢得收获。通过职业规划，我进一步认识自己，了解自己，找到奋斗的方向，不再迷茫。从现在开始，我是一艘有航向的船，向我的未来扬帆远航，乘风破浪!

如果是已知的质粒，才能查到。如果是自己新建的，必须用专业软件，比如Invitrogen的VECTOR NTI 来作图。抗性基因的序列都可以在NCBI上输入基因的名称后查到

啊

可以从Invitrogen 网站上下载了最新版的Vector NTI 11.5.3，安装正常，可以用原来的11.5 crack破解。我的系统是Windows 8.1，64位。

英俊、博尚、invitrogen、生工都可以。设计引物的话只要把你需要的引物序列发给人家就行了。

要看测什么和用什么测，第一代测序，大概一个单向（最多1000左右）20多吧，第二代测序，1G的数据量不到1000，还有量大从优，如果你有测序的需求可以私信我。

1 cDNA 文库的构建 1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。在获得高质量的 mRNA 后，用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。 1.2 cDNA 全长文库 经典 cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的 cDNA。为了克隆到真正的 cDNA 全长，建立富含全长的 cDNA 文库具有重要意义。为此，必须克服仅用 mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长 cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的 mRNA 分子经反转录而得到的 DNA 分子群体，是 mRNA 分子群的一个完整的拷贝。全长 cDNA 文库不仅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通过基因序列比对得到 mRNA 剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国 CLONTECH 公司的 SMART cDNA Library Construction Kit 方法或 GeneRacer 试剂盒 (Invitrogen，USA) 使用说明进行。判断一个 cDNA 文库中的 cDNA 序列是否是全长基因的 cDNA，主要方法有以下几种。 1.2.1 直接从序列上评价 5"端：如果有同源全长基因的比较，可以通过与其它生物已知的对应基因5"末端进行比较来判断。如果无同源基因的新基因，则首先判断编码框架是否完整，即在开放阅读框的第1个 ATG 上游有无同框架的终止密码子；其次，判断是否有转录起始点，一般加在5"帽结构后有一段富含嘧啶的区域，或者是 cDNA 5"序列与基因组序列中经过酶切保护的部分相同，则可以确定得到的 cDNA 的5"端是完整的。3"端：同样可以用其它生物已知的对应基因3"末端进行比较来判断，或编码框架的下游有终止密码子，或有1个以上的 PolyA 加尾信号，或无明显加尾信号的则也有 PolyA 尾。 1.2.2 用实验方法证实 可以通过引物延伸法确定5"端和3"端的长度，如：5"端 RACE，3"端 RACE，或者通过 Northern Blot 证实大小是否一致。 1.3 对 cDNA 文库的分析 对 cDNA 文库质量的评价主要有两个方面。第一方面为文库的代表性，cDNA 文库的代表性是指文库中包含的重组 cDNA 分子反映来源细胞中表达信息(即 mRNA 种类)的完整性，它是体现文库质量的最重要指标。文库的代表性好坏可用文库的库容量来衡量，它是指构建的原始 cDNA 文库中所包含的独立的重组子克隆数。库容量取决于来源细胞中表达出的 mRNA 种类和每种 mRNA 序列的拷贝数，1个正常细胞含10000～30000种不同的 mRNA，按丰度可分为低丰度、中丰度和高丰度三种，其中低丰度 mRNA 是指某一种在细胞总计数群中所占比例少于0.5％时。满足最低要求的 cDNA 文库的库容量可以用 Clack-Carbor 公式 N=Ln(1-P)/(1-1/n) 计算( P 为文库中任何一种 mRNA 序列信息的概率，通常设为99％；N 为文库中以 P 概率出现细胞中任何一种 mRNA 序列理论上应具有的最少重组子克隆数；n 为细胞中最稀少的 mRNA 序列的拷贝数；T 为细胞中表达出的所有 mRNA 的总拷贝数)。第二方面是重组 cDNA 片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种 mRNA 片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种 mRNA 尽管具体序列不同，但基本上都是由3部分组成，即5"端非翻译区，中间的编码区和3"端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。因此，要从文库中分离获得目的基因完整的序列和功能信息，要求文库中的重组 cDNA 片段足够长以便尽可能地反应出天然基因的结构。 2 cDNA 文库构建的其它类型 2.1 均一化 cDNA 文库 它是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在 cDNA 文库中表达基因对应的 cDNA 的拷贝数相等或接近。WEISSMAN 早就提出了可以通过基因组 DNA 饱和杂交的原理将 cDNA 文库进行均一化的理论。但该理论一直以来都被认为不能应用于实际。其主要限制因素是难以提供足量的极低表达丰度的 cDNA 用于饱和杂交，从而可能会造成部分基因的 cDNA 的丢失。20年前，基于 DNA-RNA 杂交的研究就已经将基因的转录水平分为高中低3类。随后研究进一步表明，绝大多数基因是处于中等或低等表达丰度的，在单个细胞中含有近1～15个拷贝，而高丰度表达基因的转录产物在单个细胞中最高可达5000个左右拷贝，约占总表达量的25％。这种基因表达能力上的巨大差异成了获得一个具有完整代表性的 cDNA 文库的障碍，其表达量上的巨大差异更为大规模研究增添了困难。对单一组织的 cDNA 文库而言，高拷贝基因序列的大量存在给基因的筛选和鉴定带来不必要的浪费，尤其是在大规模的 EST 测序中。 均一化 cDNA 文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。现在，在构建均一化的 cDNA 文库中至少有2种主要的观点：一种是基于复性动力学的原理，高丰度的 cDNA 在退火条件下复性的速度快，而低丰度的 cDNA 复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组 DNA 在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过 cDNA 与基因组 DNA 饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的 cDNA 的丰度。第一种方法的掌握对技术的要求比较高，对多数人而言需要多次摸索才能找到最适条件；而后一种方法易于掌握，但有研究者根据复性动力学的原理也提出了其不利因素，即采用基因组 DNA 饱和杂交的方法会因为低拷贝的表达基因拷贝数少而无法被杂交上。目前已报到的均一化 cDNA 文库多是根据第二种原理构建的，常用策略有基于 PCR 技术利用 cDNA 多次复性 mRNA-cDNA 杂交等。有研究报道，针对各自选择的高表达靶序列进行分析后，均一化处理后文库的高丰度表达 cDNA 是处理前的0.3％～2.5％，基本满足节约筛选的要求。 均一化 cDNA 文库具有以下4方面的优点：第一，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验成本。第二，增加克隆低丰度 mRNA 的机会，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。第三，与原始丰度的 mRNA 拷贝数相对应的 cDNA 探针与均一化的 cDNA 文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。而以往的文库构建，忽略了 mRNA 丰度的影响。第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序或芯片制作等研究。 2.2 差减 cDNA 文库 (Subtractive cDNA library) 差减文库也称扣除文库，使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料(如不同基因处理细胞系或植物的近等基因系等)提取 mRNA (或反转录后合成 cDNA)，在一定条件下用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子( Driver )与含有目的基因的试验方( Tester )进行杂交，选择性的祛除两部分共同基因杂交形成的复合物，往往进行多次的杂交—祛除过程，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。消减杂交是构建差减 cDNA 文库的核心，差减文库是否构建成功很大程度上决定于差减杂交的效率。差减杂交的方法主要有(1)羟基磷灰石柱层析法 (HAP)；(2)生物素标记、链亲和蛋白结合排除法；(3)限制性内切酶技术相结合的差减方法；(4)差减抑制杂交法 (SSH)；(5)磁珠介导的差减法 (MAST)，其中 SSH 法最为常用。 抑制性消减杂交技术 (Suppression Subtractive Hybridization，SSH) 是 DIATCHENKO 等人于1996年依据消减杂交和抑制 PCR 发展出来的一种分离差异表达基因的新方法，主要用于分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。它主要是利用抑制 PCR 对差减杂交后丰度一致的目的材料中两端连有不同接头的差异表达片段进行指数扩增，而两端连接上同一接头的同源双链片段仅呈线形扩增，从而达到富集差异表达基因的目的。因此应用该技术能够对两个有差异表达的材料(细胞或组织)高、中、低丰度目的基因都进行有效、快速、简便克隆。近年来已成功应用于植物发育、肿瘤与疾病、以及外界因子诱导组织细胞中相关的应答基因的分析和克隆。 2.3 固相 cDNA 文库构建 cDNA 的固相合成是人们早为熟知的技术，但局限之处 oligo(dT) 与纤维素胶粒或磁珠的结合比较牢固，将 cDNA 洗脱下来时得率不是很高，而且以后的反应步骤也不能都在介质上进行，这可能是该技术应用并不十分广泛的原因。 最近 THOMAS ROEDE 提出了一种新的 cDNA 文库固相合成方法( THOMAS ROEDE，1998)，克服了以前文库构建中存在的缺点，所用的酶和试剂与传统方法完全相同，不同的是 cDNA 的合成和修饰均在固相支持物—磁珠上完成。cDNA 通过一个生物素固定在链霉素偶联的磁珠上，这样在反应过程中就可以简便而迅速的实现酶和缓冲液的更换，因此它将快速与高质量的文库构建结合在一起(构建文库只需1 d)，并且构建的文库适合大多数的研究目的。 固相 cDNA 合成法的主要优点是可以简便 cDNA 合成的操作。在进行缓冲液更换时既没有 cDNA 的丢失之忧，也无其它物质污染之忧。另外，用此方法可以得到真实的代表性文库，它包含有短小的 cDNA，这是因为在克隆之前省去了分级分离的步骤。总之，固相法结合了传统的 cDNA 合成的优点并弥补了其不足。这种方法简便易行，可靠低廉，所建文库高质量，因此它可能会替代目前应用的 cDNA 文库操作方法。 另外，最近发展起来的微量 RNA 的 cDNA 构建，是使用 PCR 技术，在实验室条件下扩增的 mRNA 的 cDNA 量，其 PCR 检测的灵敏度远远大于反转录 PCR(RT-PCR) 法。微量 RNA 的 cDNA PCR 文库的构建可为有关微量活性物质遗传基因的研究提供方便。 3 cDNA 文库应用于分离新基因的方法 发现并分离克隆新基因始终是分子生物学研究的主要任务和目的，虽然 cDNA 文库的用途很多，但是，应用于分离新基因是其最重要的用途。前述的不管是哪种类型的 cDNA 文库，都可以用于分离新基因，只是使用的方法有差异。分离方法主要有两种：第一，对于非全长 cDNA 文库，即不管是经典的 cDNA 文库方法或差减法构建的 cDNA 文库，需要利用已经获得的新 cDNA 序列片段，通过 RACE 方法获得新基因的全长序列。第二，利用全长 cDNA 文库与目的基因片段作为探针的杂交筛选。 3.1 从非全长 cDNA 文库中筛选新基因 3.1.1 RACE 法 RACE 文库即快速扩增 cDNA 末端法( Rapid Amplification of cDNA End，RACE )只需知道 mRNA 内很短的一段序列即可扩增出其 cDNA 的5"(5" RACE )和3"端(3" RACE )。该法的主要特是利用一条根据已知序列设计的特异性引物和一条与 mRNA 的 PolyA (3" RACE )或加至第一链 cDNA 3"端的同聚尾(5" RACE )互补的通用引物，由于同聚体并非良好的 PCR 引物，同时为了便于 RACE 产物的克隆，可向同聚体引物的5"端内加入一内切酶位点。所用的 cDNA 模板可以使用多聚 dT 引物延伸合成(3"，5"-RACE 均可)。当 RACE PCR 产物为复杂的混合物时，可取部分产物作模板，用另一条位于原引物内侧的序列作为引物与通用引物配对进行另一轮 PCR (巢式 PCR )。早在1988年，FROHMAN 等即用此方法成功地获得了4种 mRNA 的5"合3"末端序列。 迄今已有几种改良的 RACE 方法，通过修饰与优化，与最初的 FROHMAN 报道有所不同：(1) BARSON 等采用锁定寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸引物“锁定”基因特异性序列的3"末端与其 Poly (A) 尾的连接处，进行第1条 cDNA 链的合成，消除了在合成第1条 cDNA 链时寡聚 (dT) RNA 模板 Poly (A) 尾任何部位结合而带来的影响。(2) EDWARDS 和 TROUTT 小组利用 T4 RNA 连接酶把寡核苷酸连接到单链 cDNA 的5"末端，然后用一个3"末端特异性引物和一个锚定引物就可以直接对锚定连接的 cDNA 进行体外 PCR 扩增和克隆。随后，BERTLING 等又用 DNA 连接酶代替 RNA 连接酶。这些方法都避免了在第2条 cDNA 链内同聚序列区互补而导致截断 cDNA 的产生。(3) MARUYAMA 等提出 cRACE 法，采用的引物为基因特异性的，所以非特异性 PCR 产物基本上不会产生。Clontech 等公司也根据 RACE 法的更新，相继推出了 RACE 的相应试剂盒，为克隆 cDNA 提供了方便的工具。最近 HUANG 等人即用 RACE 试剂盒克隆了一种含有类植物血凝素免疫受体 ITIM。 3.1.2 用 PCR 法从 cDNA 文库中快速克隆基因 通过对文库的筛选或适用简并引物进行 PCR 反应，常常只能获得不完整的 cDNA 片段。为了得到 cDNA 全长，常常要重新筛选文库。重新筛选文库工作量大，RACE 虽然为此提供可方便，但应用该方法需重新提取 mRNA 和反转录。而用 PCR 法从 cDNA 文库中快速克隆基因的方法，只需提取 λ 噬菌体 DNA，按保守序列设计 PCR 引物便可将未知片段进行克隆。特别是在基因的两端变异较大而中间某区域保守的情况下，用 PCR 法很容易获取 cDNA 的全长。同一转录产物，又是存在着不同的拼接方式，通过筛库的办法同时将不同拼接方式的克隆筛选出来可能性较小，而使用 PCR 扩增后，有利于观察到不同的拼接方式。另外，为研究基因在不同组织中表达情况，常根据差异显示法找出特异的 mRNA。 3.2 从全长 cDNA 文库中进行杂交筛选 3.2.1 标记探针 cDNA 文库筛选法 cDNA 文库通常涂抹到母盘培养基上，然后再把这些菌落的样品吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上；这时加入标记的探针，如果出现杂交信号，那么从母盘上就可以把包含杂交信号的菌落分离、培养出来。以此筛选出阳性克隆，进行序列分析，以获得 cDNA 全长。该方法能避免 PCR 扩增的非特异性扩增或错配，是一种比较准确可靠的 cDNA 克隆方法。主要缺点是克隆过程需要一系列的酶促反应、产率低、费时长、工作量大。该方法适合于表达丰度高的基因的筛选分离。用于做标记探针的 DNA 片段可以是其它生物的基因片段，在这种情况下筛选出来的基因往往是已分离基因的同源基因；如果用于做标记探针的 DNA 片段是通过新分离蛋白质的氨基酸反推设计的 DNA 序列，或者是特异分子标记子 DNA 序列，那么可以筛选得到新功能基因。 3.2.2 反式 PCR 反式 PCR 克隆 cDNA 全长的基因原理是：双链 cDNA 合成后进行尾—尾连接，环化的 cDNA 用位于已知序列内的限制性内切酶酶切位点造成缺口或用 NaOH 处理使之变性，然后用2条基因特异性引物对重新线性化或变性的 cDNA 进行扩增。反式 PCR 的优势在于，它采用了2条基因特异性引物，因此不易产生非特异性扩增。该方法可以快速、高效地扩增 cDNA 或基因组中已知序列两侧位置的片段。 4 小结 随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。在过去寻找新基因的方法中，以消减杂交、mRNA 差异显示，cDNA 的代表性差异显示分析法、差异消减展示等方法应用最广。这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。目前，比较可行而且应用较多的方法主要还是 cDNA 文库的筛选。一方面 cDNA 文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因此 cDNA 克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多；另一方面由于每个 cDNA 克隆只代表一种 mRNA 序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低，所以 cDNA 文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。本文涉及到的有关 cDNA 文库构建方法，是目前比较常用的，这些方法各有优缺点，研究者应根据自己的实际情况，选择合适的技术，已达到自己预期的目的。

TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。 Invitrogen公司TA克隆系统和Topo TA克隆系统都提供一个线性含3`-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。系统中也包含感受态细胞和S.O.C培养基, 使得实验操作更为简单方便。所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理（Invitrogen另有平端载体供高确限度酶克隆）。不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。

1.按照Invitrogen公司的Tizro说明书，在提取RNA过程中进行到加入75%乙醇后，可使RNA沉淀在4度保存一个月，在-20度保存一年。2.一般这种方法用的比较少，因为每次提RNA都是一气下来，中间没有停顿的，除非一次提很多，上午时间不够用，可进行到加入乙醇未知，然后放到-20度冰箱，下午可继续进行。3.一般保存方法都是RNA溶解到无RNase的水中，然后-80度冰箱保存。4.反复冻融对RNA的长时间保存肯定是有影响的，可分成小量保存，尽量减少冻融。5.现在有些试剂公司有相关的产品，可用于保存RNA，不过可能会有植物或动物，细胞或组织之分。

霉菌繁殖能力太强,而且目前没有特别有效又不会同时杀灭细胞的抗真菌药,要是细胞长霉你就别挣扎了.一般染普通细菌如大肠杆菌或者葡萄球菌等,而且发现得早,情况尚不严重的话可以用抗生素冲击法：如果发现有染菌迹象,立即更换新鲜培液,并加入普通使用浓度10倍的青-链霉素双抗（有现成商品出售,比如Invitrogen公司卖的是1000X的,你按1：100用就行）,37度培养处理24-36小时,再换乘正常培液培养,不断观察细菌是否重新出现,如果没有重新出现,恭喜你成功了.一定要早发现,早处理,细菌生长非常迅速,细菌生长的同时还会分泌毒素杀死你的细胞,晚一小时发现都会让成功率降低不少.不过一旦染菌以后还是别抱太大希望,双抗对细胞本身也有害,常常"同归于尽".有条件的话还是复苏或者买新的细胞吧 细胞污染最麻烦的还是支原体,因为显微镜看不到,光确定是否被支原体污染就要购买特殊试剂进行检验,非常麻烦.而且支原体对青霉素不敏感,除支原体的药价格很昂贵,往往比买新的细胞还贵

经典的培养基有很多种，其中 DMEM、 RPMI 1640、 MEM 、 DMEM/F12 都是应用最广泛的培养基。其他 如 M199 、 IMDM 、 L15培养基等也用于某些细胞的培养。其具体的特征及应用如下： 基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle），1955年Eagle设计，BSS＋12种氨基酸＋谷氨酰胺＋8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM等。 又称低限量Eagle培养基（Minimal Essential Medium），1959年在Eagle"s基础培养基（BME）上修改而来，删去赖氨酸、生物素，氨基酸浓度增加，适合多种细胞单层生长，有可高压灭菌品种，是一种最基本、试用范围最广的培养基，但因其营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。 DMEM是由Dulbecco改良的Eagle培养基，起初是为小鼠成纤维细胞设计的。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。 低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。高糖更适合高密度悬浮细胞培养，也适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。 Guilber 和Iscove将Dulbecco" Medium 改良为 Iscove"s Medium，用于培养红细胞和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES。并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM还能够促进小鼠B淋巴细胞，LPS刺激的B细胞，骨髓造血细胞，T细胞和淋巴瘤细胞的生长。IMDM为营养非常丰富的培养液，因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。 Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，针对淋巴细胞培养设计，含BSS＋21种氨基酸＋维生素11种等。现也用于悬浮细胞培养，如哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。 1963年Ham设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，特适于羊水细胞培养。 Ham"s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。由于营养成分丰富，且可以使用较少血清，故也常作为无血清培养基的基础培养基。 1950年Morgan等设计的具有确定化学成分的细胞培养液，即M-199。除BSS外，含有53种成分，为全面培养基，主要用于鸡胚成纤维细胞培养。此培养液必须辅以血清才能支持长期培养。M-199可用于培养多种种属来源的细胞，并能培养转染的细胞。现广泛用于病毒学、疫苗生产。 1959年MeCoy为肉瘤细胞设计，BSS＋40种成分。可支持多种（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。 L-15培养液适用于快速增殖瘤细胞的培养，用于在CO2缺乏的情况下培养肿瘤细胞株。此培养液采用磷酸盐缓冲体系，氨基酸组成进一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。 至于选择何种培养基并没有一定的标准，有几点建议可供参考： (1)建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。也可以在一些生物公司的网站上搜索，如Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。 (2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选RPMI1640 。 (4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。

无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。贴壁细胞的脂质体转染一、实验材料1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)2、脂质体LIPOFECTAMINE2000(invitrogen公司)3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。2、溶液1：240ul无血清培养基+10ullipofectamine2000perwell(总体积250ul)(温育5min)3、溶液2：Xul无血清培养基+4ug质粒perwell(总体积250ul)……详细资料请参考：on http://www.bio1000.com/experiment/cell/237988.html

典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5"AOX1和3"AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3"AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5"AOX1和3"AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5"AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115菌株具有AOX1基因，是Mut+，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。

表达载体， 序列：http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/strains_vectors/vectors/seq/pDONR207_seq.html

可用混合酶进行扩增,一般可以挑到无突变的克隆. 另外可以控制扩增的次数,你估计一下模板含量,然后用乘以和扩增相关的系数2^(0.7*n),其中n为扩增次数.这个方法还是比较准确,控制循环次数可以把相差两个Log的DNA扩增到基本相同的含量.你扩增的次数控制在产物总量不要超过500ng（50ul体系）.我喜欢用Pfx（Invitrogen）,扩增效率高,突变产物较少.Iproof也可以,产量也不错.

胚胎干细胞培养基的发展历程为传统培养基加血清-条件培养基-无血清培养基，最高级别的无血清培养基是性能最优的培养基，批次稳定、成分明确，主要厂家有HYStemCell，invitrogen，stemcell等；