在做cck8增值实验时，加药前一天可以把药物先配好吗

在电子耦合试剂（也就是细胞是活的，有呼吸，有能量代谢）存在的情况下，可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan)。活细胞越多，产生的Formazan就越多，颜色也会越深。Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基－4-硝苯基）－3-(4-硝苯基）－5-(2,4-二磺基苯）－2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。研究方法细胞增殖的研究方法有很多，主要包括：BrdU，EdU，CCK8等方法。其中EdU检测方法是最新的细胞增殖检测方法。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。

增殖是一种在生物医学领域内， 非常常见的表型， 甚至可以说是最常见的一种表型。 细胞增殖是高等生物体最为重要的生命特征。 高等动物体内的细胞，主要有两种增殖的方式。第一种是体细胞的增殖方式： 有丝分裂。 有丝分裂也是最常见的一种增殖方式。 在有丝分裂的过程中， 2 倍体的体细胞在经过有丝分裂之后， 产生两个都是 2 倍体的后代细胞；另一种是性生殖细胞所采用的增殖方式， 被称为减数分裂。 减数分裂最大的特点是， 2倍体的性生殖细胞， 经过减数分裂后， 形成 2 个单倍体的后代细胞。 由于细胞在分裂前是 2 倍体， 而分裂后变成了单倍体， 使得细胞内的染色体数目变成了原先的一半， 因此得名“减数分裂” 。 增殖是最为常见的表型。 无论是正常生理条件下， 还是异常的病理条件下， 无论是正常的细胞， 还是异常的细胞， 增殖现象都是普遍存在的。 一.增殖表型如何检测？ 1.分子层面检测增殖表型 有些分子的表达和增殖的表型有密切的关系， 因此， 只要能检测到这些特定分子的表达， 就表征了增殖现象的发生。 这类分子就是增殖的 marker 分子。 常见的和增殖相关的 marker 分子有如下几种： （1） 与增殖相关的分子标志物 A) MCM （微小染色体维持蛋白， minichromasome maintenance protein， MCM） 。 MCM只存在于真核细胞中。 MCM 在有丝分裂的晚期和 G1 期与染色质紧密结合， 在 S 期和G2 期分开。 MCM 蛋白只在细胞的增殖期才能检测到， 它的表达在 G1/S 转换点达到峰值， 在分化期和静息期时， 表达缺失， 因此可以作为细胞增殖的特殊标志物。 B) 细胞核相关抗原 Ki-67。 这个分子是经典的细胞增殖相关分子标志物， 最早在 1983年在增殖细胞中发现， 目前在病理诊断中使用非常地广泛。 Ki-67 的一级结构比较特殊，还没有发现与之同源的蛋白， 所以目前对于 Ki-67 的功能了解得不多。 推测它可能具有如下的几个功能： 1） 推测 Ki-67 可以调节细胞周期； 2） Ki-67 能和 DNA 或者 RNA 发 生相互结合； 3） Ki-67 在细胞分裂期参与合成核糖体。 Ki-67 在细胞的 G0 期不表达，G1 中期到后期出现表达， S 期和 G2 期表达逐渐增加， 有丝分裂期达到高峰， 细胞分裂后迅速降解。 C) 增殖细胞核抗原 PCNA。 PCNA 又称为周期素， 它是 DNA 聚合酶δ的辅助蛋白。 这个分子也是经典的增殖相关分子标志物， 最早在 1978 年就有所报道。 又因为 PCNA 出现在增殖期细胞的细胞核中， 所以被称之为增殖细胞核抗原。 PCNA 的主要功能有： 1）DNA 聚合酶δ的辅助蛋白； 2） 参与 DNA 损伤的修复； 3） 参与细胞周期的调控； 4）和 p21 相互作用。 P21 是 CDK 的抑制因子， 因此 PCNA 通过和 p21 相互作用， 间接影响细胞周期和增殖。 在增殖细胞的细胞周期中， PCNA 的量会发生明显变化， 它在 G0/G1期几乎没有表达， G1 晚期表达大幅度增加， S 期达到高峰,G2/M 期表达下降。 PCNA 也已经广泛应用于临床病理诊断和相关的生物学研究中。 PCNA 和 Ki-67 作为细胞增殖标志物， 所存在的一些缺陷。 PCNA 和 Ki-67在 G1 早期不表达， 因此在整个细胞周期过程中， 存在表达时间上的间隙。 另外 PCNA 在DNA 修复和复制过程中， 发挥了作用， 这会导致结果的“假阳性”。 就是说某些没有发生增殖， 但是发生了 DNA 修复的细胞， 也会上调 PCNA 的表达， 这会让研究者误以为细胞发生了增殖。 Ki-67 也会有类似假阳性现象的存在， 比如说 Ki-67 的表达水平， 会受到外部因素的影响， 比如在营养缺乏的时候。 MCM 蛋白相对于 PCNA 和 Ki-67 而言， 很大的优势在于整个细胞周期中都有表达， 而且它不受 DNA 损伤修复和其他外部因素的影响。 因此有的研究者认为， MCM 蛋白是优于 PCNA 和 Ki-67 的理想的细胞增殖标志物。 但是从实际的应用层面看， 无论是在临床应用当中， 还是在基础科研当中， PCNA 和 Ki-67 的应用， 都更加广泛。 （2） 和干细胞相关的分子标志物 根据肿瘤干细胞的理论， 肿瘤干细胞是肿瘤中， 具有自我更新的能力并且能够产生异质性的肿瘤细胞。 肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖， 维持了肿瘤细胞群的生命力。 因此， 如果通过肿瘤干细胞相关分子标志物的检测， 证实肿瘤干细胞的数量增加， 这就提示肿瘤的恶性程度高， 间接地说明了肿瘤增殖能力的增强。 例如， CD44 是胰腺癌中肿瘤干细胞常用的分子标志物， 因此可以通过检测 CD44 的表达水平， 证实胰腺癌中肿瘤干细胞的情况， 间接地证实肿瘤细胞增殖能力的强弱。 但是采用这种方法是具有局限性的， 因为不同肿瘤的肿瘤干细胞分子标志物是不同的。 而且在很多肿瘤当中， 肿瘤干细胞的标志物， 还存在很大的争议。所以我个人的建议是， 直接检测 PCNA 或者 Ki-67 之类的细胞增殖相关标志物更好更直接；检测肿瘤干细胞相关的分子标志物， 只能间接地说明肿瘤细胞的恶性增殖情况， 只能算是锦上添花而已。 （3） 检测抑癌基因 检测抑癌基因相关的分子标志物也是一类和细胞增殖间接相关的分子标志物。检测这一类分子标志物， 它存在着如下的一种逻辑推理的过程， 首先， 在细胞内抑癌基因的表达水平或者活性明显下降， 就提示肿瘤的恶性程度明显提升， 间接地说明了肿瘤的恶性增殖表型会有所增加。 在这一类分子标志物当中常见的抑癌基因有两个： p53 和 PTEN。 经常可以看到在论文当中， 通过 western 或者 qPCR， 证实 p53 以及 PTEN 分子表达水平降低， 从而间接地说明肿瘤细胞恶性程度上升， 肿瘤的增殖表型也会显著的提升。 2.细胞层面检测增殖表型 （1） 直接检测细胞的增殖状态 A） 最为经典的方法是 MTT 法。 MTT 是一种染料。 它的检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞没有这个现象。 DMSO 能溶解细胞中的甲瓒， 最后用酶标仪在特定的波长处， 测定光吸收值， 可间接反映活细胞的数量。 MTT 法早已成为研究细胞增殖的经典方法。 后续基于类似的实验原理，还在 MTT方法的基础之上，演化出了各种不同的替代技术，比如 CCK8染色实验等等。 在做 MTT 实验的时候， 通常取 5 个时间点（通常就是 5 天） 。 把 5 天中每一天的吸光度数据都记录下来， 最后形成一条细胞增殖的曲线。 通过比较不同处理方式或者不同实验组之间， 细胞增殖曲线的高低， 就可以判断细胞增殖情况的快慢。 B） 另一种经常用于检测细胞增殖的经典方法是 Brdu 染色法。 Brdu 是胸腺密啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的 DNA， 可以代替胸腺嘧啶， 选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。 这种渗入可以稳定存在， 随着 DNA 的复制， Brdu 可以进入子代细胞中。 Brdu 特异性抗体可以用于检测 Brdu 在细胞 DNA 中的渗入， 从而判断细胞增殖能力的变化。 通常在使用 Brdu 单克隆抗体之后， 都会结合免疫荧光染色， 显示增殖的细胞， 同时结合其他细胞标记物， 进行双重染色， 可以判断增殖细胞的种类， 增殖细胞的增殖速度， 对研究细胞动力学有重要的意义， 因为组织细胞内没有内源性 Brdu 的存在， 所以这种方法用于检测细胞的增殖， 应用非常广。 另外， 通过 Brdu 染色法可以提供影像学相关的数据， 这比单纯采用MTT 法（只能提供简单的折线图） ， 要更富有视觉效果。 基于 Brdu 染色方法， 又演化迭代出 Edu 的染色方法。 Edu 也是一种胸腺嘧啶核苷类似物， 能够在 DNA 复制时期代替胸腺嘧啶， 渗入正在合成的 DNA 分子中。 而且在检测的时候， 直接采用荧光染料与 Edu 特异性反应， 直接准确地检测出 DNA 复制活性， 能更有效地检测细胞增殖现象。 C) MTT 法或者 Brdu 染色法， 这类技术都属于 End-point assay（终点分析法） 。 因为这类技术对于细胞都有破坏作用， 在检测过程中， 细胞已经死亡， 结构也不再完整。 因此， 有公司（例如罗氏） 研发了实时记录细胞增殖状态的设备和方法， 这种设备成为 RTCA（real time cell analyzer， RTCA） 。 RTCA 这类技术的特点就是实时（real time） 。 RTCA 实时细胞分析仪， 需要用到特定的细胞培养板（被称为 E-plate） ， 在 E-plate 每一个孔的底部都含有特制的电极。 电极的作用就是实时记录孔内的电阻抗（electric impedance） 。 当细胞在孔内发生粘附， 转移， 增殖的时候， 孔内的电阻抗发生变化， 被电 极实时记录， 研究者也就获得了相关的实时数据。 不过需要特别强调的是， 采用这种 RTCA的方法， 不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取， 也可以用来检测细胞的黏附， 细胞的凋亡、细胞的转移等等， 所以它的应用范围是非常广的。 （2） 检测细胞的克隆形成能力 肿瘤细胞由于恶性程度高， 因而还具有一类特殊的增殖能力--被称为克隆形成能力。 正常细胞在增殖的时候， 需要细胞与细胞之间的信号传递。 这些信号的存在， 使得正常细胞增殖过程中， 可以有序地受到调控。 但是肿瘤细胞具有高度的恶性， 它的增殖是不受调控的， 所以即便缺少细胞之间的交互和信号通路， 肿瘤细胞也可以由单独一个细胞， 增殖形成大量的子代细胞， 最终形成一个细胞克隆。 这种现象就被称之为克隆形成能力， 可以通过克隆形成实验， 加以检测。 对于干细胞， 也有一种类似于克隆形成实验的技术， 用于检测干细胞的增殖能力， 这种方法被称为“干细胞悬浮成球试验” （microsphere formation assay） 。 鉴定干细胞需要很多的指标， 能在离体条件下， 形成微球/悬浮球（microsphere） 是鉴定具有干性细胞的方法和指标之一。 3.组织层面检测增殖表型 （1） 检测分子标志物 临床上最容易获得的组织样本， 通常都是石蜡切片。 基于石蜡切片， 可以进行免疫组织化学IHC 的研究， 检测和增殖相关的分子标志物， 比如 PCNA 和 Ki-67。 （2） 细胞形态和组织结构上的差异 在临床组织样本当中， 除了检测和增殖表型相关的分子标志物之外， 还可以通过形态学的方式， 检测细胞形态的多样性和组织结构上的巨大差异。 通过石蜡切片的染色实验， 可以观察到恶性肿瘤细胞一般比正常细胞要大。 而且即便是同一种肿瘤， 在相同的组织部位， 肿瘤细胞的大小和形态也会很不一致， 很不均匀， 有时甚至会出现巨细胞。 在有些肿瘤细胞的细胞核内， 会出现细胞核体积增大的现象， 这就使肿瘤细胞的细胞核与细胞浆的比例异常。 肿瘤细胞的细胞核大小， 形状都很不均一， 甚至会出现巨核、双核、 多核或者是形态奇异的奇异型细胞核。 通过详细的形态学观察可以判定细胞发生了恶性增殖。 正常组织当中， 是由很多不同类型的细胞所组成。 不同类型的细胞在组织内， 以特定的、 有序的排列顺序， 组成了健康的组织。 但是在组织内发生肿瘤之后， 由于肿瘤细胞发生不受控制的恶性增殖， 并且挤压了周围的正常细胞， 导致整个正常组织内细胞的有序排列顺序被破坏， 组织内不同类型细胞的排列结构发生异常。 通过对于组织内部细胞排列顺序和排列结构的检测， 也能够获得肿瘤细胞发生恶性增殖的证据。 4.动物层面检测增殖表型 大部分的疾病类型都有与之相对应的， 可用于研究的动物模型。 在肿瘤研究当中， 用于研究增殖相关表型的动物模型， 最常见的就是移植瘤动物模型。 在移植瘤当中， 为了获取和增殖相关的表型， 通常要记录几个参数， 比较简单的有肿瘤的大小也就是体积， 其次是肿瘤的重量， 这些参数是反应肿瘤大小和细胞增殖特性， 最直观的数据。 有了移植瘤的样本之后， 我们还是可以通过降低维度的方式， 以移植瘤的样本作为检测对象， 检测分子标志物以及检测细胞相关的行为学和形态学。 二.总结 u200b

没有确定的最大和最小值，Cell Counting Kit-8（简称 CCK-8 ）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。 其 基本原理 为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基 苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

材料表面在 SBF 中形成磷灰石的能力能够反应材料在体内的生物活性，具体检测方法如下：1.SBF 配置由于SBF 溶液对于磷灰石过饱和，所以配备方法不恰当会导致溶液中磷灰石沉淀产生。整个配备过程需要确保溶液无色、透明，容器表面无沉淀出现，如果过程中产生沉淀，倒去溶液，洗净仪器重新配制。准备一个 1000ml 的塑料烧杯。首先于塑料烧杯中装好 700ml 离子交换蒸馏水、一个适当大小磁子，杯口密封以蒸发皿或塑料薄膜。搅拌并调节水温至 36.5±1.5C。按表1所列顺序在 36.5C 恒温下逐个溶解第一到第八个化合物，溶解过程表1 配置1000 ml SBF 溶液时试剂添加顺序、添加量 Order Reagents Amounts Containers Purities（%） Formula weights 1 NaCl 8.035 Weight paper 99.5 58.4430 2 NaHCO3 0.355 Weight paper 99.5 84.0068 3 KCl 0.225 Weight bottle 99.5 74.5515 4 K2HPO4·3H2O 0.231 Weight bottle 99.0 228.2220 5 MgCl2·6H2O 0.311 Weight bottle 98.0 203.3034 6 1.0 M-HCl 39ml Graduated cylinder — — 7 CaCl2 0.292 Weight bottle 95.0 110.9848 8 Na2SO4 0.072 Weight bottle 99.0 142.0428 9 Tris 6.118 Weight paper 99.0 121.1356 10 1.0 M-HCl 0-5ml Syringe — — 2.磷灰石形成能力测试对于密质薄片材料，测出样品尺寸并计算样品表面积精确到 2mm 应用如下公式计算出 SBF 用量：Vs=Sa/10,Vs（ml）是 SBF 的体积量，Sa（mm）表示样品的表面积。对于多孔材料，SBF 的用量应大于上式计算量准备好塑料瓶或烧杯，装入计算出的 SBF 体积量加热到 36.5C， 然后按示意图往里放置样品。 笔记：样品在容器中放置有两种情况，如图 1(a)，1(b)。少数情况下，SBF 溶液会生成同 质磷灰石沉积于样品表面。所以如果样品放置是图 A1(b)种情况，表征实验应该检测样品的 下表面。 四个星期内，分别取出恒温浸透不同时长的各组样品，纯水轻盈洗净。然后将样品放入干燥 器中常温干燥。图1 SBF中样品浸泡示意图 1.四唑盐（MTT）比色法：检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色法试验（MTT）。此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1x10^9个/L的但细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100ul。●将培养板置CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下，培养3-5天。●培养3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，继续置培养箱孵育3-6h，终止培养，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培养数小时，将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度（OD），选波长490nm。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，最好在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不会过满。另外，实验时设空白对照，比色时，以空白孔调零。3.2.2 CCK-8 法Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。● 制备细胞悬液：细胞计数● 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。● 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。●加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。●培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。●测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

EdU可以在DNA复制的时候掺入到新合成的DNA链中，通过一个“Click”反应，把荧光基团标记到新合成的含有EdU的DNA上面，这样我们就能通过检测荧光而知道细胞的增殖情况了！http://www.bioon.com.cn/news/showarticle.asp?newsid=14929&typename=技术前沿详情请见上面这个链接！

其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。优点1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT法；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

2。1、cck8的吸光度读数是针对不同的菌种和不同的培养基均不同，需要自己前期做一个标准曲线。2、也就是用培养基为空白对照，不同生长阶段发酵液为样品测定OD值，并测定这些阶段的活菌数，此后再按照发酵时间对比标准曲线得出单位活菌数。3、一般读数为2最合适，十几的话可能就是培养液中产生了吸光色素之类的。

我们在实验过程中,经常被该如何设计实验而困扰,不知从何下手开展实验,细胞实验作为被经常用到的体外实验,在科研工作中占有很大的比例。下面就盘点一下实验室常用的细胞实验技术1细胞增殖常用来检测细胞增殖的方法是CCK8法和Brdu法。CCK8主要通过分光光度计进行检测,OD只越高,说明存活的细胞越多,增殖能力强。Brdu是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中,最后通过荧光强度的变化来判定细胞的增殖能力。

cck8实验算出大于百分之百的存活率正常。细胞毒性通常是指在某一个药物处理浓度下细胞的死亡率，所以在某个浓度下细胞的存活率与100%之间无统计差异，那么就说在该浓度下是无毒的。但是如果笼统的说某个药物是否有毒，是在说该药物相对毒性大小，通常要比较IC50，即半数致死量。化疗药物的IC50通常<10uM，如果要说某个药物无任何毒性，那么其IC50值可能要>1mM。不过这个并没有严格的定义，你可以设计个阳性对照。基本概念意义：细胞增殖是生活细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特征。细胞的增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。方式：真核生物的分裂依据过程不同有三种方式，有有丝分裂，无丝分裂，减数分裂。其中有丝分裂是人、动物、植物、真菌等一切真核生物中的一种最为普遍的分裂方式，是真核细胞增殖的主要方式。减数分裂是生殖细胞形成时的一种特殊的有丝分裂。

cck-8孵育时间1~2h足够，孵育前将孔里原来的 液体吸尽，cck-8与新鲜培养基按照1：10比例混匀后，每孔加入100ul,孵育1h，上机检测OD450。

CCK-8计算增殖速率有两种方法，一种是绘制生长曲线，计算线性阶段的吸光度的均值另一种是计算某时间点的（实验组与对照组吸光度的差值）/对照组的比率

不能。1、CCK8可以检测大肠杆菌，但不能在一个板子上检测ros细胞，需要分开测量。2、在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。

6孔板的情况下直接加药，无需更换培养基，记得两组的细胞浓度要稀释到差不多

建议用CCK8，可以直接加CCK8到细胞内

查查与其同源的基因在其它生物尤其是亲缘关系很近的生物体内有没有已经被证明功能的，或者猜想与什么功能有关的。寻找突变体（该基因缺失的个体）或者设计序列沉默该基因，然后观察其表型和正常个体有什么差别。寻找该基因过量表达的个体，观察表型和一般个体的差异，也可以作为一个参考。这些知识给你的研究提供思路，最后你要克隆得到该基因，在一个该基因缺失的突变体（株）内表达该基因，如果你在该个体内检测到表达并且该个体和一般个体性状差异消失，那么证明该个体是控制此性状的基因（之一）。

额。 96个孔除去你加的8个对照品而外，其他的孔全部用来加样品，88孔，88种样品（按照的说法的话，88个孔可以同时检测88个病人的某一指标），也就是可以检测88种样品的结果，如果你每个样品准备做复孔求平均值的话，可以检测44种样品。

DMSO可以提高PCR的特异性，帮助扩增一些难扩的模板。但要摸索，量大的话会抑制扩增，而且最好用于扩增1KB以上模板。

不需要，如果你的药物需要饥饿处理，那就另当别论，就CCK8检测而言是不需要的。

标准曲线法中为消除试剂影响，最适合用十字校验来进行零点校正，通过对十点四个角和方向来进行的这种情况也可以，更好更准确完成校验

终点法。一、实验原理：细胞活力检测试剂盒(CCK-8)可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】。在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪_硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。二、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。三、优点：使用方便，无需洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂。CCK-8法能快速检测。CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度。CCK-8法的重复性优于MTT法，产生的formazan是水溶性的，减少因洗涤和溶解带来的误差。CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT方法相比线性范围更宽，灵敏度更高。CCK-8细胞活性检测试剂无需预制，即开即用。

细胞增殖的研究方法有很多，主要包括：BrdU，EdU，CCK8等方法。CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒是西安百萤生物生产的一种基于 SST-8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。其主要成分为水溶性四唑盐 SST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，SST-8 是一种类似于 MTT 的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜（formazan，参考图1)。SST-8 被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜能够直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系

cck8实验怎么看有没有细胞毒性CCK-8是一种基于WST-8的检测细胞增殖和细胞毒性的方法。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。数据呢，一般根据原始资料来选择统计分析方法，肿瘤细胞cck8增值这是什么，这个一般是计量资料，如果符合正态分布及方差齐性检验，可以用t检验或方差分析，不符合可以采用非参数检验，即秩和检验。

数据呢，一般根据原始资料来选择统计分析方法，肿瘤细胞cck8增值这是什么，这个一般是计量资料，如果符合正态分布及方差齐性检验，可以用t检验或方差分析，不符合可以采用非参数检验，即秩和检验。

cck8实验怎么看有没有细胞毒性CCK-8是一种基于WST-8的检测细胞增殖和细胞毒性的方法。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。数据呢，一般根据原始资料来选择统计分析方法，肿瘤细胞cck8增值这是什么，这个一般是计量资料，如果符合正态分布及方差齐性检验，可以用t检验或方差分析，不符合可以采用非参数检验，即秩和检验。

一、含义不同：空白试验是指在不加试样的情况下按试样分析，规程在同样的操作条件下进行的分析。所得结果的数值为空白值。然后从试样测得结果中扣除此空白值就得到比较可靠的分析结果。对照实验就是进行两组实验，控制变量，比较不同。二、作用不同：对照组采用一种无药理作用的假药，它在药物剂型或处置上不能为受试者识别，称安慰剂。用现有标准方法或常规方法做对照。这种对照在临床试验中用得较多，因为很多情况下不给病人任何治疗是不符合医德的。另外，还可用于某种新的检验方法是否能代替传统方法的研究。条件对照指虽给对象施以某种实验处理，但这种处理是作为对照意义的，或者说这种处理不是实验假设所给定的实验变量意义的。例如，“动物激素饲喂小动物”实验，采用等组实验法，其实验设计方案是：甲组：饲喂甲状腺激素（实验组）；乙组：饲喂甲状腺抑制剂（条件对照组）；丙组：不饲喂药剂（空白对照组）。显然，乙组为条件对照，该实验既设置了条件对照，又设置了空白对照，通过比较、对照，更能充分说明实验变量——甲状腺激素能促进动物的生长发育。以上内容参考：百度百科-空白对照组

不变颜色最好，变了没准是污染了。如果是观察细胞死活状态什么的，推荐用显微镜观察、细胞计数什么的。推荐注意拍照，保存好实验记录。

玛郁琳。玛郁琳，Mayurin Pongpudpunth，昵称Kik，泰国著名演员。主要作品《爱在日落之前》《花环夫人》《明天我依然爱你》《天使之争》等。参演的多部作品被引入中国，饰演《爱在日落之前》中的海岚被中国观众熟知，受到了广大观众的喜爱。

1、月明星稀，汉语成语，拼音是yuè míng xīng xī，意思是月亮明亮时，星星就显得稀疏了。出自《短歌行》。 2、三国·魏·曹操《短歌行》：“月明星稀，乌鹊南飞。绕树三匝，何枝可依？” 3、用法：联合式；作宾语、定语；指夜晚。

你可以把蜡烛放在门缝下面（楼道和屋内创造冷热不均），火苗飘向屋里；如果把蜡烛放在门缝的上面，火苗是飘向楼道的。 这个现象其实用的是地理学中的热力环流原理。根本原因就是地面上有冷的地方，有冷的地方，即冷热不均。

我发现这个问题下绝大多数的回答都是偏离背景，偏离诗的本意的，曹操这句诗的本意是：暗示天下贤士不要三心二意，要善于择良枝而栖，意思是我曹操就是个良枝，天下贤士不要犹豫了，快来我这里吧！月明星稀，乌鹊南飞。绕树三匝，何枝可依？译文：月光明亮星光稀疏，一群寻巢乌鹊向南飞去。绕树飞了三周却没敛翅，哪里才有它们栖身之所？“月明”四句既是准确而形象的写景笔墨，也有比喻的深意。清人沈德潜《古诗源》中说：“月明星稀四句，喻客子无所依托。”实际上是说那些犹豫不决的人才，在三国鼎立的局面下一时无所适从。诗人以乌鸦绕树、“何枝可依”的情景来启发他们，不要三心二意，要善于择枝而栖，赶紧到我这边来。最后“周公”四句画龙点睛，明明白白披肝沥胆，希望人才都来归顺我曹操，点明了全诗的主旨。关于“周公吐哺”的典故，据说周公自言：“吾文王之子，武王之弟，成王之叔父也；又相天下，吾于天下亦不轻矣。然一沐三握发，一饭三吐哺，犹恐失天下之士。”这话似也表达诗人心情。（参考古诗文网）

Solid Snake收起Solid SnakeLiquid SnakeSolidus SnakeRaidenRosemaryThe BossEVASunnyMeryl SilverburghColonel Roy CampbellMei LingHal EmmerichDr. Naomi HunterMaster McDonnell MillerNastasha RomanenkoRevolver OcelotVulcan RavenSniper WolfPsycho MantisDecoy OctopusGray FoxBig BossDonald AndersonKenneth BakerJim HousemanJohnny Sasaki Solid Snake亦称：Snake国籍：美国身高：182厘米体重：75公斤年龄：30至40岁登场作品：Metal Gear，Metal Gear 2: Solid Snake，Metal Gear Solid，Metal Gear Solid 2: Sons of LibertySolid Snake是魔童计划中Big Boss的克隆体之一，这其中还包括Liquid Snake，也许还有Solidus Snake。他的诞生是为了使Liquid Snake得到显性基因，但是Liquid却被告知Snake是优等的，而Snake更是连魔童计划都不知道。在其年轻时，美国将Snake训练成一名战士。凭借高达180的智商，Snake学会了流利的讲六种语言、跳伞、斯库巴潜水(戴自携式潜水呼吸器潜水)，以及各式各样的技能。他于90年代初加入猎狐犬接受训练，最终获得仅次于“Fox”的代号“Snake”。Snake结识并与Gray Fox成为好友，Gray Fox是猎狐犬唯一得到“Fox”称号的成员。时任猎狐犬指挥官的Big Boss认为Snake只不过是一个新手。1995年，Gray Fox被派往潜入军事国家Outer Heaven收集情报。但他却被捕了，他传回的最后一则信息中提到了Metal Gear，一辆步行核武战车。Big Boss命令Solid Snake去寻找Fox，并完成其未竟的使命，任务代号“N313侵扰行动(Operation Intrude N313)”。Snake似乎有所疑虑，但还是潜入并解决了沿途的雇佣士兵，穿越重重阻碍，救下了Gray Fox，最终发现Outer Heaven的首领——竟然是Big Boss!没错，Big Boss，世界上最优秀的战士之一，猎狐犬的指挥官，同时也是通过送话器给予Snake信息支持的人。Snake认为这就解释了为什么Big Boss派Snake，一个新手，来执行这次任务了。Snake摧毁了Metal Gear TX-55，并战败了Big Boss。基地即将爆炸，Snake脱出，Big Boss趁乱得以逃脱。任务结束后，他决定退役，居住在加拿大山区，但却被美国中央情报局(CIA：Central Intelligence Agency)给找到了，为他们做了6个月的特工后，Snake受够了那里的体制，毅然离去。之后，他做了一名雇佣兵，随后再次退役，隐居于加拿大山区。但是，1999年，他再一次被招回，这次是由Outer Heaven危机后猎狐犬的新领袖Colonel Campbell。名为桑给巴尔国(Zanzibar Land)的军事国家正在中东逐步建立，他们刚刚劫持了以发现石油提纯剂“OILIX”而闻名的捷克科学家Kio Marv博士。Snake必须潜入桑给巴尔国，找到Kio Marv博士，并夺回“OILIX”的配方。Snake接受了任务，并携雷达及改进的送话器前往桑给巴尔国。Snake发现桑给巴尔国的始作俑者居然是Big Boss，而自己的老友Gray Fox，则跟随着其前任指挥官，现在已然是该地雇佣军的领袖了。Snake同时发现Pettrovich博士，Metal Gear TX-55的设计者，被桑给巴尔国的士兵“挟持”来设计一款新型的Metal Gear——Metal Gear D。之后，Snake与Gray Fox操纵的Metal Gear D展开了战斗，并获知Pettrovich博士并不是被挟持来的，他是被雇佣来开发Metal Gear，并合伙绑架Kio Marv的——他一直嫉妒并最终杀害的那个人。Snake与Gray Fox在一片雷区里展开战斗，并把Fox打到一颗地雷上。在他们做了最后一番交谈后，Fox死去了。随后，Snake与Big Boss会面了，他告诉Snake他就是Snake的父亲。这使Snake更加仇恨他，他们展开了一对一的战斗，Snake最终杀死了Big Boss。借助一架直升机，Snake和他在那里遇见的一位中情局间谍Holly White逃离了该地。Snake再次离开了猎狐犬，而这一次，他住进了阿拉斯加双子湖畔的一间小木屋中。在经历了Outer Heaven及桑给巴尔国事件后，Snake患上了创伤后压力心理障碍症(PTSD：Post-Traumatic Stress Disorder)，这使得他几近疯狂。为了消磨时光，忘记过去，Snake当上了狗拉雪橇赛手，并拥有了自己的爱斯基摩犬。这种平静的生活在2005年被打断了，他被同样被迫复出的Colonel Campbell招回执行任务。猎狐犬似乎违抗命令，并伙同基因部队占据了Shadow Moses。在被剥衣搜身，并注射了纳米机器后，Snake得知Campbell也是被迫参与这次任务的，因为他的侄女Meryl也被派去那里，现在正与ArmsTech总裁Kenneth Baker和DARPA局长Donald Anderson一并关押着。叛军要的是Big Boss的遗体。Snake潜入Shadow Moses，并发现Metal Gear REX藏在那里。任务计划中，Snake应该营救的人质——Anderson和Baker，都在他面前死去了，看起来似乎是由于心脏病发作。事实上，罪魁祸首是注射入Snake体内的纳米机器上所携带的FoxDie病毒。Snake遇见了Meryl，她帮助Snake找到了Metal Gear REX的设计者Hal Emmerich。Snake遇见了一名生化忍者，并与他展开战斗，这才发觉他就是Gray Fox!一仗打下来，Fox跑去服用药物去了，这是他作为生化忍者这一新生所时常需要的。Snake见到了Hal，而他更愿意被称为Otacon。Otacon说他根本不知道Metal Gear搭载了核武器，并哭诉他的家族总是与核武器有着千丝万缕的联系。他答应协助Snake摧毁REX。Snake与Meryl碰头后，一起前往通讯塔。Meryl被Sniper Wolf射中，二人双双被捕，并被Revolver Ocelot施以酷刑。Ocelot与Snake玩了个游戏：Snake在受刑期间如果屈服，Meryl就会被处死。Snake得以胜过Ocelot，并借助Otacon逃了出去，但是Meryl却被Ocelot强暴了，因为他就是这样一个另人作呕的老杂种。Snake前往贮藏Metal Gear的地下区域。在路上，他被告之Naomi是另一组织派来的间谍，她还是Gray Fox认养的妹妹。为了报仇，她似乎修改了FoxDie病毒，以便Snake也会没命。Snake理解Naomi的苦衷，只是问她自己何时会死，因为他还有一件事要做。Naomi还没来得及回答，就被Colonel切断了通话，并拘捕起来了。Snake对此十分愤怒，因为他发现被注射FoxDie病毒也早就是计划中的一部分。然而，他继续前行并弄清了PAL密码卡是如何使用的。但是，他是在使用过之后才弄清的，他亲手启动了REX!Master Miller嘲笑Snake，并挑明自己的真实身份——Liquid Snake!Snake发现Liquid就在附近，他们交谈了一番。Liquid跳进REX的驾驶舱，启动了它。Otacon将REX的弱点告诉了Snake，于是Snake不停的向那里发射毒刺导弹。但这并没造成足够的伤害，Liquid想要用REX一脚踩死Snake，但是Gray Fox得以摧毁其弱点，并与Snake谈了一番话。Liquid乘坐Metal Gear REX一脚踩碎了Fox的外部骨骼。Snake真的发火了，并向已经暴露在外的REX驾驶舱发射导弹，Snake甚至能看到他的兄弟正在操纵它。Snake成功的使Metal Gear爆毁了，而冲击波却震昏了Snake。这时，Liquid向他走来，扛起他，把他抬到已经损坏了的Metal Gear顶部。Snake醒来时，发现Liquid就在他面前。他们谈了一番话，最后Liquid提到一队飞机已被派来Shadow Moses炸毁一切。在与Colonel联络后，Snake发现这都是真的，但是Colonel说他将会试着延迟这场轰炸。然而，国防部长Jim Houseman逮捕了Campbell，并嘲笑Snake。Houseman问Snake是否有Metal Gear REX的测试数据，但是Ocelot已经把它从Snake那里偷走了。Houseman说轰炸将会掩盖整件阴谋，以及魔童计划。Liquid让Snake看到Meryl正在一旁昏睡，身上绑着炸弹。Liquid启动了炸弹的定时器，二人在REX的顶部展开了赤手空拳的战斗。Snake将Liquid打下了REX，并解除了炸弹。他唤醒了Meryl，他们接到Otacon的呼叫，说他将会留下来开启所有的门，以便他俩能够尽快逃离。Snake试图劝说他自保性命，但是Otacon心意已决。于是Snake向他道了谢，并与Meryl共同离开。然而，Liquid仍然活着，在Meryl与Snake乘坐一辆吉普逃离Shadow Moses时，他又追了上来。两车在基地外相撞，Snake和Meryl被困在了吉普车下。就在Liquid快要向Snake开枪时，FoxDie要了他的命。Meryl找到了一条bandanna，它能使Snake拥有无限弹药。Snake让Campbell指派搜索队寻找Hal Emmerich，因为他仍然在Shadow Moses内。Naomi终于得以和Snake谈话，但当被问及FoxDie何时会影响到Snake时，她只是叫他“好好活下去”。此后，Snake和Meryl前往阿拉斯加，并在那里共同生活。

翻译出来是 IWill love you silently

一、基本工资:办事员2800元;科员3000元;副科级3100元;正科级3300元;副处级3600元;正处级4000元;副厅级4400元;正厅级5000元;副部级5500元;正部级6000元。办事员三周年按科员对待;科员五年按副科级对待;副科级十周年按正科级对待;正科级十周年按副处级对待;副处级十周年按正处级对待;正县级十五周年按副厅对待;副厅级二十周年按正厅级对待;初次套改以累计年限对应的职务待遇确定基本工资。二、工龄工资:每年60元,以虚年计算,按月发放。三年一调。三、奖励工资:每月300元,年度考核不合格者次年1月停发,直至考核合格的次年1月继续发放。三年一调。

1、 蝴蝶效应（The Butterfly Effect），首先在气象学中被描述，后来应用于广泛的混沌现象中，而主要是混沌学中的。它是指在一个动力系统中，初始条件下微小的变化能带动整个系统的长期的巨大的连锁反应。 2、之所以用“蝴蝶”，那是因为蝴蝶的翅膀煽动更微弱，因而说这种煽动能引起飓风，就显得更夸张，效果更惊人。事实上，蝴蝶效应的首先阐述人是气象学家爱德华·洛伦兹，他刚开始用的比喻确实是“一只海鸥的煽动就能引起明显的天气变化”，而后来，他为了更加夸张一点地，诗意一点地阐述自己的意思，就把蝴蝶效应描述为“南美洲亚马孙雨林中蝴蝶的翅膀扇动，就能在美国的德克萨斯州引起飓风”。热带雨林中生物繁多，而蝴蝶肯定是不起眼的，而就是这种不起眼的东西的微弱动作都在遥远的地方能引起很大气候变化，这对人来说是多么印象深刻啊！美国的德克萨斯州发生飓风的几率是很大的，而且破坏也大，所以对于美国人来说，德克萨斯的飓风也是令人印象深刻的。总之，“蝴蝶效应”只是一个诗意夸张的描述而已。

歌曲名:Silently歌手:Elliot Minor专辑:Elliot MinorElliot Minor - SilentlyTake your swing and fallPass through the turn tableAnd fall a first timeStanding so far awayAnd so we"ll saySo silentlyYou make this daySo sureal and neverendingStanding on the edge believingThat this will never endAs the day gets olderI hear your voiceNothing stays for freeAs the rain keeps fallingI hear you calling my nameAnd so we"ll saySo SilentlyYou make this daySo unreal and never-endingStanding on the edge believingThat this will never endThis will never endSilentlySo SilentlySo SilentlySo SilentlyYou make this daySo unreal and never-endingStanding on the edge believingThis waySo silentlyYou make this daySo unreal and neverendingStanding on the edge believingThat this will never endThis will never endThis will never, this will never endLarry Cheng & Kevin Boul, share with u!http://music.baidu.com/song/2167154

A、晴朗天空呈蔚蓝色是由于大气对太阳辐射的散射作用，故不符合题意；B、白天海洋温度低大气下沉形成高压，陆地温度高大气上升形成低压，故形成热力环流，故正确；C、多云的白天（阴天）大气对太阳辐射的削弱作用强，气温不高，与大气的受热过程有关，故不符合题意；D、北方春季气候干旱、少雨，这造成土质疏松，加上春季冷空气和气旋活动频繁下形成的大风，与热力环流无关，故不符合题意．故选：B．

Naomi Soledad Leon Outlaw has had a lot to contend with in her young life, her name for one. Then there are her clothes (sewn in polyester by Gram), her difficulty speaking up, and her status at school as "nobody special." But according to Gram, most problems can be overcome with positive thinking. And with Gram and her little brother, Owen, life at Avocado Acres Trailer Rancho in California is happy and peaceful...until their mother reappears after seven years of being gone, stirring up all sorts of questions and challenging Naomi to discover and proclaim who she really is. Naomi Soledad Leon在她的年轻生命中有很多东西要担心，她的名字就是其中一个。 然后是她的衣服(由奶奶缝的)，她说话的困难，和她在学校被当做“不是任何一个人”。 但是根据奶奶，多数问题可以用积极的态度去克服。和奶奶及小弟弟欧文，她在加利福尼亚州的Avocado Acres Trailer Rancho的生活是愉快和和平的… 直到他们的母亲在出走七年后重新出现，带来了各种各样的问题，让Naomi发现和宣告（公布）她真实的身份。 我自己译的，proclaim不是很确定。其他还蛮通顺的啦~Well，对你有用吗？

是一个社交软件 外国人常用

B 本题考查热力环流。由于地面冷热不均而形成的空气环流，它是大气运动最简单的形式。受热地区空气上升，近地面气压低，受冷地区空气下沉，近地面气压高，高压处等压面向上凸起；低压处等压面向下凹陷。所以本题选择B选项。

不是，二手商家，质量不一样

静悄悄extremely quiet 另，有个副词也可以用：soundlessly 静悄悄地

工程热物理学的解释 简称“工程热物理”。物理学的一个分支。 研究 一切与热有关的物理现象， 探索 化学能转换为热能，热能转换为机械能(或电能)，热能的传递、输送和有效 利用 的基本 规律 。主要包括工程热力学、传热传质学、流体力学和燃烧学等。 词语分解 工程的解释 将 自然 科学的理论应用到 具体 工农业生产部门中形成的各学科的总称。如:水利工程、化学工程、土木建筑工程、遗传工程、系统工程;;亦称;工程学; 用较大而复杂的设备来进行的工作。如:城市改建工程、京九铁路 物理学的解释 自然科学的一个 基础 部门。研究 物质 的基本构造和物质 运动 的最一般规律。在希腊文中，它原意“自然”。在古代欧洲，是自然科学的总称。在化学、天文学、地学、生物学等分别从自然科学中独立出来以后，物理学的规律和研

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蝴蝶线就是一件小事，能够引发一件大事。不同事件的叠加能够导致很大的后果。

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它西起重庆市白帝城，东到湖北省南津关，是一段山水壮阔的大峡谷，是中国十大风景名胜之一，30年间它一直屹立在那里，成为了不夜之城。