乙肝抗原抗体检测实验的主要步骤

elisa实验原理是：通过特定抗原与抗体的相互作用来检测和定量分析目标物质。下面将详细介绍ELISA实验的原理：1.ELISA的基本原理实验基于抗原与抗体的高度特异性结合，利用酶标记技术和吸附作用进行检测和定量分析。基本步骤包括：涂覆固相载体、非特异性结合位点的阻断、特异性抗原与抗体的结合、酶标记二抗的结合、底物添加和反应终止。通过测量底物的酶催化生成物的颜色或荧光强度，可以间接反映出目标物质的存在量。2.直接ELISA的原理直接ELISA中，目标抗原直接与被酶标记的抗体结合。具体步骤包括：将抗原溶液加到固相载体上，使其吸附；添加被酶标记的特异性抗体，形成抗原-抗体复合物；洗涤去除未结合的物质；加入底物，被酶催化生成可测量的产物。产生的信号强度与目标抗原的浓度成正比。3.间接ELISA的原理间接ELISA中，目标抗原首先与非酶标记的特异性抗体结合，然后再与被酶标记的二抗结合。具体步骤包括：将抗原溶液加到固相载体上，使其吸附；添加非酶标记的抗体，形成抗原-抗体复合物。洗涤去除未结合的物质；加入被酶标记的二抗，与抗原-抗体复合物结合；再次洗涤去除未结合的物质；加入底物，被酶催化生成可测量的产物。产生的信号强度与目标抗原的浓度成正比。4.间接竞争ELISA的原理间接竞争ELISA在间接ELISA的基础上进行了一些修改，用于检测样品中特定抗原的存在量。具体步骤包括：将抗原溶液加到固相载体上，使其吸附。加入被酶标记的特异性抗体和待测样品；洗涤去除未结合的物质；加入底物，被酶催化生成可测量的产物。产生的信号强度与待测样品中特定抗原的浓度成反比。ELISA实验的原理基于抗原与抗体的特异性结合、酶标记技术和底物反应等步骤，通过测量产生的信号强度来定量分析和检测目标物质的存在量。不同类型的ELISA实验可以根据实验设计和样品特点选择合适的方法，以满足不同的研究需求。

elasa实验原理如下：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。双抗夹心法适用于大分子物质的检测。将已知的可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体表面，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，具有快速、灵敏、简便等优点。竞争法适用于较少表位的小分子物质。将抗体包被于微孔板中，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，加入标准品和生物素标记的抗原物质进行竞争结合。做实验的注意事项：1、实验前的准备工作很重要，试验前要准备充分，拿到任务应当进行简单的思考，将试验需要的各种试剂、试液、仪器以及试验的流程、注意事项、以前试验当中遇到的问题等想清楚，准备好，免得到时少东少西，自乱阵脚。第一次新实验的话最好请教一下做过类似实验的人，对于不常做的实验最好做一份详尽的试验流程图做时贴在试验台前，需要特别加以注意的地方要特别标注，可以随时参照。2、保持实验室整洁。做完实验做到药品归位，用过的仪器等恢复原样，不能做到哪里摊到哪里，永远把你的实验台面保持干净，不但是为了让你得到很好的结果，更是为了你自己的心情做实验不能做到整洁。实验时养成隋手清理的习惯。3、消煮后的原液做完后不要急着倒掉，最好等数据算出再倒掉，这样遇异常数据或超标数据，不用重复消煮就可以复检。

ELISA是免疫学的经典实验，酶联免疫吸附测定enzyme linked immunosorbent assay（简写ELISA），指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。

是用空气结合的

　　两者都是基于抗原与抗体之间能发生特异性结合这一基本原理。　　免疫组化是对组织标本或细胞标本中的抗原类物质如细胞中的病原体、蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、酶、激素、核酸等进行定位或定量检测，检测材料是石蜡切片或细胞涂片，检测时用到的抗体可以用酶标记，也可以用荧光素标记。 酶联免疫吸附试验既可以检测抗原也可以检测抗体，若检测抗体，则酶标板需要用抗原包被；若检测抗原，则酶标板需要用抗体包被。

实验大鼠可以取胆汁酸，先包被大鼠的总胆汁酸捕获抗体的包被微孔中，然后依次加入标本、标准品、HRP标记的监测抗体，经过温育并洗涤

1、Cell-BasedELISA的优点：Cell-BasedELISA（基于细胞的ELISA）是一种全新的ELISA技术，有两个最突出的优点：1.1不需要抽提蛋白、包被微孔板：细胞直接在微孔板里培养，待检测的时候，将细胞固定在微孔板上并进行通透处理即可。这样就避免了抽提蛋白时，由于客观和主观上引起样品的损失而导致实验结果在一定程度上偏离了实际情况。同时不用包被微孔板，简化了实验流程，有助于提高效率。科研人员在一个96酶联板上，便能检测目标细胞蛋白经刺激或抑制作用后的表现。由于省去抽提蛋白和裂解细胞的步骤，样本的损失也能降到最低，比起其他普通的ELISA测定方法，这项全新的ELISA技术能更快速、更方便地一次检测大量的细胞内蛋白。1.2可同时检测两种不同蛋白：封闭后加入两种抗不同蛋白且来源于不同宿主的一抗，然后再加入不同的二抗，加入两种荧光底物，检测两个波长。同时检测两种蛋白的好处是显而易见的，可以减少工作量，此外还可以满足一些特殊的实验需要，例如，需要测定某个蛋白的磷酸化比例，就需要测定磷酸化蛋白的数量和总蛋白的数量，这两个测定在同一次实验进行，有助于消除实验误差，得到更为精确的实验结果。2、Cell-BasedELISA的两种技术：某些公司发展了双通道Cell-BasedELISA技术；双通道与单通道Cell-basedELISA比较：双通道cell-basedELISA，顾名思义，即一次可以同时检测两种目的蛋白，R&DSystems提供的Cell-basedELISA就是双通道cell-basedELISA，原理略：（需要荧光检测方式和相应仪器）；单通道cell-basedELISA，即一次只能检测一种目的蛋白，他和普通ELISA的主要区别在于样品处理过3、cell-basedELISA的应用：该产品，最多发展起来的是用于检测磷酸化和非磷酸化蛋白的相对含量；4、有cell-basedELISA产品的公司：目前，多家elisa产品提供提供cellbasedelisa试剂盒，如Rndsystems，raybiotech，ebioscience，millipore等公司；5、如何自己进行cellbasedelisa实验？事实上，根据单通道的cellbasedelisa原理，可以自己建立cellbasedelisa实验系统；细胞加入培养板中；加入刺激物或者抑制剂进行培养；对细胞进行固定或者封闭；加入第一抗体；加入HRP结合的二抗（二抗的选择，同westernblot）；加入底物进行显色；

神经保护剂对小白鼠实验原理，巴比妥类，抑制中枢神经系统，随着剂量的由小到大，中枢抑制作用的程度，由浅入深，当剂量大于催眠剂量时有抗惊厥作用，

双抗体夹心法实验原理： 用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗C3抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗C3抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色.TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的C3呈正相关.用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度.

一、实验目的1.深入了解ELISA 法测定抗体效价的原理。2.掌握ELISA 法测定单克隆抗体效价的方法。二、实验原理ELISA 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA 法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA 法中.酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。目前常用的几种ELISA 方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。……详细资料请参考：on http://www.bio1000.com/experiment/immunology/229066.html

不准确

自从Engvall和Perlman(1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。如今ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。 过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。 良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。 测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。⑴ 酶与抗体的活性　常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。⑵ 结合物的定量测定　一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：酶量（mg/ml）=OD403×0.42IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4结合物中酶总量=HRP（mg/ml）×结合物溶液量结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×100%用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果最好。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时最好。酶结合率为 7%时效果一般，为9%－10%较好，达30%以上时最好。ELISA方法的基本类型、用途及操作程序根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot-ELISA）；再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。 本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎（DVH）抗体的ELISA为例，间接ELISA的操作程序如下。⑴ 材料① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液；② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清；待检鸭血清；③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。⑵ 方法步骤① 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干④ 加底物液　→ 37℃ 30分钟，加终止液⑤ 用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。⑶ 结果判定　已知阳性血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知阳性血清的OD值≥0.4；在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待检血清的OD值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。 本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。① 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干④ 加底物液　→ 37℃ 15分钟，加终止液⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。 此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。此法的基本程序为：① 加抗体（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干② 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干③ 加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干④ 加入酶标抗Ab-2抗体（AB-3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。 此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。其基本程序为：① 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干③ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液④ 用ELISA检测仪测定OD值。被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测；其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。 本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。 本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性，该方法的主要程序为：① 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干④ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。 与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：⑴载体膜的预处理及抗原包被　取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使硝酸纤维素膜彻底干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20μl。⑵ 封闭　将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。⑶ 加被检血清　可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。⑷ 加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。⑸显色　加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。⑹ 结果判定　以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。 （C－ELISA）　C－ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大学者Blais,B. W.等于1989年建立的一种新型免疫检测技术。该方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即涤纶布为固相载体，这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大，可为免疫反应提供较大的表面积，提高反应的敏感性，且容易洗涤，不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA类似，只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例，C－ELISA的主要程序为：⑴ 首先把抗布氏杆菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并经洗涤及封闭；⑵ 加被检样品并于室温下感作30分钟，然后洗5次；⑶ 加酶标记的抗布氏杆菌抗体，于室温下感作30分钟，然后洗涤5次；⑷ 加入底物液显色；⑸ 测定OD值。

做好对照正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。实验条件的选择在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:（1）　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。（3）　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。（4）　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。进口分装：检测范围和灵敏度不同，用量少时，可使用分装，前期是它的长久性不是很好。试剂盒的标准曲线最高点OD 值均在2.0±0.2，零孔的OD 值都控制在0.10以下。试剂盒的标准曲线相关系数R≥0.98。试剂盒重复性好，板内、板间变异系数均<9 %。试剂的组份都多给20%的富余量，确保完成48/96孔的检测，避免分次检测可能造成试剂量不足的情况。检测抗体及酶结合物的稀释度合适(均为1:30), 方便试验操作者准确地做稀释工作，保证实验结果的重复性。白介素6是一种细胞因子,已被证实为B细胞分化因子.它是一种抗体形成系统,它的生理特性,如肝细胞急性蛋白合成的诱导和基于和白介素3协同作用的生长刺激等,也备受关注. 并且已证实白介素-6与病理学存在稳定的相关关系.例如,报道多种疾病的生长因子为白介素-6, 骨髓瘤细胞能合成白介素-6并表达白介素-6受体.此外, 白介素6在多种炎性疾病和自身免疫疾病发挥重要的作用. 此试剂盒能高灵敏度的检测小鼠血清和细胞基质上清的白介素6 原理 此试剂盒运用了两种特异性抗体,洗板后加入TMB底物液显色,显色的强度与小鼠的白介素-6的量成正比. 检测范围 10.94的 700 pg/mL 预期用途

elisa试剂盒实验中的封闭液小知识 ELISA的试剂盒说明上写封闭液用蔗糖溶液，一般是用BSA或酪蛋白的蛋白分子封闭空白位点，蔗糖封闭的原理： 1、ELISA实验中，蔗糖本身没有封闭作用; 2、封闭液一般是BSA、酪蛋白等或者是Tween等。 3、加蔗糖的主要目的是保护ELISA板子吸附(包被)的蛋白，起到“保护剂”的作用。 4、蔗糖溶液一般在ELISA板子经过BSA封闭后加，当然也有将蔗糖加到封闭液中同时进行处理;那一种更好需要你实验后来验证。但多数选择前者。封闭剂还可用5%的脱脂乳(市售即可)，0.4%的明胶，但是实验表明前者比较好，后者不容易洗干净未结合上的明胶。封闭剂的原理就是与酶联板上未结合抗原或抗体的微孔中用封闭剂封闭上，结合抗体或抗原的时候就不会产生非特异结合了，不会影响实验的准确度。tween的作用：虽然不能单独封闭，但和BSA在封闭时会起到清洗非特异性结合或结合不牢固的蛋白的作用，假如抗体包被在板上会出现YY-附件：ELISA实验中缓冲溶液等试剂的配置ELISA实验中是以抗原和抗体的免疫反应为基础，ELISA试剂以及各种溶液如何配置?最近刚做了下ELISA实验，把各种ELISA配置方法汇总如下：(1)　ELISA实验包被缓冲液(2)　ELISA实验洗涤缓冲液(2)　ELISA实验洗涤缓冲液(3)　ELISA实验稀释液;(4)ELISA实验终止液(5)ELISA底物缓冲液(6)ELISA实验TMB(四甲基联苯胺)使用液(7)　ELISA实验ABTS使用液(8)ELISC。试剂(1)　ELISA实验包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):NaHCO3 1.59克NaHCO3　 2.93克加蒸馏水至1000ml(2)　ELISA实验洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15MKH2PO4 　　　　 　0.2克Na2HPO4·12H2O　　2.9克NaCl　　　　　 　　8.0克KCl　　　　　　　 　0.2克Tween-20　0.05%　 0.5ml加蒸馏水至1000ml(3)　ELISA实验稀释液：牛血清白蛋白(BSA) 0.1克加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10%使用。(4)　ELISA实验终止液(2M　H2SO4)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。(5)　ELISA底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml0.1M 柠檬酸(19.2克/L)　　　　　 24.3ml加蒸馏水50ml。(6)　ELISA实验TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5)　　　 10ml0.75%H2O2 32μl(7)　ELISA实验ABTS使用液:ABTS　　　　　　　　0.5mg底物缓冲液(PH5.5)　 1ml3%H2O2 2μl(8)ELISA实验封闭液：牛血清白蛋白(BSA) 5克加洗涤缓冲液至100ml。值得一提的是有的封闭液中含有脱脂奶粉，不适合长期保存。生物帮推荐ELISA相关产品，详情见：封闭试剂、终止溶液、封闭肽、ELISA稀释液、ELISA试剂盒、ELISA缓冲液、ELISA洗脱缓冲液为了保证ELISA实验的准确性，实验操作中加入的缓冲液和各组分一定要精确，将洗涤液加入酶标板中的时候防止加入的试剂混入另外一个酶标孔，严防交叉污染。 ELISA试剂盒http://www.hybiosh.com/Products/T53531.html 源自先进的酶联免疫技术上海恒远物科技有限公司，涵盖国内外专家的经验与智慧。采用先进的技术和设备，确保品质的同时，降低成本，为更多有需要的研究人员，节省实验经费，保证实验质量，为国家的科技发展多做贡献。多家生物科研基地合作伙伴，实力团队倾力打造专注于elisa试剂盒的生产，研发，助力您的科研试验!

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测.在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab")或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标(参见6.2).双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心.2.2 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合.标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应.如抗原为高纯度的,可直接包被固相.如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原.洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应.竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法.另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应.抗HBe的检测一般采用此法.2.5 竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式.其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合.标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅.小分子激素,药物等ELISA测定多用此法.

除脂 ： 在操作含有脂肪的样本的前处理过程中， 都会接触到除脂这个过程， 一般的除脂过 程都是通过液液分配萃取过程进行实现的， 脂肪属于非极性化合物， 而一般说来药物大 多属于极性化合物， 根据有机化学中相似相溶的原理可知， 在进行除脂过程一般选用非 极性试剂进行除脂，比如正已烷、四氯甲烷、正庚烷、环已烷或其他饱和烷烃等，而在 实验操作过程中，一般说来，还需要考虑到试剂的毒性以及其他危害性，所以正常的实 验过程中，最好选用对人体伤害较少且不容易挥发的试剂进行实验操作，比如正已烷、 正庚烷等，这样既可以达到除脂的效果，也可以保证该方法的回收率。 如果实验室并无以上所列的这几种试剂，也可利用其他非极性有机化合物进行代 替，但不宜选用分子量相对过大的试剂。 在除脂过程中，一般说来操作后脂肪会带有一定的颜色，可能为浅黄色，而无机相 则为透明无色液体， 以此也可以清楚的知道目标相处于上层还是下层， 避免造成实验误 差。 。

免疫印迹实验和酶联免疫的区别如下：免疫印记一般是要把检测的样品转到膜上,再用抗体检测酶联免疫一般是把抗体固定在支持物上,再与要检测的样品反应,目标物就会与抗体结合而留在支持物上。WB所检测的一般是抗原，而Elisa抗原抗体都可以检测。WB只能用抗体去检测你的蛋白样品。ELISA可以固定抗原也可以固定抗体。WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；免疫印迹实验：免疫印迹法 (Western blotting) 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。 免疫印迹法(immunoblotting test,IBT)亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot.原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。酶联免疫实验：1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 。原理：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体②酶标记的抗原或抗体③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

小鼠ELISA试剂盒用于测定小鼠体内特定蛋白质的含量的检测方法，检测范围指的是该试剂盒可以检测的目标蛋白质的浓度范围。不同品牌和型号的小鼠ELISA试剂盒的检测范围可能会有所不同，小鼠ELISA试剂盒的检测范围通常在pg/mL到ng/mL之间。对于ELISA试剂盒，其基本原理是将样本中的目标蛋白质与特异性抗体结合，然后通过荧光、颜色等方式进行检测。ELISA试剂盒检测范围的确定与所使用的抗体、检测物以及检测反应的灵敏度密切相关。检测范围应该根据需要进行选择，以确保其可以准确地检测到实验样本中的目标蛋白质，同时避免样本中浓度过高或过低而导致的检测结果失真。小鼠elisa试剂盒当实验需要检测的目标蛋白质浓度特别高或特别低时，可能需要选择不同品牌和型号的小鼠ELISA试剂盒来满足实验需求。在选择适当的ELISA试剂盒时，需要考虑以下因素：1、抗体特异性：选择具有高特异性的抗体，以确保可以准确地检测目标蛋白质。2、基质干扰：样本中可能存在不同程度的基质干扰。为了避免基质干扰影响检测结果，应选择适当的样本预处理方法。3、灵敏度：对于浓度较低的目标蛋白质，需使用灵敏度较高的ELISA试剂盒。4、动态范围：动态范围内可以实现线性检测，结果与目标蛋白质浓度成正比。因此，应根据预期的目标蛋白质浓度选择适当的ELISA试剂盒。Elisa检测在进行小鼠ELISA实验时，还需要注意以下几点：1、样本获取：样本的采集和保存条件应符合标准要求，以避免样本中的蛋白质失活或降解。2、样本稀释：通常情况下，样本需要进行恰当的稀释处理，以确保检测结果在试剂盒的检测范围内。3、交叉反应：不同抗体之间或与其他组分之间可能存在交叉反应，因此需要进行适当的交叉反应实验。4、实验重复：为了确保结果的准确性和可靠性，建议进行多次实验，以获得重复性较好的数据。小鼠ELISA试剂盒的检测范围通常在pg/mL到ng/mL之间，但在选择试剂盒时需要考虑多方面因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。

强酸都可以.我们这用的是硫酸

酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay简称ELISA）是在免疫酶技术。ELISA的基本原理有三条：1抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；2抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；3酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

1、Cell-Based ELISA 的优点：Cell-Based ELISA（基于细胞的ELISA）是一种全新的ELISA技术，有两个最突出的优点：1.1不需要抽提蛋白、包被微孔板：细胞直接在微孔板里培养，待检测的时候，将细胞固定在微孔板上并进行通透处理即可。这样就避免了抽提蛋白时，由于客观和主观上引起样品的损失而导致实验结果在一定程度上偏离了实际情况。同时不用包被微孔板，简化了实验流程，有助于提高效率。科研人员在一个96 孔酶联板上，便能检测目标细胞蛋白经刺激或抑制作用后的表现。由于省去抽提蛋白和裂解细胞的步骤，样本的损失也能降到最低，比起其他普通的ELISA 测定方法，这项全新的ELISA 技术能更快速、更方便地一次检测大量的细胞内蛋白。1.2 可同时检测两种不同蛋白：封闭后加入两种抗不同蛋白且来源于不同宿主的一抗，然后再加入不同的二抗，加入两种荧光底物，检测两个波长。同时检测两种蛋白的好处是显而易见的，可以减少工作量，此外还可以满足一些特殊的实验需要，例如，需要测定某个蛋白的磷酸化比例，就需要测定磷酸化蛋白的数量和总蛋白的数量，这两个测定在同一次实验进行，有助于消除实验误差，得到更为精确的实验结果。2、Cell-Based ELISA 的两种技术：某些公司发展了双通道Cell-Based ELISA技术；双通道与单通道Cell-based ELISA比较：双通道cell-based ELISA，顾名思义，即一次可以同时检测两种目的蛋白，R&D Systems提供的Cell-based ELISA就是双通道cell-based ELISA，原理略：（需要荧光检测方式和相应仪器）；单通道cell-based ELISA，即一次只能检测一种目的蛋白，他和普通ELISA的主要区别在于样品处理过程3、cell-based ELISA 的应用：该产品，最多发展起来的是用于检测磷酸化和非磷酸化蛋白的相对含量；4、有cell-based ELISA产品的公司：目前，多家elisa产品提供商均提供cell based elisa 试剂盒，如Rnd systems， raybiotech， ebioscience，millipore 等公司；5、如何自己进行cell based elisa实验？事实上，根据单通道的cell based elisa原理，可以自己建立cell based elisa实验系统；细胞加入培养板中；加入刺激物或者抑制剂进行培养；对细胞进行固定或者封闭；加入第一抗体；加入HRP 结合的二抗（二抗的选择，同western blot）；加入底物进行显色；

做好对照正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。实验条件的选择在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:（1）　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。（3）　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。（4）　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。进口分装：检测范围和灵敏度不同，用量少时，可使用分装，前期是它的长久性不是很好。试剂盒的标准曲线最高点OD 值均在2.0±0.2，零孔的OD 值都控制在0.10以下。试剂盒的标准曲线相关系数R≥0.98。试剂盒重复性好，板内、板间变异系数均<9 %。试剂的组份都多给20%的富余量，确保完成48/96孔的检测，避免分次检测可能造成试剂量不足的情况。检测抗体及酶结合物的稀释度合适(均为1:30), 方便试验操作者准确地做稀释工作，保证实验结果的重复性。白介素6是一种细胞因子,已被证实为B细胞分化因子.它是一种抗体形成系统,它的生理特性,如肝细胞急性蛋白合成的诱导和基于和白介素3协同作用的生长刺激等,也备受关注. 并且已证实白介素-6与病理学存在稳定的相关关系.例如,报道多种疾病的生长因子为白介素-6, 骨髓瘤细胞能合成白介素-6并表达白介素-6受体.此外, 白介素6在多种炎性疾病和自身免疫疾病发挥重要的作用. 此试剂盒能高灵敏度的检测小鼠血清和细胞基质上清的白介素6 原理 此试剂盒运用了两种特异性抗体,洗板后加入TMB底物液显色,显色的强度与小鼠的白介素-6的量成正比. 检测范围 10.94的 700 pg/mL 预期用途

酶联免疫吸附试验就是ELISA检测主要原理是利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法、间接法、以及竞争法三种为主

ELISA实验的原理似乎很简单，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，间中夹杂着洗涤和封闭。然而，即使是平淡无奇的洗涤和封闭，如果做得不太好，也有可能毁了整个实验。在实验结束时，我们是否能获得有意义的信息，这在很大程度上取决于结果的信噪比。背景噪音会影响您对结果的判断。如何降低ELISA的背景，下面有一些tips。洗涤很重要洗涤步骤看似很无聊，其实很重要，因为如果未结合的材料（如非特异结合的抗体或检测试剂）残留在微孔板中，那么它会增加背景噪音。如有必要，可增加洗涤液中的盐浓度，这会阻止非特异结合反应。如果背景过高，而您怀疑洗涤不够时，可以尝试增加洗涤次数。封闭更关键封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高，怀疑封闭不充分，那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液，或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰，那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间，但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液：蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素，包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合，但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。最常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定，在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用，因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度（正常浓度为0.01-0.1%），它会降低特异结合，产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液，后者可协助洗涤过程中的封闭。蛋白封闭液则有所不同，是永久的。它们与开放位点结合并封闭，同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。不过，它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。抗体浓度须优化我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤，但是如果试剂稍有不同，则可能需要优化抗体的量。记住，非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点，切勿使用过多的一抗或二抗。

ELISA实验的原理似乎很简单，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，间中夹杂着洗涤和封闭。然而，即使是平淡无奇的洗涤和封闭，如果做得不太好，也有可能毁了整个实验。在实验结束时，我们是否能获得有意义的信息，ELISA试剂盒这在很大程度上取决于结果的信噪比。ELISA试剂盒背景噪音会影响您对结果的判断。如何降低ELISA的背景，下面有一些tips。洗涤很重要洗涤步骤看似很无聊，其实很重要，因为如果未结合的材料（如非特异结合的抗体或检测试剂）残留在微孔板中，那么它会增加背景噪音。如有必要，可增加洗涤液中的盐浓度，这会阻止非特异结合反应。如果背景过高，而您怀疑洗涤不够时，可以尝试增加洗涤次数。封闭更关键封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高，怀疑封闭不充分，那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液，或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰，那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间，但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液：蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素，包括微孔板的表面试剂、ELISA试剂盒吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合，但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。ELISA实验最常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定，在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用，ELISA试剂盒因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度（正常浓度为0.01-0.1%），它会降低特异结合，产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液，后者可协助洗涤过程中的封闭。蛋白封闭液则有所不同，是永久的。它们与开放位点结合并封闭，同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。不过，它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。抗体浓度须优化ELISA实验我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤，ELISA试剂盒但是如果试剂稍有不同，则可能需要优化抗体的量。记住，非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点，切勿使用过多的一抗或二抗。检测试剂要适量另一点也很显而易见：切勿使用过多的检测试剂。如果浓度过高，或者未正确稀释，则会导致高背景。也不要显色过度，如有必要，优化一下何时应加入终止液。

单克隆抗体是利用单一的B细胞，克隆出具有高度的均一性，仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体的原理，目前在临床上的应用主要是应用在检验诊断方面和治疗方面。检验诊断方面主要可以用来检测某些病原微生物的抗原抗体，肿瘤抗原的检测，免疫细胞以及亚群的检测，还有激素的测定，或者细胞因子的测定。治疗上主要是用于肿瘤的靶向药物治疗中。例如利妥昔单抗、曲妥珠单抗，都属于单克隆抗体的抗肿瘤药物。另外，在肿瘤的放射免疫显像技术上，也可以应用到单克隆抗体的原理。

还是没有活的希望

CT 有2种意思克拉（符号：CT） 1克拉=0.2克（200毫克）医学中的CT全称：computed tomography　　CT是一种功能齐全的病情探测仪器，它是电子计算机X射线断层扫描技术简称。　　CT的工作程序是这样的：它根据人体不同组织对X线的吸收与透过率的不同，应用灵敏度极高的仪器对人体进行测量，然后将测量所获取的数据输入电子计算机，电子计算机对数据进行处理后，就可摄下人体被检查部位的断面或立体的图像，发现体内任何部位的细小病变CT是必杀技(所谓的必杀,简单的说就是会心一击了).爆击的意思. CT补正就是说在原有CT出现率的基础上根据武器的不同会带来不同的数值补正

坏死是指活体内范围不等的局部细胞死亡，死亡细胞的质膜崩解、结构自溶，并引发急性炎症反应。

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坏死（necrosis）：活体内范围不等的局部组织细胞死亡。 　　1、基本病变：细胞核：核固缩、核碎裂、核溶解。 　　细胞浆：红染、进而解体。 　　细胞间质：崩解2、类型：（1）凝固性坏死：坏死组织发生凝固，常保持轮廓残影。 　　好发部位：心肌、肝、脾、肾。 　　病理变化：肉眼：组织干燥，灰白色。 　　镜下：细胞结构消失，组织轮廓保存（早期）。 　　特殊类型：干酪样坏死（发生在结核病灶，坏死组织呈灰黄色，细腻。镜下坏死彻底，不见组织轮廓。） 　　（2）液化性坏死：坏死组织因酶性分解而变为液态。 　　好发部位：脑、脊髓等。 　　病理变化：坏死组织分解液化。 　　特殊类型：脂肪坏死（分为创伤性、酶解性，分别好发于乳腺、胰腺）。 　　（3）坏疽（gangrene）：大块组织坏死后继发腐败菌感染，所形成的特殊形态改变。 　　干性坏疽：好发于四肢末端，坏死组织干燥，边界清楚。 　　湿性坏疽：好发于肠管、胆囊、子宫、肺，坏死组织湿润、肿胀，边界欠清。 　　气性坏疽：常继发于深达肌肉的开放性创伤，由产气荚膜杆菌引起，坏死组织内含气泡呈蜂窝状。 　　（4）纤维素性坏死（fibrinoid necrosis）：坏死组织呈细丝、颗粒状，似红染的纤维素。 　　好发部位：结缔组织和血管壁。 　　疾病举例：急进性高血压、风湿病、系统性红斑狼疮。

歌曲名:Kinda Girl For Me歌手:Craig David专辑:Trust MeCraig David - Kinda Girl For MeYou are everythingYou are everythingAll of this timeThat you been waitingSeems like now you got what you want (ohh)You got me stuck on the realness (realness, realness)Give all your love all your realnessShe"s that kinda girlPretty about 5"6", small hips, with them cinnamon curlsYes a straight bravado girlMoney for new whips, makin" trips all around the worldYes she"s the kinda girl, always thinkin" on her feetThe type of girl that one day you"d like to meetGuess I found her, wanna be around herReally ain"t that hard for me to see (yeah)The truth is see I got it badBut there ain"t nothing wrong with thatFound a girl that makes me wanna goPlaces I ain"t never been beforeShe"s so sick like a dope melody sittin" nicely on top of the beat"Cos she"s a rider not a fighter, kinda girl for me (yeah)All of this time, that you been waitingSeems like now you got what you wantYou got me stuck on the realness (the realness, realness) (ohh)You got me stuck on the realnessI can"t really believe, it"s like I caught a fever, this feelin" takin" over meMaybe it"s L O V E, but for sure yes you"re a keeper, savin" all your, for meShe got that ability turn a spark into a flameLike a beautiful picture in a frameShe"s on fire, just got to admire, the way she be puttin" it down on me (yeah)The truth is see I got it badBut there ain"t nothing wrong with thatFound a girl that makes me wanna goPlaces I ain"t never been beforeShe"s so sick like a dope melody sittin" nicely on top of the beat"Cos she"s a rider not a fighter, kinda girl for me (yeah)Past relationships I"d loseI guess I never tried to see things throughThat"s how many other girls always on my mindStop actin" a fool, and I"ve got so much to prove"Cos now I found the right girl for meThe truth is see I got it bad (I got it bad baby)But there ain"t nothing wrong with that (ohh)Found a girl that makes me wanna go (wanna go)Places I ain"t never been before (never been before no)She"s so sick like a dope melody sittin" nicely on top of the beat (oh yeah)"Cos she"s a rider not a fighter, kinda girl for me (ooh baby) whoaaa whoa yeah, oh babyThe truth is see I got it bad (I got it bad baby)But there ain"t nothing wrong with that (yeah)Found a girl that make me wanna go(wanna go)Places I ain"t never been before (never been before no)She"s so sick like a dope melody sittin" nicely on top of the beat (oh yeah)"Cos she"s a rider not a fighter, kinda girl for me (yeah) (oh no)All of this time, that you been waitingSeems like now you got what you wantYou got me stuck on the realness (realness, realness)You got me stuck on the realnessGive all your love all your realnesshttp://music.baidu.com/song/1181113

面包皮的英文是 crust 名复: crusts 动变: crusted; crusted; crusting 也可解作 n. 1. 面包皮;干面包片;派饼皮 2. 硬外皮 外壳;冰面;雪壳 3. 地壳 4. 甲壳 5. 痂 6. 厚颜 无礼 vt. 1. 用硬皮覆盖;在...上结硬皮 vi. 1. 结成外壳;覆有硬皮 参考: .dictionary.yahoo/search?s=crust&t=m crust = 面包皮 参考: yahoo字典 面包皮的英文系crust。 参考: 字典 面包皮的英文 : crust 参考: 我老婆

CT是用X射线束对人体某部一定厚度的层面进行扫描，由探测器接收透过该层面的X射线，转变为可见光后，由光电转换变为电信号，再经模拟/数字转换器（analog/digital converter）转为数字，输入计算机处理。图像形成的处理有如对选定层面分成若干个体积相同的长方体，称之为体素（voxel）。扫描所得信息经计算而获得每个体素的X射线衰减系数或吸收系数，再排列成矩阵，即数字矩阵（digital matrix），数字矩阵可存贮于磁盘或光盘中。经数字/模拟转换器（digital/analog converter）把数字矩阵中的每个数字转为由黑到白不等灰度的小方块，即像素（pixel），并按矩阵排列，即构成CT图像。所以，CT图像是重建图像。每个体素的X射线吸收系数可以通过不同的数学方法算出。CT的主要用途如下：1.医学检测：自从CT被发明后，CT已经变成一个医学影像重要的工具，虽然价格昂贵，医用X-CT至今依然是诊断多种疾病的黄金准则。2.工业检测：现代工业的发展，使得CT在无损检测和逆向工程中发挥重大的作用。3.安保检测。4.航空运输、运输港湾，大型货物集装箱案件装置。人躺在仪器上通过一个类似扫描的东西就行了

坏死的解释[necrosis] 身体的 局部 组织 或细胞死亡。坏死后 原有 的功能丧失。形成坏死的 原因 很多,如局部血液 循环 中断,强酸、强碱等化学药品对局部组织的破坏 详细解释 身体的局部组织或细胞死亡。坏死后原有功能丧失。成因很多，如局部血液循环断绝，强酸、强碱等化学药品对局部组织的破坏等。 词语分解 坏的解释 坏 （坏） à 品质 恶劣 ，有害：坏蛋。坏人。坏事。坏水。 人体、 东西 受了损伤，被质量差，不完美：这所房子不坏。 表示 程度 深（用在 动词 后面）：忙坏了。 好 坏 ē 土丘：“千车拥孤隧，万马盘一坏。” 死的解释 死 ǐ 丧失 生命 ，与“生”、“活” 相对 ：死亡。死讯。死刑。死囚。死棋。死地。生离死别。死有余辜。 不顾生命：死志（ 牺牲 生命的 决心 ）。死士（敢死的武士）。死战。 固执 ， 坚持 到底：死心塌地。死卖力气。 无

我出生即坏但当我遇见你你让我变好了一阵但我的阴暗面依旧存在你从不关心我究竟做了什么在一家旅馆的舞厅唱歌我做了我该做的事蛇蝎美人，永远很忙我手腕上的钻石，舌头上的威士忌在我后退之前，我要先灌醉所以到我这边来，给我倒一杯冰的babe你能看到我身处险境在舞台上摇摇欲坠，yeah衣服上的亮片闪烁，是时间让步于陌生人的善意了我认为这挺有趣难道是错的么当我有枪击你的后脑的时候我把在他那两崭新卡车的后备箱里我真想让他回来但是我运气有点背是错的，我知道，杀掉什么人当你做过一次后会觉得稍微容易一些你知道我很有意思，你知道我很年强所以该告诉我的想法，我们来玩个痛快（真长啊，等会再翻下一部分）babe你能看到我身处险境光芒四射却精神错乱，yeah在舞台上摇摇欲坠，yeah看我说的这么好，你能做我的救世主么？我认为这挺有趣难道是错的么当我用枪击你的后脑的时候我爸正躺在他那辆新卡车的后备箱里我真想让他回来但是我运气有点背我认为这挺有趣难道是错的么当我用枪击你的后脑的时候我爸正躺在他那辆新卡车的后备箱里我真想让他回来但是我运气有点背我是个危险女孩你对于这个世界来说真是太善良了现在我又回归正常生活谁还想试一试我认为这挺有趣难道是错的么当我用枪击你的后脑的时候我爸正躺在他那辆新卡车的后备箱里我真想让他回来但是我绝对有点背我认为这挺有趣难道是错的么当我用枪击你的后脑的时候我爸正躺在他那辆新卡车的后备箱里我真想让他回来但是我运气有点背

白色字chunghwa中华拼音下面一行filter kings过滤嘴侧面filter cigarettes过滤嘴香烟

tension

吸尘器的工作原理是利用电机带动叶片高速旋转，在密封的壳体中产生空气负压，吸取尘屑。吸尘器能吸走灰尘的原因：吸尘器的吸尘能力与吸尘器内外压力差有关。压力差越大，吸尘能力就越强。这一压力差是由吸尘器利用电机的高速转动带动风叶组旋转，在吸尘器内部产生真空产生的。显然，真空程度与电机转速相关。因此，同功率电机，转速越快，吸力越大。吸尘器一般采用串式电机。串式电机的磁场绕组与电枢相连，磁场绕组中的电流随负载的不同而变化。在吸尘器中，电机的负载越轻，启动转矩越大，转速也越高，每分钟24转，可以在吸尘器内产生较大的真空。有了这个真空状态，吸尘器可以利用内外压力差来吸尘。

所有的工业吸尘器均遵循同样的工作原理：空气从密闭腔中被抽出并在内部形成真空状态。通过通风设备、涡轮和侧槽风机或产生气流的其他设备来抽吸空气。外面的气流通过密闭腔的入口进入，因为整体气体需要抵消真空。如果开口与抽吸软管相连并且气流速度足够大，那么从原则上来说，就形成了真空状态。然而：随着空气吸入密闭腔中的所有颗粒也通过涡轮（如果经过了的话）吹出来，这将会使得这些颗粒仅仅在其周围回转。因此，系统需要一些机制来将吸入的颗粒物与吸入的空气分离。事实上，吸尘就是利用我们周围的空气施加压力！ 这也让我们知道吸尘技术参数的局限性所在。无法获得大约超过1巴的空气压力。在原始进气口处测得的空气速度与抽吸装置产生的真空压力（单位为毫巴）直接相关。

1、Business Hours 营业时间 2、Office Hours 办公时间 3、Entrance 入口 4、Exit 出口 5、Push 推 6、Pull 拉 7、Shut 此路不通 8、On 打开 ( 放) 9、Off 关 10、Open 营业（注：多用于商店等营业场所） 11、Pause 暂停

一、CR(DR)和CT、核磁的区别：1、CR和DR拍的是放射物所照射的平面，原理是像拍普通照片。CR是计算机数字化X线成像信息的采集板储存扫描然后在显示。而DR是直接性模拟型号转化为数字信号在屏幕显示。可以拍骨骼。2、CT拍的是横截面，计算机把各个角度的照射平面图像组合在一起，是利用高速旋转的方式拍摄，确定病灶的准确位置。3、核磁共振和以上的设备没有任何关系，他是利用的核物理氢原子共振成像。而以上都是利用放射性射线成像。核磁共振(MRI)是核物理和以上的发射成像方式截然不同。是利用原子，在一定强度的的外加磁场中，其原子核自旋进动的频率是固定不变的。对人体各部分结构显示十分清晰。也可以显示骨骼情况。二、为什么医院有DR还要有CT1、DR和CT的检查收费是不同的2、DR和CT的检查准备流程和针对目标也不同，头部骨骼一般都是用CT的，其余的骨骼多数是平面拍照。根据患者实际情况选择。3、CT使用、维护成本大于DR。扩展资料核磁共振成像是一种新型的影像检查技术，不会对人体健康有影响，但六类人群不适宜进行核磁共振检查即：安装心脏起搏器的人、有或疑有眼球内金属异物的人、动脉瘤银夹结扎术的人、体内金属异物存留或金属假体的人、有生命危险的危重病人、幽闭恐惧症患者等。另外，怀孕不到3个月的孕妇，最好也不要做核磁共振检查。CT是用X射线束对人体某部一定厚度的层面进行扫描，由探测器接收透过该层面的X射线，转变为可见光后，由光电转换变为电信号，再经模拟/数字转换器（analog/digitalconverter）转为数字，输入计算机处理。参考资料来源：百度百科：核磁共振参考资料来源：百度百科：CR参考资料来源：百度百科：CT

kinda 在这里用做副词，表示有点

吸尘器什么原理八年级物理。通电后，吸尘器抽风机上的叶轮会高速转动产生极强的吸力和压力，在吸力和压力的作用下，空气从风机后端高速排出。而风机前端吸尘部分的空气不断地补充风机的空气，致使吸尘器内部产生瞬时真空，使灰尘进入滤尘袋，灰尘等杂物滞留在滤尘袋内，空气经过滤片净化后，由机体尾部排出。吸尘器的基本结构按功能分为五个部分：动力部分，吸尘器电机和调速器。调速器分手控、机控。电机，有铜线电机和铝线电机之分。铜线电机有耐高温、寿命长、单次操作时间长等优点，但价格较铝线比较高。铝线电机有着价格低廉的特点，但是耐温性较差、熔点低、寿命不及铜线长。调速器，手控式一般为风门调节，机控式为电源式手持按键或红外线调节。

阿斯伯格症的症状类似自闭症，但是症状比较轻微。事实上，阿斯伯格症和自闭症在诊断上同属于“泛自闭症障碍症候群”（AutisticSpectrumDisorders，简称ASD）。自闭症（Autism）是指合并有认知功能，语言功能及人际社会沟通等方面之特殊病理，以致罹患者之社会生活适应有显著困难之广泛性发展障碍。NT，即Neurotypical，神经学典范，神经学典范最初是自闭症社群生造用于指明那些不在自闭症谱系上的人，其后发展为泛指无神经学特异表现的人。扩展资料：阿斯伯格症的病因不明，但研究显示，遗传基因、生物化学、过滤性病毒、妊娠期和分娩时出现的一些问题，都可能是阿斯伯格综合征的原因。罹患阿斯伯格综合征的机率为0.7%，即平均每一千名新生婴儿会有7名婴儿是患者。自闭症对儿童的影响是非常大的，生活中如果孩子出现自闭，那么做家长的平时需要多多关注孩子的表现，如果患有自闭症能够尽早发现。参考资料来源：百度百科-阿斯伯格百度百科-自闭百度百科-神经学典范

m the beginning of the desert,

she"s having my baby是tension的第二张专辑《做你的男人》里面的一首歌曲

有点儿意思。

CT是用X射线束对人体某部一定厚度的层面进行扫描，由探测器接收透过该层面的X射线，转变为可见光后，由光电转换变为电信号，再经模拟/数字转换器（analog/digital converter）转为数字，输入计算机处理。图像形成的处理有如对选定层面分成若干个体积相同的长方体，称之为体素（voxel）。扫描所得信息经计算而获得每个体素的X射线衰减系数或吸收系数，再排列成矩阵，即数字矩阵（digital matrix），数字矩阵可存贮于磁盘或光盘中。经数字/模拟转换器（digital/analog converter）把数字矩阵中的每个数字转为由黑到白不等灰度的小方块，即像素（pixel），并按矩阵排列，即构成CT图像。所以，CT图像是重建图像。每个体素的X射线吸收系数可以通过不同的数学方法算出。CT的工作程序是这样的：它根据人体不同组织对X线的吸收与透过率的不同，应用灵敏度极高的仪器对人体进行测量，然后将测量所获取的数据输入电子计算机，电子计算机对数据进行处理后，就可摄下人体被检查部位的断面或立体的图像，发现体内任何部位的细小病变。

putthingsintoperspective的意思是全面的看待事物.我们应该全面的看待事物