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实时荧光定量PCR和定量PCR有什么区别

2023-08-23 11:15:57
TAG: cr pcr
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牛云
完全两个不同的概念,梯度pcr是指你的pcr仪在设置的时候可以同一时间不同位置设置一个从高到低的温度梯度,以便在不知道退火温度的情况下选择一个最适宜的退火温度。二实时荧光定量pcr是通过再pcr过程中掺入荧光染料或释放荧光基团,从而对模板进行相对定量或绝对定量的实验,在实时荧光定量pcr时也可以设置梯度,总的来说实时荧光定量pcr是一种实验方法,而梯度pcr是一种实验手段
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实时荧光定量PCR和定量PCR有什么区别

实时荧光是反应荧光数值定量,普通那种是通过条带半定量,现在做半定量的已经很少了,除非是一些验证试验必须要图的

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荧光定量pcr原理

荧光定量pcr原理如下:荧光定量PCR(Real-time PCR),是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团,通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以探针法荧光定量PCR为例:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时,探针完整地结合在DNA任意一条单链上,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,检测不到荧光信号;PCR扩增时,Taq酶将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。传统的PCR进行检测时,扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离,并且只能作定性分析,不能准确定量,易造成污染出现假阳性,使其应用受到限制。实时定量PCR技术不仅实现了对模板的定量,且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点,使得荧光定量PCR逐渐取代常规PCR。在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即是基线,这条线是可以自动生成也可以手动设置的。之后反应会进入指数增长期,这个期间扩增曲线具有高度重复性,在该期间,可设定一条荧光阈值线,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般会将荧光阈值的缺省设置是3—15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值,这个值与起始浓度的对数成线性关系,且该值具有重现性。Ct值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量,此时就有两个概念容易被提及,那就是绝对定量和相对定量,绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。Ct值诚然可以被利用来计算这两种定量结果,但是绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线。绝对标准品制作困难难以获取,实验室基本都是选择相对定量的方法来计算相对基因表达量。
2023-08-15 15:34:011

荧光定量pcr原理

荧光定量PCR原理:随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。荧光定量PCR最早称TaqMan PCR,后来也叫Real-Time PCR,是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的一般而言,荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化。而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加,PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段, PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便,在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和 CT值。荧光域值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍,即threshold。Ct 值:是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系:研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值如下图所示。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光定量检测荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术(分子信标技术,以美国人Tagyi为代表)、 TaqMan探针(以美国ABI公司为代表)和FRET技术(以罗氏公司为代表)等;荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料,非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ;饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。嵌合荧光染料法(SYBR GreenⅠ)SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料,与双链DNA非特异性结合。在游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合,其荧光增加1000倍。所以,一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列,且会随扩增产物的增加而增加。
2023-08-15 15:34:311

荧光pcr法是什么?

荧光pcr法是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。也叫实时荧光定量PCR技术。荧光-PCR法技术原理:将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中。在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
2023-08-15 15:34:471

荧光定量PCR(FQ-PCR)的原理和优点是什么

博凌科为-为你解答:荧光定量PCR:融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和荧光 淬灭基团),结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术。主要原理是在待扩增区域结合上DNA探针,PCR过程中,具有53外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时,将DNA探针逐个降解,释放出荧 光报告基团,这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间存在正比关系,可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。荧光定量PCR的优点: 1.可进行准确的定量检测。用于基因诊断。 2.定量范围宽。 3.特异性更强,克服了假阳性。 4.操作简单快速,无须后处理和电泳检测。 5.安全,技术易于学习,易于进行电脑化数据管理。
2023-08-15 15:35:131

概述荧光定量PCR技术的原理。

又称实时PCR技术。该技术在常规PCR基础上,添加了一条标有两个荧光基团的荧光双标记探针,一个标记在探针的5u2032端称为报告基团(Reporter,R);另一个标记在探针的3u2032端称为荧光抑制基团或称淬灭基团(Quencher,Q)。两者可构成能量传递结构,即5u2032端R发出的荧光信号可被3u2032端R基团抑制。3u2032端的-OH已被封闭,不具有延伸的能力。探针引物在无特异性PCR扩增时,荧光信号不改变。在PCR反应开始后,随着链的延长,荧光定量PCR的Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合部位,发挥它的5u2032-3u2032外切酶活性,将荧光探针切断。一但切断,Q基团的抑制作用消失,从而引起R基团的荧光信号增长,被释放的游离R基团的数目和PCR产物的数量是一对一的关系,因此R基团的荧光信号的强弱就与PCR产物的数量成正比关系。测定出前者就可以推算出后者。这就是荧光定量PCR的原理。在PCR的过程中,连续不断地检测反应体系中的荧光信号的变化,当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和标准差,计算出99.7%的置信度大于平均值的荧光值,即阈值),此时循环次数(ct)就被记录下来,该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系,利用阳性梯度标准品的ct值,制成标准曲线,再根据样品的ct值就可以准确定出起始DNA的拷贝数。
2023-08-15 15:35:211

荧光定量PCR(一)— 基础介绍

当有入射光照射物质时,其分子会吸收入射光的能量从而受到激发使得其电子由低能级跃迁至高能级,此时处于激发态的分子其结构并不稳定,会通过跃迁而失去能量返回基态,这个过程会伴随着荧光或者磷光的产生。如图所示 所有荧光物质都具有两个特征光谱,也即激发和发射光谱。 通常情况下,物质的发射光波长总是大于其激发光波长,这是因为,物质在收到激发的过程中,存在着一定的能量损失。激发和发射光波长的差值称之为斯托克位移。 荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或者化学作用过程 荧光淬灭的形式很多,机理也比较复杂。主要有如下几种类型 荧光定量PCR技术是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。为了达到高效反应,应将实时PCR应用的引物设计为能生成短的扩增子。常用的方法有SYBR Green的荧光染料法和TaqMan探针法,两种方法的特点及应用如下表: 由于目前不同荧光定量PCR仪的原理和提供的检测光光谱范围的差异,因此在选择探针的发光基团和淬灭基团时一定要根据所用的仪器型号设置的可检测的荧光信号范围内选择(探针法可连接我们的荧光定量PCR试剂盒的编号及对应的机器型号) 由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes),或称"TaqMan"探针,用于Real Time PCR实验。由于这些淬灭染料的光谱学性质不同(见下图),作为淬灭基团使用时的特点也不同,现说明如下:
2023-08-15 15:35:281

荧光定量pcr

荧光定量pcr(也称taqmanpcr,以下简称fq-pcr)是美国pe(perkinelmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术,该技术是在常规pcr基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的,与变通pcr相比,fq-pcr具有许多优点。
2023-08-15 15:35:512

简述定量PCR的原理和过程

引物,四种脱氧核糖核苷酸,DNA序列,耐高温的DNA聚合酶额额额原理啊 啊,就是碱基互补配对原则把,,55555
2023-08-15 15:35:594

荧光PCR技术的原理是什么?

http://baike.baidu.com/view/1478017.htm
2023-08-15 15:36:122

荧光定量pcr技术是检查什么

妇科的荧光定量检查,它主要是用于支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。常常需要用专门的药敏试验来确诊敏感药物,然后再选择敏感药物对症治疗。如果女性朋友对相应的药物敏感,可以选择相应的进行口服。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。
2023-08-15 15:36:211

荧光定量pcr是检查什么

  荧光定量pcr是检查支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。   实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。   Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。
2023-08-15 15:36:311

什么是荧光PCR检测?是用荧光标记基因吗?一直不明白,蛋白可以发光,怎么标记基因能发光呢

荧光定量pcr会加入带有荧光基团的探针,探针是能和目的基因结合的单链dna,如果合成双链dna后,荧光基团就会激活发光,所以实时检测反应物的荧光强度,反应的就是双链dna的浓度,由于合成双链dna的速率和模板浓度有关,所以和参考曲线比较以后是可以计算出模板的相对浓度,当模板是信号rna是,其反应的就是基因发达的量。
2023-08-15 15:36:423

实时荧光定量PCR与普通PCR的区别是什么?结果有何异同?能说明的问题是什么?

二者结果相同。都能说明生物体外的特殊DNA复制的整个过程的扩增效率和溶解温度情况。区别:1、二者系统组成不同荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。2、二者原理不同荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光,普通OCR通过检测插入DNA中核算染料的量来测定PCR最终产物量。3、二者反应要求不同荧光定量PCR对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp,普通PCR可以扩增长点的片段。4、二者应用不同荧光定量PCR主要是用来定量分析和确定基因转录水平的,普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段,定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作,反之不行。5、二者测量成本不同定量PCR仪价格较为昂贵,普通的基因扩增仪(PCR仪)只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多,而且运行成本也要低很多。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。参考资料来源:百度百科-实时荧光定量PCR参考资料来源:百度百科-PCR
2023-08-15 15:36:521

荧光定量PCR为什么先提RNA

可以看一下荧光定量PCR 的原理。http://www.majorbio.com/Products/Real_Time_PCR
2023-08-15 15:37:193

荧光定量PCR中分子信标技术的原理? fgege

分子信标是一段呈茎环结构的寡核苷酸探针,中间的环序列与目标核酸序列互补,茎的两端分别连的荧光分子和猝灭分子,如下图: 当无目标核酸序列时,荧光分子和猝灭分子距离近,荧光分子发出的能量被猝灭分子吸收并以热能消耗,不发荧光;当有目标核酸序列时,中间的环序列与目标核酸序列结合,荧光分子和猝灭分子距离远,此刻猝灭分子不能吸收荧光分子的能量,可以检测到荧光. 大概原理就这样,分子信标技术属于RT-PCR中的荧光探针,详细的原理和技术应用变化找几篇文献看看吧. 觉得可以别忘了给最佳答案哈,还有疑问就追问或者百度HI我,都OK!
2023-08-15 15:37:291

实时定量PCR的结果是怎样分析的

BIOGHSC Super Probe Kit在20ul的反应体系里,只要有几个拷贝的DNA分子就能被检测出来,具有非常强的抗干扰能力,能够对土壤、粪便、肿瘤和血液来源的复杂样本中的靶基因进行检测分析,适合探针法定量PCR检测,试剂以预混液的形式包装,使用极其方便。
2023-08-15 15:37:467

PCR的原理是什么 的原理是什么,它有什么用途

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶(DNA polymerase I)最早于1955年发现 ,而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌(Thermus aquaticus)分离出来的。它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的 酶,但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的,Dr. Mullis当年服务于PE公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 [PCR原理][编辑本段]DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
2023-08-15 15:38:492

探针法pcr,为什么初始本底荧光很强

荧光定量PCR法检测的是SYBR Green掺入到双链DNA中的量。SYBR Green掺入到双链DNA中后会发出荧光。但是只要是双链,它都掺。而探针法是当探针结合到目标序列上以后,聚合酶降解探针后,探针上自带的荧光基团离开淬灭基团,从而发出荧光。从两者的原理上来看,不难判断,荧光PCR法更加简单方便,而且成本低。而探针法特异性更强。
2023-08-15 15:39:201

什么是实时荧光定量PCR?有什么作用?请详细说明。

好多生物工作做广告做培训噢。你怎么不去看一下。
2023-08-15 15:39:292

什么是荧光PCR检测?是用荧光标记基因吗?一直不明白,蛋白可以发光,怎么标记基因能发光呢

想想萤火虫吧,它为什么能发光?它身上不可能有灯泡吧。那就是荧光蛋白。很多蛋白在紫外光激发下都能产生荧光的,这是物理中吸收能量,释放能量的过程。至于荧光PCR检测。如楼上几位所说的,就是用荧光基团嵌合到DNA中,根据荧光的亮度判断DNA的量,从而达到一种定量的检测。
2023-08-15 15:39:433

荧光定量PCR技术中的扩增效率什么意思

PCR原理中,反应一个循环,PCR产物扩增一倍,即为之前的2倍.……反应N个循环,理论上应为原来的2的N次方.此时,理论的扩增效率是100%,即1. 但实际上,由于酶,dNTPs,引物,模板等因素,扩增效率达不到100%. 因此,我们就要做标准曲线,看实际的扩增效率是多少,也就是标准曲线的斜率.理论上100%的扩增效率,换算出来的斜率是-3.32.
2023-08-15 15:39:591

荧光定量pcr对基因进行定量分析的原理是什么?有哪些应用

假如模板分子有一个,那么经过一轮pcr,就变成2个,这两个经过又一轮pcr,变成了4个,依次……,发现经过40轮,变成了2的40次方个,伴随着每轮pcr有荧光探针的水解,根据荧光情况判断原始产量,推算初始模板量。
2023-08-15 15:40:091

荧光定量PCR对初始模板量进行定量分析的原理是什么?

基于以下的理论. 1.每一个循环都会扩增一倍 2.引物扩增的效率一致 所以,如果结果X循环,产物得到了2的X次方.如果起始模板只有一半量,那产物就是2的(x-1)次方.如果起始模板的量是一倍,那产物就是2的(x+1)次方,以此类推. 只要在产物指数增加的阶段测量扩增曲线,就可以计算出起始模板的量
2023-08-15 15:40:191

rtpcr和实时荧光定量pcr区别是什么?

rtpcr和实时荧光定量pcr区别如下:1、所说的PCR应该就是最常规的PCR,以DNA为模板,通过上下游引物,实现DNA的扩增。2、RT-PCR一般情况下是指反转录PCR(reverse transcription),尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也(realtime fluores-cence quantitative PCR)也简称RT-PCR,但是这是不对的,不推荐。基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录,然后将所获得的cDNA作为模板,设计引物进行扩增,是一种检测基因表达的常用方法。3、实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR,其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。至于三者的关系,RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR,在RNA实验中,这二者都会应用到。例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异,首先你要提取2个组织的总RNA,然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达,然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异。PCR原理:DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。
2023-08-15 15:40:431

探针法荧光定量PCR

荧光定量PCR法检测的是SYBR Green掺入到双链DNA中的量。SYBR Green掺入到双链DNA中后会发出荧光。但是只要是双链,它都掺。而探针法是当探针结合到目标序列上以后,聚合酶降解探针后,探针上自带的荧光基团离开淬灭基团,从而发出荧光。从两者的原理上来看,不难判断,荧光PCR法更加简单方便,而且成本低。而探针法特异性更强。所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的,因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率,这意味着每次循环中,体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定,那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。如果扩增子的二级结构不能避免,则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中,我们要进行BLAST和类似的分析,以确保特异性。
2023-08-15 15:41:081

恒温PCR和实时荧光定量PCR这两种有什么区别?哪个更有优势?

实时荧光PCR方法灵敏度略高于恒温PCR,但仪器昂贵,试剂消耗也相对更贵,适合向高端客户推广;恒温PCR大部分性能与实时荧光PCR相对,灵敏度稍低于实时荧光PCR,但仪器性价比高,更利于推广。实际推广中对高端客户可以采取用恒温PCR作为契机,在交流中如客户对灵敏度有高要求而又有一定实力的可推荐使用实时荧光PCR产品。
2023-08-15 15:41:192

rtpcr和实时荧光定量pcr区别是什么?

rtpcr和实时荧光定量pcr区别就是过程不同,具体如下:RT-PCR一般情况下是指反转录PCR。基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录,然后将所获得的cDNA作为模板,设计引物进行扩增,是一种检测基因表达的常用方法。实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR,Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。PCR原理:DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。
2023-08-15 15:41:421

PCR和实时荧光定量PCR这两种有什么区别

原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光.反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段.如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳.结果:荧光定量可以实现精确定量,普通pcr则不行.荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通pcr无法实现的.如果还不清楚建议去丁香园等网站逛逛,希望可以帮到你
2023-08-15 15:42:001

荧光定量PCR用10ul反应成吗

荧光定量PCR用10ul反应成荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。|||原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光。反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳。结果:荧光定量可以实现精确定量,普通pcr则不行。荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通pcr无法实现的。|||这个还真不大清楚|||貌似前者是定量,后者属于半定量。|||简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段,用于克隆、测序等实验,后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量,而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人讲过普通PCR后,通过电泳也可以进行定量,其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。|||引物设计是sybr定量PCR法的最大难点,机会好的话,设计一对引物就能得到很好的结果,机会不好的话7、8对引物也出不来,我就遇到过这样的问题,我在prime5.0上设计了8对引物,符合实验要求的一对也没有,我把退火温度提高到了68度也没能把引物二聚体搞定,后来我想通了,可能我这对引物把其它序列扩增出来了,而且扩增效率很高(我一个同学设计了十几对才找到一对好用的)。记住primer5.0设计出来的100%好的引物,到了定量PCR上不一定好使,这是我最大的经验。定量pCR的引物对匹配度要求不高,我现在使用的引物就有几个碱基不匹配,但实验结果很好。有一个办法可以帮助我们绕过引物设计这道坎,直接到罗氏网站上专区上找引物。罗氏网站在线有一个引物设计软件,你只要找好你目的基因的种属,输入你的片段序列就可以得到你要的引物。这个软件有很大的好处,他会自动地把你的种属序列背景扣除,最大限度地去除引物二聚体产生的可以。
2023-08-15 15:42:101

荧光定量pcr为什么能够测基因表达差异

概述荧光定量pcr(realtimefluorescencequantitativepcr,rtfqpcr)是1996年由美国appliedbiosystems公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对pcr产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。原理pcr扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时,探针结合在dna任意一条单链上;pcr扩增时,taq酶的5"端-3"端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条dna链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步。
2023-08-15 15:42:192

实时荧光定量PCR技术原理是什么?

聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增 。在扩增反应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过 放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析 。无论定性还是定量分析,分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下,我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中,引入了一种荧光化学物质,随着 PCR 反应的进行, PCR 反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。生物帮上面有相关知识, http://www.bio1000.com/zt/cell/201378.html 动物细胞培养, 植物细胞培养, ES细胞(胚胎干细胞)培养, 细胞悬浮培养, 贴壁细胞培养。
2023-08-15 15:42:451

荧光定量pcr技术是检查什么

  妇科的荧光定量检查,它主要是用于支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。常常需要用专门的药敏试验来确诊敏感药物,然后再选择敏感药物对症治疗。如果女性朋友对相应的药物敏感,可以选择相应的进行口服。   实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。
2023-08-15 15:43:111

荧光pcr法是什么?

一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。技术原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中。在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
2023-08-15 15:43:201

PCR,RT-PCR,实时荧光定量PCR的区别与联系

你所说的PCR应该就是最常规的PCR,以DNA为模板,通过上下游引物,实现DNA的扩增RT-PCR一般情况下是指反转录PCR(reverse transcription),尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也(realtime fluores-cence quantitative PCR)也简称RT-PCR,但是我觉得这是不对的,不推荐。基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录,然后将所获得的cDNA作为模板,设计引物进行扩增,是一种检测基因表达的常用方法。实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR,原理有点多,请自行百度百科,其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。至于三者的关系,RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR,在RNA实验中,这二者都会应用到。例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异,首先你要提取2个组织的总RNA,然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达,然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异
2023-08-15 15:43:382

实时荧光定量PCR与普通PCR的区别是什么?结果有何异同?能说明的问题是什么?

所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行“定量分析”的方法。记住,实时荧光定量是定量分析
2023-08-15 15:44:115

力康普通pcr仪和荧光定量PCR有什么区别?

二者结果相同。都能说明生物体外的特殊DNA复制的整个过程的扩增效率和溶解温度情况。区别:1、二者系统组成不同荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。2、二者原理不同荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光,普通OCR通过检测插入DNA中核算染料的量来测定PCR最终产物量。3、二者反应要求不同荧光定量PCR对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp,普通PCR可以扩增长点的片段。4、二者应用不同荧光定量PCR主要是用来定量分析和确定基因转录水平的,普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段,定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作,反之不行。5、二者测量成本不同定量PCR仪价格较为昂贵,普通的基因扩增仪(PCR仪)只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多,而且运行成本也要低很多。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。
2023-08-15 15:44:421

荧光定量pcr技术是检查什么

妇科的荧光定量检查,它主要是用于支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。常常需要用专门的药敏试验来确诊敏感药物,然后再选择敏感药物对症治疗。如果女性朋友对相应的药物敏感,可以选择相应的进行口服。 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。
2023-08-15 15:44:521

反转录PCR和荧光定量PCR

单独做荧光定量PCR就够了。反转录PCR只能叫半定量。非常精准的定量方法还是实时荧光定量PCR。通过荧光强度实时监测产物产生量的变化。
2023-08-15 15:45:033

荧光定量pcr是检查什么

荧光定量pcr是检查支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。 实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。
2023-08-15 15:45:131

PCR和实时荧光定量PCR这两种有什么区别?

PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5"-3")的方向合成互补链。(来自百度百科)实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。(来自百度百科)普通PCR和实时荧光定量PCR的不同,是不同在实时荧光定量PCR的系统中加入了荧光染料(SYBR Green 或Taqman 探针等等)。以SYBR Green为例,这种染料可以结合在双链的DNA上,当PCR不断进行时,每一次退火生成的双链DNA也在增加,荧光染料结合也越多,荧光也越强。在机器中有一个探测荧光的探头,可以定量检测荧光的强度,转换成数值。这样就可以实时记录反映体系中DNA的反应情况。
2023-08-15 15:45:261

荧光定量PCR与普通PCR相比有哪些不同?.生意经求助

荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。|||原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光。反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳。结果:荧光定量可以实现精确定量,普通pcr则不行。荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通pcr无法实现的。|||这个还真不大清楚|||貌似前者是定量,后者属于半定量。|||简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段,用于克隆、测序等实验,后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量,而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人讲过普通PCR后,通过电泳也可以进行定量,其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。|||引物设计是sybr定量PCR法的最大难点,机会好的话,设计一对引物就能得到很好的结果,机会不好的话7、8对引物也出不来,我就遇到过这样的问题,我在prime5.0上设计了8对引物,符合实验要求的一对也没有,我把退火温度提高到了68度也没能把引物二聚体搞定,后来我想通了,可能我这对引物把其它序列扩增出来了,而且扩增效率很高(我一个同学设计了十几对才找到一对好用的)。记住primer5.0设计出来的100%好的引物,到了定量PCR上不一定好使,这是我最大的经验。定量pCR的引物对匹配度要求不高,我现在使用的引物就有几个碱基不匹配,但实验结果很好。有一个办法可以帮助我们绕过引物设计这道坎,直接到罗氏网站上专区上找引物。罗氏网站在线有一个引物设计软件,你只要找好你目的基因的种属,输入你的片段序列就可以得到你要的引物。这个软件有很大的好处,他会自动地把你的种属序列背景扣除,最大限度地去除引物二聚体产生的可以。
2023-08-15 15:45:401

一个目的基因在质粒上,如何将其扩增出来并做实时荧光定量PCR?

引物当然要有酶切位点啦,这个是必要的,还需要有保护碱基还有和目的基因对应的差不多有20个碱基
2023-08-15 15:45:502

什么是实时荧光定量pcr

实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。
2023-08-15 15:46:001

荧光定量PCR仪中检测通道的激发光都是靠滤波片来完成的,假如光源为卤钨灯,求滤波片的工作原理

不同的激发光需要不同的滤波片,光源一般为氙灯或汞灯(光电转移效率高),卤素灯是用于明视场照明使用的(发热量高,产生的光子能量弱,对细胞没什么损伤,但不足以激发荧光)
2023-08-15 15:46:241

实时荧光定量pcr内参是什么东西

如果对内参要求很高的话,可以筛选合适内参,有免费的软件,比如geNorm,normfinder等
2023-08-15 15:46:366

请问:做荧光定量PCR时,△△Ct值是什么意思,它的计算公式是什么?

我这边有关于△△Ct法的相关文献以及推导公式,方便的话可以给我留一下你的邮箱
2023-08-15 15:47:154

taqman 荧光 pcr 检测技术和实时荧光定量pcr技术的区别

原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光.反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段.如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳.结果:荧光定量可以实现精确定量,普通pcr则不行.荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通pcr无法实现的.如果还不清楚建议去丁香园等网站逛逛,希望可以帮到你
2023-08-15 15:47:581

普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别

实时定量的引物设计要求比较高,可以按普通引物设计的方法来做,但是设计时要注意扩增的片段不能太大,最好在250bp-100bp之间。同时要保证这对引物有绝对的特异性,因为要是产生非特异性扩增的话,就不能准确的计量模板量了,这样就失去了实时定...
2023-08-15 15:48:114

请问:做荧光定量PCR时,△△Ct值是什么意思,它的计算公式是什么?

△△Ct是荧光定量计算公式的简化形式,用于比较不同样品之间的差别或变化比率。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgXu2080+lgN/lg(1+Ex),其中,n为扩增反应的循环次数,Xu2080为初始模板量,Ex为扩增效率,N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。△Ct(n)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);△△CT(n)=△Ct(n)-△Ct(1)。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。扩展资料荧光定量PCR的原理:荧光定量PCR技术:在PCR反应体系中加入荧光基团,通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程,然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中,对全程PCR扩增过程进行实时检测,根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。实时荧光定量常用的荧光化学分类有SYBR Green I法和Tag Man探针法。Ct值:C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。参考资料来源:百度百科-荧光定量PCR参考资料来源:百度百科-实时荧光定量PCR
2023-08-15 15:48:511

荧光PCR法与PCR荧光探针法有何不同

荧光定量PCR法检测的是SYBR Green掺入到双链DNA中的量。SYBR Green掺入到双链DNA中后会发出荧光。但是只要是双链,它都掺。而探针法是当探针结合到目标序列上以后,聚合酶降解探针后,探针上自带的荧光基团离开淬灭基团,从而发出荧光。从两者的原理上来看,不难判断,荧光PCR法更加简单方便,而且成本低。而探针法特异性更强。
2023-08-15 15:49:092