加入cck8后培养基应该变成什么颜色

在电子耦合试剂（也就是细胞是活的，有呼吸，有能量代谢）存在的情况下，可被NAD+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan)。活细胞越多，产生的Formazan就越多，颜色也会越深。Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基－4-硝苯基）－3-(4-硝苯基）－5-(2,4-二磺基苯）－2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。研究方法细胞增殖的研究方法有很多，主要包括：BrdU，EdU，CCK8等方法。其中EdU检测方法是最新的细胞增殖检测方法。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。

增殖是一种在生物医学领域内， 非常常见的表型， 甚至可以说是最常见的一种表型。 细胞增殖是高等生物体最为重要的生命特征。 高等动物体内的细胞，主要有两种增殖的方式。第一种是体细胞的增殖方式： 有丝分裂。 有丝分裂也是最常见的一种增殖方式。 在有丝分裂的过程中， 2 倍体的体细胞在经过有丝分裂之后， 产生两个都是 2 倍体的后代细胞；另一种是性生殖细胞所采用的增殖方式， 被称为减数分裂。 减数分裂最大的特点是， 2倍体的性生殖细胞， 经过减数分裂后， 形成 2 个单倍体的后代细胞。 由于细胞在分裂前是 2 倍体， 而分裂后变成了单倍体， 使得细胞内的染色体数目变成了原先的一半， 因此得名“减数分裂” 。 增殖是最为常见的表型。 无论是正常生理条件下， 还是异常的病理条件下， 无论是正常的细胞， 还是异常的细胞， 增殖现象都是普遍存在的。 一.增殖表型如何检测？ 1.分子层面检测增殖表型 有些分子的表达和增殖的表型有密切的关系， 因此， 只要能检测到这些特定分子的表达， 就表征了增殖现象的发生。 这类分子就是增殖的 marker 分子。 常见的和增殖相关的 marker 分子有如下几种： （1） 与增殖相关的分子标志物 A) MCM （微小染色体维持蛋白， minichromasome maintenance protein， MCM） 。 MCM只存在于真核细胞中。 MCM 在有丝分裂的晚期和 G1 期与染色质紧密结合， 在 S 期和G2 期分开。 MCM 蛋白只在细胞的增殖期才能检测到， 它的表达在 G1/S 转换点达到峰值， 在分化期和静息期时， 表达缺失， 因此可以作为细胞增殖的特殊标志物。 B) 细胞核相关抗原 Ki-67。 这个分子是经典的细胞增殖相关分子标志物， 最早在 1983年在增殖细胞中发现， 目前在病理诊断中使用非常地广泛。 Ki-67 的一级结构比较特殊，还没有发现与之同源的蛋白， 所以目前对于 Ki-67 的功能了解得不多。 推测它可能具有如下的几个功能： 1） 推测 Ki-67 可以调节细胞周期； 2） Ki-67 能和 DNA 或者 RNA 发 生相互结合； 3） Ki-67 在细胞分裂期参与合成核糖体。 Ki-67 在细胞的 G0 期不表达，G1 中期到后期出现表达， S 期和 G2 期表达逐渐增加， 有丝分裂期达到高峰， 细胞分裂后迅速降解。 C) 增殖细胞核抗原 PCNA。 PCNA 又称为周期素， 它是 DNA 聚合酶δ的辅助蛋白。 这个分子也是经典的增殖相关分子标志物， 最早在 1978 年就有所报道。 又因为 PCNA 出现在增殖期细胞的细胞核中， 所以被称之为增殖细胞核抗原。 PCNA 的主要功能有： 1）DNA 聚合酶δ的辅助蛋白； 2） 参与 DNA 损伤的修复； 3） 参与细胞周期的调控； 4）和 p21 相互作用。 P21 是 CDK 的抑制因子， 因此 PCNA 通过和 p21 相互作用， 间接影响细胞周期和增殖。 在增殖细胞的细胞周期中， PCNA 的量会发生明显变化， 它在 G0/G1期几乎没有表达， G1 晚期表达大幅度增加， S 期达到高峰,G2/M 期表达下降。 PCNA 也已经广泛应用于临床病理诊断和相关的生物学研究中。 PCNA 和 Ki-67 作为细胞增殖标志物， 所存在的一些缺陷。 PCNA 和 Ki-67在 G1 早期不表达， 因此在整个细胞周期过程中， 存在表达时间上的间隙。 另外 PCNA 在DNA 修复和复制过程中， 发挥了作用， 这会导致结果的“假阳性”。 就是说某些没有发生增殖， 但是发生了 DNA 修复的细胞， 也会上调 PCNA 的表达， 这会让研究者误以为细胞发生了增殖。 Ki-67 也会有类似假阳性现象的存在， 比如说 Ki-67 的表达水平， 会受到外部因素的影响， 比如在营养缺乏的时候。 MCM 蛋白相对于 PCNA 和 Ki-67 而言， 很大的优势在于整个细胞周期中都有表达， 而且它不受 DNA 损伤修复和其他外部因素的影响。 因此有的研究者认为， MCM 蛋白是优于 PCNA 和 Ki-67 的理想的细胞增殖标志物。 但是从实际的应用层面看， 无论是在临床应用当中， 还是在基础科研当中， PCNA 和 Ki-67 的应用， 都更加广泛。 （2） 和干细胞相关的分子标志物 根据肿瘤干细胞的理论， 肿瘤干细胞是肿瘤中， 具有自我更新的能力并且能够产生异质性的肿瘤细胞。 肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖， 维持了肿瘤细胞群的生命力。 因此， 如果通过肿瘤干细胞相关分子标志物的检测， 证实肿瘤干细胞的数量增加， 这就提示肿瘤的恶性程度高， 间接地说明了肿瘤增殖能力的增强。 例如， CD44 是胰腺癌中肿瘤干细胞常用的分子标志物， 因此可以通过检测 CD44 的表达水平， 证实胰腺癌中肿瘤干细胞的情况， 间接地证实肿瘤细胞增殖能力的强弱。 但是采用这种方法是具有局限性的， 因为不同肿瘤的肿瘤干细胞分子标志物是不同的。 而且在很多肿瘤当中， 肿瘤干细胞的标志物， 还存在很大的争议。所以我个人的建议是， 直接检测 PCNA 或者 Ki-67 之类的细胞增殖相关标志物更好更直接；检测肿瘤干细胞相关的分子标志物， 只能间接地说明肿瘤细胞的恶性增殖情况， 只能算是锦上添花而已。 （3） 检测抑癌基因 检测抑癌基因相关的分子标志物也是一类和细胞增殖间接相关的分子标志物。检测这一类分子标志物， 它存在着如下的一种逻辑推理的过程， 首先， 在细胞内抑癌基因的表达水平或者活性明显下降， 就提示肿瘤的恶性程度明显提升， 间接地说明了肿瘤的恶性增殖表型会有所增加。 在这一类分子标志物当中常见的抑癌基因有两个： p53 和 PTEN。 经常可以看到在论文当中， 通过 western 或者 qPCR， 证实 p53 以及 PTEN 分子表达水平降低， 从而间接地说明肿瘤细胞恶性程度上升， 肿瘤的增殖表型也会显著的提升。 2.细胞层面检测增殖表型 （1） 直接检测细胞的增殖状态 A） 最为经典的方法是 MTT 法。 MTT 是一种染料。 它的检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞没有这个现象。 DMSO 能溶解细胞中的甲瓒， 最后用酶标仪在特定的波长处， 测定光吸收值， 可间接反映活细胞的数量。 MTT 法早已成为研究细胞增殖的经典方法。 后续基于类似的实验原理，还在 MTT方法的基础之上，演化出了各种不同的替代技术，比如 CCK8染色实验等等。 在做 MTT 实验的时候， 通常取 5 个时间点（通常就是 5 天） 。 把 5 天中每一天的吸光度数据都记录下来， 最后形成一条细胞增殖的曲线。 通过比较不同处理方式或者不同实验组之间， 细胞增殖曲线的高低， 就可以判断细胞增殖情况的快慢。 B） 另一种经常用于检测细胞增殖的经典方法是 Brdu 染色法。 Brdu 是胸腺密啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的 DNA， 可以代替胸腺嘧啶， 选择性地整合到复制细胞新合成的DNA 中。 这种渗入可以稳定存在， 随着 DNA 的复制， Brdu 可以进入子代细胞中。 Brdu 特异性抗体可以用于检测 Brdu 在细胞 DNA 中的渗入， 从而判断细胞增殖能力的变化。 通常在使用 Brdu 单克隆抗体之后， 都会结合免疫荧光染色， 显示增殖的细胞， 同时结合其他细胞标记物， 进行双重染色， 可以判断增殖细胞的种类， 增殖细胞的增殖速度， 对研究细胞动力学有重要的意义， 因为组织细胞内没有内源性 Brdu 的存在， 所以这种方法用于检测细胞的增殖， 应用非常广。 另外， 通过 Brdu 染色法可以提供影像学相关的数据， 这比单纯采用MTT 法（只能提供简单的折线图） ， 要更富有视觉效果。 基于 Brdu 染色方法， 又演化迭代出 Edu 的染色方法。 Edu 也是一种胸腺嘧啶核苷类似物， 能够在 DNA 复制时期代替胸腺嘧啶， 渗入正在合成的 DNA 分子中。 而且在检测的时候， 直接采用荧光染料与 Edu 特异性反应， 直接准确地检测出 DNA 复制活性， 能更有效地检测细胞增殖现象。 C) MTT 法或者 Brdu 染色法， 这类技术都属于 End-point assay（终点分析法） 。 因为这类技术对于细胞都有破坏作用， 在检测过程中， 细胞已经死亡， 结构也不再完整。 因此， 有公司（例如罗氏） 研发了实时记录细胞增殖状态的设备和方法， 这种设备成为 RTCA（real time cell analyzer， RTCA） 。 RTCA 这类技术的特点就是实时（real time） 。 RTCA 实时细胞分析仪， 需要用到特定的细胞培养板（被称为 E-plate） ， 在 E-plate 每一个孔的底部都含有特制的电极。 电极的作用就是实时记录孔内的电阻抗（electric impedance） 。 当细胞在孔内发生粘附， 转移， 增殖的时候， 孔内的电阻抗发生变化， 被电 极实时记录， 研究者也就获得了相关的实时数据。 不过需要特别强调的是， 采用这种 RTCA的方法， 不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取， 也可以用来检测细胞的黏附， 细胞的凋亡、细胞的转移等等， 所以它的应用范围是非常广的。 （2） 检测细胞的克隆形成能力 肿瘤细胞由于恶性程度高， 因而还具有一类特殊的增殖能力--被称为克隆形成能力。 正常细胞在增殖的时候， 需要细胞与细胞之间的信号传递。 这些信号的存在， 使得正常细胞增殖过程中， 可以有序地受到调控。 但是肿瘤细胞具有高度的恶性， 它的增殖是不受调控的， 所以即便缺少细胞之间的交互和信号通路， 肿瘤细胞也可以由单独一个细胞， 增殖形成大量的子代细胞， 最终形成一个细胞克隆。 这种现象就被称之为克隆形成能力， 可以通过克隆形成实验， 加以检测。 对于干细胞， 也有一种类似于克隆形成实验的技术， 用于检测干细胞的增殖能力， 这种方法被称为“干细胞悬浮成球试验” （microsphere formation assay） 。 鉴定干细胞需要很多的指标， 能在离体条件下， 形成微球/悬浮球（microsphere） 是鉴定具有干性细胞的方法和指标之一。 3.组织层面检测增殖表型 （1） 检测分子标志物 临床上最容易获得的组织样本， 通常都是石蜡切片。 基于石蜡切片， 可以进行免疫组织化学IHC 的研究， 检测和增殖相关的分子标志物， 比如 PCNA 和 Ki-67。 （2） 细胞形态和组织结构上的差异 在临床组织样本当中， 除了检测和增殖表型相关的分子标志物之外， 还可以通过形态学的方式， 检测细胞形态的多样性和组织结构上的巨大差异。 通过石蜡切片的染色实验， 可以观察到恶性肿瘤细胞一般比正常细胞要大。 而且即便是同一种肿瘤， 在相同的组织部位， 肿瘤细胞的大小和形态也会很不一致， 很不均匀， 有时甚至会出现巨细胞。 在有些肿瘤细胞的细胞核内， 会出现细胞核体积增大的现象， 这就使肿瘤细胞的细胞核与细胞浆的比例异常。 肿瘤细胞的细胞核大小， 形状都很不均一， 甚至会出现巨核、双核、 多核或者是形态奇异的奇异型细胞核。 通过详细的形态学观察可以判定细胞发生了恶性增殖。 正常组织当中， 是由很多不同类型的细胞所组成。 不同类型的细胞在组织内， 以特定的、 有序的排列顺序， 组成了健康的组织。 但是在组织内发生肿瘤之后， 由于肿瘤细胞发生不受控制的恶性增殖， 并且挤压了周围的正常细胞， 导致整个正常组织内细胞的有序排列顺序被破坏， 组织内不同类型细胞的排列结构发生异常。 通过对于组织内部细胞排列顺序和排列结构的检测， 也能够获得肿瘤细胞发生恶性增殖的证据。 4.动物层面检测增殖表型 大部分的疾病类型都有与之相对应的， 可用于研究的动物模型。 在肿瘤研究当中， 用于研究增殖相关表型的动物模型， 最常见的就是移植瘤动物模型。 在移植瘤当中， 为了获取和增殖相关的表型， 通常要记录几个参数， 比较简单的有肿瘤的大小也就是体积， 其次是肿瘤的重量， 这些参数是反应肿瘤大小和细胞增殖特性， 最直观的数据。 有了移植瘤的样本之后， 我们还是可以通过降低维度的方式， 以移植瘤的样本作为检测对象， 检测分子标志物以及检测细胞相关的行为学和形态学。 二.总结 u200b

没有确定的最大和最小值，Cell Counting Kit-8（简称 CCK-8 ）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。 其 基本原理 为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基 苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

材料表面在 SBF 中形成磷灰石的能力能够反应材料在体内的生物活性，具体检测方法如下：1.SBF 配置由于SBF 溶液对于磷灰石过饱和，所以配备方法不恰当会导致溶液中磷灰石沉淀产生。整个配备过程需要确保溶液无色、透明，容器表面无沉淀出现，如果过程中产生沉淀，倒去溶液，洗净仪器重新配制。准备一个 1000ml 的塑料烧杯。首先于塑料烧杯中装好 700ml 离子交换蒸馏水、一个适当大小磁子，杯口密封以蒸发皿或塑料薄膜。搅拌并调节水温至 36.5±1.5C。按表1所列顺序在 36.5C 恒温下逐个溶解第一到第八个化合物，溶解过程表1 配置1000 ml SBF 溶液时试剂添加顺序、添加量 Order Reagents Amounts Containers Purities（%） Formula weights 1 NaCl 8.035 Weight paper 99.5 58.4430 2 NaHCO3 0.355 Weight paper 99.5 84.0068 3 KCl 0.225 Weight bottle 99.5 74.5515 4 K2HPO4·3H2O 0.231 Weight bottle 99.0 228.2220 5 MgCl2·6H2O 0.311 Weight bottle 98.0 203.3034 6 1.0 M-HCl 39ml Graduated cylinder — — 7 CaCl2 0.292 Weight bottle 95.0 110.9848 8 Na2SO4 0.072 Weight bottle 99.0 142.0428 9 Tris 6.118 Weight paper 99.0 121.1356 10 1.0 M-HCl 0-5ml Syringe — — 2.磷灰石形成能力测试对于密质薄片材料，测出样品尺寸并计算样品表面积精确到 2mm 应用如下公式计算出 SBF 用量：Vs=Sa/10,Vs（ml）是 SBF 的体积量，Sa（mm）表示样品的表面积。对于多孔材料，SBF 的用量应大于上式计算量准备好塑料瓶或烧杯，装入计算出的 SBF 体积量加热到 36.5C， 然后按示意图往里放置样品。 笔记：样品在容器中放置有两种情况，如图 1(a)，1(b)。少数情况下，SBF 溶液会生成同 质磷灰石沉积于样品表面。所以如果样品放置是图 A1(b)种情况，表征实验应该检测样品的 下表面。 四个星期内，分别取出恒温浸透不同时长的各组样品，纯水轻盈洗净。然后将样品放入干燥 器中常温干燥。图1 SBF中样品浸泡示意图 1.四唑盐（MTT）比色法：检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色法试验（MTT）。此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1x10^9个/L的但细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100ul。●将培养板置CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下，培养3-5天。●培养3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，继续置培养箱孵育3-6h，终止培养，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培养数小时，将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度（OD），选波长490nm。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，最好在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不会过满。另外，实验时设空白对照，比色时，以空白孔调零。3.2.2 CCK-8 法Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。● 制备细胞悬液：细胞计数● 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。● 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。●加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。●培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。●测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

EdU可以在DNA复制的时候掺入到新合成的DNA链中，通过一个“Click”反应，把荧光基团标记到新合成的含有EdU的DNA上面，这样我们就能通过检测荧光而知道细胞的增殖情况了！http://www.bioon.com.cn/news/showarticle.asp?newsid=14929&typename=技术前沿详情请见上面这个链接！

其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。优点1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT法；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

2。1、cck8的吸光度读数是针对不同的菌种和不同的培养基均不同，需要自己前期做一个标准曲线。2、也就是用培养基为空白对照，不同生长阶段发酵液为样品测定OD值，并测定这些阶段的活菌数，此后再按照发酵时间对比标准曲线得出单位活菌数。3、一般读数为2最合适，十几的话可能就是培养液中产生了吸光色素之类的。

我们在实验过程中,经常被该如何设计实验而困扰,不知从何下手开展实验,细胞实验作为被经常用到的体外实验,在科研工作中占有很大的比例。下面就盘点一下实验室常用的细胞实验技术1细胞增殖常用来检测细胞增殖的方法是CCK8法和Brdu法。CCK8主要通过分光光度计进行检测,OD只越高,说明存活的细胞越多,增殖能力强。Brdu是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中,最后通过荧光强度的变化来判定细胞的增殖能力。

cck8实验算出大于百分之百的存活率正常。细胞毒性通常是指在某一个药物处理浓度下细胞的死亡率，所以在某个浓度下细胞的存活率与100%之间无统计差异，那么就说在该浓度下是无毒的。但是如果笼统的说某个药物是否有毒，是在说该药物相对毒性大小，通常要比较IC50，即半数致死量。化疗药物的IC50通常<10uM，如果要说某个药物无任何毒性，那么其IC50值可能要>1mM。不过这个并没有严格的定义，你可以设计个阳性对照。基本概念意义：细胞增殖是生活细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特征。细胞的增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。方式：真核生物的分裂依据过程不同有三种方式，有有丝分裂，无丝分裂，减数分裂。其中有丝分裂是人、动物、植物、真菌等一切真核生物中的一种最为普遍的分裂方式，是真核细胞增殖的主要方式。减数分裂是生殖细胞形成时的一种特殊的有丝分裂。

cck-8孵育时间1~2h足够，孵育前将孔里原来的 液体吸尽，cck-8与新鲜培养基按照1：10比例混匀后，每孔加入100ul,孵育1h，上机检测OD450。

CCK-8计算增殖速率有两种方法，一种是绘制生长曲线，计算线性阶段的吸光度的均值另一种是计算某时间点的（实验组与对照组吸光度的差值）/对照组的比率

不能。1、CCK8可以检测大肠杆菌，但不能在一个板子上检测ros细胞，需要分开测量。2、在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。

6孔板的情况下直接加药，无需更换培养基，记得两组的细胞浓度要稀释到差不多

建议用CCK8，可以直接加CCK8到细胞内

查查与其同源的基因在其它生物尤其是亲缘关系很近的生物体内有没有已经被证明功能的，或者猜想与什么功能有关的。寻找突变体（该基因缺失的个体）或者设计序列沉默该基因，然后观察其表型和正常个体有什么差别。寻找该基因过量表达的个体，观察表型和一般个体的差异，也可以作为一个参考。这些知识给你的研究提供思路，最后你要克隆得到该基因，在一个该基因缺失的突变体（株）内表达该基因，如果你在该个体内检测到表达并且该个体和一般个体性状差异消失，那么证明该个体是控制此性状的基因（之一）。

额。 96个孔除去你加的8个对照品而外，其他的孔全部用来加样品，88孔，88种样品（按照的说法的话，88个孔可以同时检测88个病人的某一指标），也就是可以检测88种样品的结果，如果你每个样品准备做复孔求平均值的话，可以检测44种样品。

DMSO可以提高PCR的特异性，帮助扩增一些难扩的模板。但要摸索，量大的话会抑制扩增，而且最好用于扩增1KB以上模板。

还是比较常用的. 但是因为MTT价格相对CCK-8试剂盒更便宜,实验室更较多采用MTT法.CCK-8法更灵敏,而且不用用DMSO溶解,减少接触有毒试剂的机会. 96孔板培养细胞,检测时每孔加入10%培养基体积的CCK-8,在细胞培养箱中继续孵育0.5-4个小时,时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定,初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测,检测波长为450nm.

不需要，如果你的药物需要饥饿处理，那就另当别论，就CCK8检测而言是不需要的。

标准曲线法中为消除试剂影响，最适合用十字校验来进行零点校正，通过对十点四个角和方向来进行的这种情况也可以，更好更准确完成校验

终点法。一、实验原理：细胞活力检测试剂盒(CCK-8)可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】。在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪_硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。二、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。三、优点：使用方便，无需洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂。CCK-8法能快速检测。CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度。CCK-8法的重复性优于MTT法，产生的formazan是水溶性的，减少因洗涤和溶解带来的误差。CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT方法相比线性范围更宽，灵敏度更高。CCK-8细胞活性检测试剂无需预制，即开即用。

细胞增殖的研究方法有很多，主要包括：BrdU，EdU，CCK8等方法。CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒是西安百萤生物生产的一种基于 SST-8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。其主要成分为水溶性四唑盐 SST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，SST-8 是一种类似于 MTT 的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜（formazan，参考图1)。SST-8 被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜能够直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系

cck8实验怎么看有没有细胞毒性CCK-8是一种基于WST-8的检测细胞增殖和细胞毒性的方法。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。数据呢，一般根据原始资料来选择统计分析方法，肿瘤细胞cck8增值这是什么，这个一般是计量资料，如果符合正态分布及方差齐性检验，可以用t检验或方差分析，不符合可以采用非参数检验，即秩和检验。

数据呢，一般根据原始资料来选择统计分析方法，肿瘤细胞cck8增值这是什么，这个一般是计量资料，如果符合正态分布及方差齐性检验，可以用t检验或方差分析，不符合可以采用非参数检验，即秩和检验。

cck8实验怎么看有没有细胞毒性CCK-8是一种基于WST-8的检测细胞增殖和细胞毒性的方法。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。数据呢，一般根据原始资料来选择统计分析方法，肿瘤细胞cck8增值这是什么，这个一般是计量资料，如果符合正态分布及方差齐性检验，可以用t检验或方差分析，不符合可以采用非参数检验，即秩和检验。

一、含义不同：空白试验是指在不加试样的情况下按试样分析，规程在同样的操作条件下进行的分析。所得结果的数值为空白值。然后从试样测得结果中扣除此空白值就得到比较可靠的分析结果。对照实验就是进行两组实验，控制变量，比较不同。二、作用不同：对照组采用一种无药理作用的假药，它在药物剂型或处置上不能为受试者识别，称安慰剂。用现有标准方法或常规方法做对照。这种对照在临床试验中用得较多，因为很多情况下不给病人任何治疗是不符合医德的。另外，还可用于某种新的检验方法是否能代替传统方法的研究。条件对照指虽给对象施以某种实验处理，但这种处理是作为对照意义的，或者说这种处理不是实验假设所给定的实验变量意义的。例如，“动物激素饲喂小动物”实验，采用等组实验法，其实验设计方案是：甲组：饲喂甲状腺激素（实验组）；乙组：饲喂甲状腺抑制剂（条件对照组）；丙组：不饲喂药剂（空白对照组）。显然，乙组为条件对照，该实验既设置了条件对照，又设置了空白对照，通过比较、对照，更能充分说明实验变量——甲状腺激素能促进动物的生长发育。以上内容参考：百度百科-空白对照组

如果这个软件注册不了了，可能就是处在维护的一个阶段

女生说mie意思是要不要聊天。mie字相当于吗，或者什么，表达询问的语气词。源自粤语，咩音为“mie”，一声。是粤语中最重要的语气词之一，也是虚词，主要用于感叹。“咩”拼音：miē，注音：ㄇㄧㄝˉ，部首：口部，外笔画：6，总笔画：9，五笔86：KUDH，五笔98：KUDH，仓颉：RTQ，郑码：JUC，四角号码：68051，UNICODE：54A9，结构：左右结构。造句：草原上的羊群正在咩咩的叫着。方言：粤语：me1，如：咩事？做咩？可以咩?普通话：是咩？桂柳话：mie，如：好玩咩？走咩？为语气词，相当于“吗”。组词：咩咩miē miē：象声词，羊叫声。咩力miē lí：意思是就是没得力。咩嘢miē yě：是什么的意思。粤语的由来粤语是中国广东省及周边地区的方言，被称为广府话。它的起源可以追溯到唐朝，当时中国南方许多地区都使用它作为通用语言。在元朝时期，广州成为了中国与其他国家的贸易重要港口之一，许多外国人也在其中定居，与当地居民之间的交流促进了广东话的发展。随着历史的推移，广东话的语音、词汇和语法都发生了变化，形成了现今的粤语。粤语的流行也与广东文化的传播有关。广东是中国南方的一个核心地区，具有悠久的历史和文化传统。自古以来，广东一直是中国文化的重要中心之一，其文化影响力广泛涵盖了整个中国南方地区。因此，广东话作为广东文化的一部分也得到了广泛传播。

就是填写验证码啦，它说的比较搞笑而已，请证明你是一个人，意思是怕你是注册机。

由于蝴蝶煽动翅膀的频率是低频，而较大东西的共震频率都很小，比如大海，蝴蝶煽动翅膀与大海产生共震，使海流发生轻微变化，最后衍化成海啸等。

“月明星稀，乌鹊南飞”比喻犹豫不定的人才，直接释义是“月光明亮星光稀疏，一群寻巢乌鹊向南飞去”，出自曹操《短歌行》，曹操以乌鹊南飞的情景来启发他们，不要三心二意。出处：“月明星稀，乌鹊南飞。绕树三匝，何枝可依？”例句：1、北宋·苏轼《前赤壁赋》：“月明星稀，乌鹊南飞”此非曹孟德之诗乎？2、金河北上，晨霞映影，月明星稀。3、河湾子修堰坝的工地，月明星稀，小河水静静流入水渠。

热力环流原理图：由于地面冷热不均而形成的空气环流，称为热力环流。它是大气运动的一种简单的形式。太阳辐射能的纬度分布不均，造成高低纬度间的热量差异，引起大气运动。近地面空气的受热不均 ，引起气流的上升或下沉运动， 同一水平面上气压的差异和大气的水平运动都会影响热力环流的变化。热力环流的原理就是热胀冷缩。热力环流：热力环流是大气运动最简单的形式，由于地面的冷热不均而形成的空气环流。其形成过程为：受热地区大气膨胀上升，近地面形成低气压，而高空形成高气压；受冷地区相反，从而在近地面和高空的水平面上形成了气压差，促使大气的水平运动，形成高低空的热力环流。热的地方空气受热膨胀上升，冷处收缩下沉。于是上空相同高度处，热地方单位面积空气柱重量大，冷地方高空气压小，高空形成热—冷的气流。热处气流流失后，整个空气柱减轻，地面形成低压，冷处则形成高压，近地面形成冷—热的气流。加上上升、下沉气流，构成了热力环流。

答案肯定是不够的，一线二线城市三百万买房车都是困难，三四线往后也只是满足了现状，目前几年是可以的，再往后时代的发展变化，这些钱加上利率的利息也只是杯水车薪。

　　1、silent的副词形式是silently。 　　2、意思：默默地、不说话地、悄悄地、静静地、无声地、不用言语表达地。 　　3、例句：She crept silently out of the room.她悄悄溜出房间。 　　4、例句：He silently agreed with much of what she had said.对于她所讲的，有很多他暗自赞同。

苏轼 《前赤壁赋》前赤壁赋 苏轼 壬戌之秋， 七月既望， 苏子与客泛舟游于赤壁之下。 清风徐来， 水波不兴。 举酒属客， 诵明月之诗， 歌窈窕之章。 少焉， 月出于东山之上， 徘徊于斗牛之间。 白露横江， 水光接天。 纵一苇之所如， 凌万顷之茫然。 浩浩乎如冯虚御风， 而不知其所止； 飘飘乎如遗世独立， 羽化而登仙。 于是饮酒乐甚， 扣舷而歌之。 歌曰： “桂棹兮兰桨， 击空明兮溯流光。 渺渺兮于怀， 望美人兮天一方。” 客有吹洞萧者， 倚歌而和之， 其声呜呜然： 如怨如慕， 如泣如诉； 余音袅袅， 不绝如缕； 舞幽壑之潜蛟， 泣孤舟之嫠妇。 苏子愀然， 正襟危坐， 而问客曰： “何为其然也？” 客曰： “月明星稀， 乌鹊南飞， 此非曹孟德之诗乎？ 西望夏口， 东望武昌。 山川相缪， 郁乎苍苍； 此非孟德之困于周郎者乎？ 方其破荆州， 下江陵， 顺流而东也， 舳舻千里， 旌旗蔽空， 酾酒临江， 横槊赋诗； 固一世之雄也， 而今安在哉？ 况吾与子， 渔樵于江渚之上， 侣鱼虾而友糜鹿， 驾一叶之扁舟， 举匏樽以相属； 寄蜉蝣与天地， 渺沧海之一粟。 哀吾生之须臾， 羡长江之无穷； 挟飞仙以遨游， 抱明月而长终； 知不可乎骤得， 托遗响于悲风。” 苏子曰： “客亦知夫水与月乎？ 逝者如斯， 而未尝往也； 盈虚者如彼， 而卒莫消长也。 盖将自其变者而观之， 而天地曾不能一瞬； 自其不变者而观之， 则物于我皆无尽也。 而又何羡乎？ 且夫天地之间， 物各有主。 苟非吾之所有， 虽一毫而莫取。 惟江上之清风， 与山间之明月， 耳得之而为声， 目遇之而成色。 取之无禁， 用之不竭。 是造物者之无尽藏也， 而吾与子之所共适。” 客喜而笑， 洗盏更酌， 肴核既尽， 杯盘狼藉。 相与枕藉乎舟中， 不知东方之既白。

能飞

5月5日微信7.0.4版本正式上线，用户已看不到漂流瓶功能，这距离去年11月腾讯官方宣布暂停漂流瓶功能已经半年时间，可以看出微信已经彻底的将漂流瓶抛弃，这个曾经是张小龙引以为豪的发明从此销声匿迹。 1994年，刚满24岁的张小龙，从华中科技大学研究生顺利毕业，七年的大学生涯，让张小龙掌握了专业的知识以及培养了许多兴趣爱好，这个在同学眼中思维活跃，喜欢挑战的年轻小伙注定不会甘于平凡。 随着1992年的计划经济体制改革，整个社会都在积极拥抱市场经济，同时也催生了许多人下海创业，这其中也包括了毕业后的张小龙。这个本可以在电信机关单位拿着“铁饭碗”工作的年轻人，毅然放弃了这个机会，投入到了活力四射的互联网行业，用他的话说就是“每次看到政府机关大楼，就感觉有种窒息感”，从这不难看出，张小龙对机会的把握、眼光的长远在青年时代就是常人所不及的。 1997年，身为互联网创业者的张小龙凭借一己之力，做出了优秀的Foxmail电子邮箱软件，这也是张小龙积累人生财富的第一桶金的开始。Foxmail推出一年后，刚刚出任金山总经理的雷军联系张小龙，希望购买Foxmail。张小龙随意给出15万元的报价，雷军直接同意。但意外的是，仅出任金山总经理一个月的雷军因事务缠身，负责接洽的人不了解Foxmail的价值，竟忽视了这件事情，也是这次完美的错过，使得张小龙两年后从15万的身价暴涨到了1200万。2000年，张小龙将Foxmail卖给博大互联网公司后，身价暴涨到了千万，但5年后博大没有延续Foxmail的辉煌，同样这一年，作为国内即时通软件的奠基人，马化腾的腾讯与微软的MSN打得火热，尤其邮箱业务腾讯是一塌糊涂，马化腾急需有人能帮助他重整邮箱业务，就这样走向没落的博大将Foxmail及张小龙一起“卖”给了腾讯，不得不说马化腾用人上有他独特的见解。张小龙的到来第一件事就是接手QQ邮箱业务，在将QQ邮箱与Foxmail整合后，张小龙推出了邮箱“漂流瓶”功能，“漂流瓶”的诞生，使得QQ邮箱起死回生，一举夺得了全国第一的宝座。2010年10月，一款名为Kik的App因上线15天就收获了100万用户而引起业内关注。Kik是一款基于手机通讯录实现免费短信聊天功能的应用软件。张小龙注意到了Kik的快速崛起，认为移动互联网将来会有一个新的IM，而这种新的IM很可能会对QQ造成很大威胁。他想了一两个小时后，向腾讯CEO马化腾写了封邮件，建议腾讯做这一块的东西，很快得到回复表示对这个建议的认同，于是第二年一款新的生活方式“微信”就这样诞生了。微信推出的最早期张小龙将在QQ邮箱业务大获成功的“漂流瓶”功能搬进了微信，再结合“摇一摇”、“附近的人”、“朋友圈”一举将微信用户推进了10亿级别，成就了微信的同时，也使得张小龙这个名字变得家喻户晓。 虽然“漂流瓶”的出现，功能褒贬不一，但正所谓那句“善恶之业，在于心念所择。天下万物，负阴而抱阳，哪有非正即邪这么简单。”

忘记做某事翻译成英文是Forget to do sth。

一个东西影响另一个东西的原理是蝴蝶效应蝴蝶效应是指在一个动力系统中,初始条件下微小的变化能带动整个系统的长期的巨大的连锁反应。

您好！silence 名词， silently 副词 。望采纳！谢谢！

1、超滤原理：超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤原理也是一种膜分离过程原理。超滤微孔小于0.01微米，能彻底滤除水中的细菌、铁锈、胶体等有害物质，保留水中原有的微量元素和矿物质。2、超滤膜：是一种孔径规格一致，额定孔径范围为微米的微孔过滤膜。超滤膜根据膜材料的不同分为无机膜和有机膜，无机膜主要是陶瓷膜和金属膜。有机膜主要由高分子材料制成，如聚偏氟乙烯 (PVDF)、聚醚砜 (PES)、PP、聚乙烯(PE)、PAN、聚氯乙稀(PVC) 等。比如立升净水器使用的就是PVC合金膜，这种膜的优点就是良好的亲水性、打孔精度高以及耐腐蚀等。3、超滤净水器：超滤净水器制出来的水既能彻底滤除掉水中的细菌、铁锈、胶体等有害物质，又能保留水中原有的微量元素和矿物质，补充我们日常所需。这样的水既比白开水安全，又比纯净水健康，一定程度上能够真正满足我们日常的饮水和用水需求。

示意图如下：由于地面冷热不均而形成的空气环流，称为热力环流。它是大气运动的一种简单的形式。太阳辐射能的纬度分布不均，造成高低纬度间的热量差异，引起大气运动。近地面空气的受热不均 ，引起气流的上升或下沉运动， 同一水平面上气压的差异和大气的水平运动都会影响热力环流的变化。热力环流热力环流是大气运动最简单的形式，由于地面的冷热不均而形成的空气环流。其形成过程为：受热地区大气膨胀上升，近地面形成低气压，而高空形成高气压；受冷地区相反，从而在近地面和高空的水平面上形成了气压差，促使大气的水平运动，形成高低空的热力环流。热的地方空气受热膨胀上升，冷处收缩下沉。于是上空相同高度处，热地方单位面积空气柱重量大，冷地方高空气压小，高空形成热—冷的气流。热处气流流失后，整个空气柱减轻，地面形成低压，冷处则形成高压，近地面形成冷—热的气流。加上上升、下沉气流，构成了热力环流。最基本的原理就是物理上的热胀冷缩。空气受热膨胀，分子间密度减小，气压下降，反之气压升高，因此空气垂直对流，从而在水平面上产生气压差，存在了气压梯度力，产生了水平流动，最终形成环流。

译文：forget英［fu0259＇ɡet］释义：vt.忘记；忽略vi.忘记n.（Forget）人名；（法）福尔热［第三人称单数forgets；现在分词：forgetting；过去式：forgot；过去分词：forgot或forgotten］短语：Forgive and forget不念旧恶；尽释前嫌；既住不咎扩展资料：词语辨析：forget，leave，lose这组词都有“遗忘”的意思。1、lose指由于着急而一时想不起来。2、forget指由于记忆上的忽略而对某人或某物失去了印象，这种“忘记”可能只是暂时的，也可能是长久的，且有“疏忽，忽略”之义。3、leave指忘记带了某物，有较强的感情色彩，强调“不在”。

“月明星稀，乌鹊南飞”意思是月光明亮星光稀疏，一群寻巢乌鹊向南飞去。出自两汉曹操的《短歌行》，全面展现了曹操的人格、学养、抱负和理想，充分显示了其雄深雅健的诗品。原文：对酒当歌，人生几何！譬如朝露，去日苦多。慨当以慷，忧思难忘。何以解忧？唯有杜康。青青子衿，悠悠我心。但为君故，沉吟至今。呦呦鹿鸣，食野之苹。我有嘉宾，鼓瑟吹笙。明明如月，何时可掇？忧从中来，不可断绝。越陌度阡，枉用相存。契阔谈讌，心念旧恩。月明星稀，乌鹊南飞。绕树三匝，何枝可依？山不厌高，海不厌深。周公吐哺，天下归心。译文：一边喝酒一边高歌，人生的岁月有多少。好比晨露转瞬即逝，逝去的时光实在太多！宴会上歌声慷慨激昂，心中的忧愁却难以遗忘。靠什么来排解忧闷？唯有豪饮美酒。有学识的才子们啊，你们令我朝夕思慕。只是因为您的缘故，让我沉痛吟诵至今。阳光下鹿群呦呦欢鸣，在原野吃着艾蒿。一旦四方贤才光临舍下，我将奏瑟吹笙宴请嘉宾。当空悬挂的皓月哟，什么时候可以摘取呢；心中深深的忧思，喷涌而出不能停止。远方宾客穿越纵横交错的田路，屈驾前来探望我。彼此久别重逢谈心宴饮，重温那往日的恩情。月光明亮星光稀疏，一群寻巢喜鹊向南飞去。绕树飞了几周却没敛翅，哪里才有它们栖身之所？高山不辞土石才见巍峨，大海不弃涓流才见壮阔。我愿如周公一般礼贤下士，愿天下的英杰真心归顺于我。全诗充分发挥了诗歌创作的特长，准确而巧妙地运用了比兴手法，来达到寓理于情，以情感人的目的。在曹操的时代，他就已经能够按照抒情诗的特殊规律来取得预期的社会效果，这一创作经验显然是值得借鉴的。同时因为曹操在当时强调“唯才是举”有一定的进步意义，所以他对“求贤”这一主题所作的高度艺术化的表现，也应得到历史的肯定。

文｜杜晨编辑｜Lianzi在中国，微信公众号的出现，使得自媒体业蓬勃发展。而在美国，近几年也开始出现了媒体人从大机构离职，转型自媒体“个体户的潮流。这不禁令人联想：谁会成为“美国版微信公众号呢？实际上，答案已经显而易见了。当地时间11月15日，内容平台创业公司Substack宣布，其平台上的付费订阅总量已经超过了100万。在过去的一年里，**对经济大环境的影响导致许多媒体机构衰落。一批从业者“下海转型自媒体，而缺少可靠资讯来源的读者也开始更加青睐Substack这样的付费平台阅读。在过去的一年时间里，Substack取得了亮眼的增长成绩。去年12月，Substack的付费订阅总量达到25万。今年2月，这个数字就突破了50万。也就是说，Substack的付费订阅水平，在过去9个月里翻了一倍，在过去一年里提升了三倍。如果说在美国的自媒体浪潮当中有一个平台，地位和微信公众号一样的话，那它一定非Subtack莫属了。百万订阅，千万流水Substack是一家总部位于旧金山的创业公司。其开发的平台，让几乎任何人都可以撰写并发布新闻信，设置订阅功能，通过付费读者获得收入。创作者青睐Substack主要是因为其写作、发布和营收平台非常的简单、轻量，不需要进行繁琐的设置，就可以很快地把一个新的Newsletter品牌建立起来、聚集读者，并通过付费订阅实现收入。同时，Substack支持免费试读功能，让读者更好了解内容的质量和调性，从而帮助作者获得更多收入和更精准的付费读者。Substack首页该公司最近宣布，有50万用户至少付费订阅了一个Newsletter。而Substack的付费用户比例在5-10%之间浮动，意味着平台的总用户量可能至少已经超过了500万。尽管付费比例低，这个平台为优秀创作者带来的营收能力是令人难以置信的。据联合创始人HamishMcKenzie透露，目前平台上订阅量最前十的付费Newsletter，合并起来的年收入高达2000万美元。如果你是初来乍到者，也不用特别羡慕这些头部的大佬。Substack平台上的内容品牌非常多元化，有擅长写时政、体育、文化、本地的记者，也有写连载小说的作者，有写金融评论和投资建议的专业人士，还有画漫画的、教调酒的、做面包的、歌剧赏析的、玩文字游戏的等等也正因为这种多元化，平台上创作者的马太效应并没有那么明显。头部和腰部的Newsletter品牌，在付费订阅数量上并没有天差地别。就算是一个腰部创作者，只要内容够硬、定价自信，完全可以在平台上赚到不少钱，还能收获成长，朝着头部前进。McKenzie还表示，即使你的内容特别垂直，只针对一个特定领域的少数群体有价值，假设你定价$5/月，只要有1000人付费，你在平台上的年收入就足以超过5万美元。也正是因此，这个平台受到很多个人新闻工作者的青睐。此外，在美国本地媒体行业普遍因为资金问题而青黄不接的年代，Substack也促成了本地新闻报道的复兴。由于Facebook等社交网络的挤压效应，大量美国本地媒体订阅严重下滑，难以为继，不得不停刊或缩减规模。特别是最近几年，一些对冲基金和资产管理公司，看准了本地媒体的艰难情况，低价杀入，再“洗劫一空后变卖资产，杀死了一家又一家本地媒体品牌，其中不乏普利策奖得主。受到影响的从业者们很大一部分投身到了Substack当中。相比之前维持一个大机构运转，通过Newsletter的方式继续从事新闻报道的运营成本要低得多。更重要的是，这个平台的付费订阅/无广告模式，让记者可以专心提供有价值的内容去吸引读者付费，不需要分心去管理和广告商的关系。比如，之前在北卡州《夏洛特观察报》工作了八年的TonyMecia，以及工作了长达20年的CristinaBolling目前都在Substack上继续从事本地新闻和评论的报道。他们的Newsletter名为TheCharlotteLedger，免费和付费墙内容各占一半，整个品牌目前的年收入已经接近17.5万美元。TonyMecia和CristinaBolling图片来源：TheCharlotteLedger“美国版公众号从2017年创立，到今天成长为今天美国自媒体平台领域的“一哥，Substack甚至逐渐超越了那些比它创立更早或者融资情况更好的竞争对手，如Revue、Mailchimp、Medium等，也奠定了它“美国版微信公众号的地位。而熟悉Substack内部情况的人士都知道，Substack和公众号的这种微妙关系，也许并非偶然。原CBSMarketWatch联合创始人BillBishop作为Substack的早期投资人之一曾透露，在Substack的成长过程中，微信公众号都是非常重要的启发。Substack联合创始人之一ChrisBest，之前也是即时通讯软件KikMessenger的联合创始人。而Kik则被互联网资深人士普遍认为是微信的灵感来源。2010年10月，Kik正式问世，上线15天用户量就突破100万，其当时在黑莓平台的App一度威胁到了原生软件BBM的地位，导致黑莓将其下架。Kik上线不久后，小米推出了米聊，腾讯则推出了微信。和微信不同，Kik在推出之后一直“坚守初心，只做聊天功能。而微信则通过即时通讯功能迅速斩获中国移动互联网发展的先机，先后推出了朋友圈、公众号、支付、游戏等功能。Kik的核心团队非常欣赏微信成为超级App的魄力。Kik曾经也表示过“争做西方的微信，打造一个超级App，也接受了腾讯的投资。不过近几年Kik家道中落，目前已经关闭。作为联合创始人的ChrisBest，做“西方微信想法终究没有实现。Kik的早期界面截图，可以看到和微信风格极其相似图片来源：网络Thompson花了很大功夫自己开发了一套Newsletter分发、内容锁定和付费解锁，以及收费的机制，外加配套的博客网站。对于那些早年就在中文互联网上写文章的人来说，“博客还是比较熟悉的。而Newsletter的载体是电子邮件，虽然人人都有，但在中国作为一种资讯传输方式的重要性和受欢迎程度远不及微信和微博。因此，Newsletter虽然和博客都是舶来品，却没受到关注。两个平台之间还有另一层微妙关系：Substack的投资方里也有真格基金。下一步路，要怎么走？为了吸引作者，让他们在平台上安心写作，Substack除了把平台的基础功能和服务做好之外，也推出了很多额外的激励制度和周边服务：Grow：一套专为新来平台的写手提供的指导课程，完全免费，自由定制课程Local：为优秀的本地资讯提供者提供总奖金100万美元，最终挑选出12名优胜者。这批幸运和实力兼具的作者将可以获得更资深记者的指导、商业策略和设计方面的帮助，以及每人最高10万美元的启动资金Fellowship优秀作者资助计划，共挑选10人，每人获得3000至10万美元不等的启动资金和写作激励金Defender：在重磅内容发布之前，写手可以通过这项服务对接律师，进行法务审查。如果写手收到了律师函甚至遭到起诉，律师也可以对其提供法务咨询帮助。不过，Substack现在认为，由Newsletter这一形式主导的自媒体潮流，还只是开始，还可以做更多。“我们的媒体消费习惯需要从注意力经济中转移出来。我们要建立一个另类的媒体世界，基于完全不同的法则。在这个新世界里，我们为内容付费，而不是用广告补贴；我们衡量内容质量的指标是信任，而不是互动量；优秀的内容会启发深度的思考，而不是冲动的反应；我们要建立一个能够让作品被传播，同时作者能够保留尊严的系统。为此，Substack为接下来的工作定了三个目标：1/继续改进内容发布工具，加入更多对音频、视频，以及帮助维护读者社区的新功能2/继续改善Substack的收入模式。在作者和他们需要的第三方服务之间扮演对接人的角色3/在作者群体的帮助下，共同开发一个新的内容发现机制，让作者/不同内容品牌之间可以协作、互推。关键在于，这个机制一定要避免重蹈注意力经济的覆辙McKenzie在文章里写道，今天的媒体环境仍然充满了问题，但Substack上发生的情况让他看到希望：人们是乐意为他们信任的作者去付费的；专注于特别垂直群体的内容品牌是能成功的；优秀的作者做着最热爱的事情，收入是可以超过简单糊口水平的，甚至，他们还可以成为自己的老板，雇佣更多同样的人，组建自己的媒体帝国。“四年前，大批人认为Newsletter付费还是一件不敢想的事情。然而在今天，一百万个订阅，就是一百万个理由，让我们相信，这件事比我们之前猜测的要大得多。McKenzie写道，“我们认为这个潮流仍然势头猛烈。下一站，我们朝着1000万个订阅努力，并且永不停歇。

Love"s secret William Blake Never seek to tell thy love,Love that never told can be;For the gentle wind doth moreSilently,invisibly.I told my love,I told my love,I told her all my heart,Trembling,cold,in ghastly fears,Ah!She did depart!Soon after she was gone from me,A traveller came by,Silently,invisibly:He took her with a sigh.爱情的奥秘 （威廉·布莱克）千万别想把爱情倾诉，爱情只能深藏在心底；因为，那柔风的吹拂无声无息，无形无迹。我把我的爱告诉了她，把整个心迹向她表白；我颤抖、冰冷、害怕，可她呀，她竟然走开！她刚刚从我这儿离去，一位过路人经过身旁；无声无息又无形无迹——凭一声叹息被她爱上。

热力环流是由于地面冷热不均而形成的空气环流，它是大气运动的一种最简单的形式。如果地面受热多，近地面空气膨胀上升，这样，近地面的空气密度减小，形成低压；上升的空气到上空聚集起来，使上空的空气密度增大，形成高气压；如果地面受热少，空气冷却收缩下沉，上空的空气密度减小，形成低气压；因为有下沉气流，近地面的空气密度增大，形成高气压。就同一水平面而言，气流总是由高压流向低压。这样，这些空气的水平运动和垂直运动，就构成了简单的热力环流圈。作用：冷热差异导致了空气的垂直运动，使水平方向出现了气压差，引起水平气流的运动。海陆风、山谷风、城市热岛环流、季风等都是热力环流的具体表现。

mie拼音的汉字是灭。拼音：miè。五笔：goi。部首：一。笔画：5。解析：灭是现代汉语规范一级字（常用字），普通话读音为miè，最早见于春秋中期金文，在六书中属于形声字。“灭”字《说文解字》解释为“尽也”。“灭”的基本含义为火熄，如：熄灭；引申含义为完，尽，使不存在，如：灭口。灭亡。在现代汉语中，“灭”还有淹没的含义，如：灭顶之灾。灭造句1、他自动加入到了灭火的队伍中。2、为了灭火，他急中生智，攀绳上了房顶。3、面对熊熊大火，消防队员个个奋不顾身地上前灭火。4、灭火任务已经完成，消防人员便陆续撤离了火场。5、发生火灾后，不要惊慌，要立刻通知消防队并采取相应灭火自救措施。6、还是再去几个人到灭火现场检查一下，以防万一。7、当时灭火工作那样紧张，大家都是挥汗如雨，谁还能想那么多。8、汽车要加油，请先灭火。9、要家家户户准备灭火器，就是要防患未然，避免火灾的发生。10、织布车间内外都要装上灭火器，水火无情，我们可不能麻痹大意啊！

忘记的英文：forget； 例句： I forget how much they paid for it. 我忘了他们用多少钱买的这东西。 I never forget a face. 见过的面孔我从不忘记。 扩展资料 　　When I close my eyes, I forget about everything. 　　我闭上眼睛就忘记一切。 　　Who could forget his speech at last year"s party? 　　谁能忘记他去年在聚会上的.讲话呢？ 　　The accident taught me a lesson I"ll never forget. 　　那事故给我的教训永远也不会忘记。 　　Would they forgive and forget – or show him the door? 　　他们会原谅并忘记他的过失–还是会将他赶出门去？

"月明星稀一两风，吹醒十年黄粱梦”的意思是：月亮明亮时，星星就显得稀疏了，一两阵风吹醒了十年都不能实现的梦想。月明的意思是月亮很明亮，星稀的意思是星星显得稀疏。一两风是一两阵风的意思，黄粱梦的意思是比喻虚幻不能实现的梦想。所以，"月明星稀一两风，吹醒十年黄粱梦”的意思是：月亮明亮时，星星就显得稀疏了，一两阵风吹醒了十年都不能实现的梦想。