psiCHECK-2质粒转染细胞后，用什么药物筛选稳定克隆

细胞转染对初接触细胞实验的科研人员而言，是一道难过的坎儿，细胞转染率低的话，你珍贵的细胞可能就只能扔掉了。 大家都知道，细胞是由带负电荷的磷脂双分子层构成，这对大分子物质来说是个不可透过的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，为了使核酸穿过细胞膜，开发了多种技术，大致可分为物理介导、化学介导和生物介导。 几种常见的转染方法： 1、脂质体转染法 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。 2、磷酸钙共沉淀法 该方法可重复性差，而且磷酸钙溶液对温度、pH和缓冲盐浓度的变化十分敏感，对细胞尤其是原代细胞毒性较大，也不能采用RPMI培养基，因为其含有高浓度的磷酸盐。 3、电穿孔转染法 电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔。 当遇到某些脂质体转染效率很低或几乎无法转入时可以用电穿孔法转染。 一般情况下，高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。现在针对细胞死亡开发出了一种电转保护剂，可以大大的降低细胞的死亡率，同时提高电穿孔转染效率。 4、病毒感染 对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系可以采用病毒感染，腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒和慢病毒载体已广泛用于哺乳动物细胞体内外的基因转染，转染效率比较高，适用于较难转染的细胞。 但是插入的片段长度有一定限制，最重要的是技术难度比较高，在一般实验室中很难普及，而且某些病毒起效时间比较慢，跟不上细胞这种快速繁殖的速度，如果只是做简单细胞系的转染性价比不高。 没有一种方法适用于所有的细胞和实验，理想的方法应根据细胞类型和实验需要进行选择，如果只是在细胞水平做，而且用的是简单细胞系，那么脂质体转染是综合比较起来不错的一个方法。 所以，我们主要来探讨一下脂质体转染： 进行实验之前，请先规划好你的实验，一般细胞转染需要24h-72h，所以要充分了解细胞生长速度，计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：Opti-MEM无血清培养基，Lipofectamine转染试剂，以及DNA，这个一定要确认好，否则生气都没办法怪别人。 做好以上准备后，具体的操作步骤如下： 　1、细胞铺板 (1)一般会选择复苏细胞传代3-4次(汇合率达到90%之前对细胞进行传代，不要长到100%)，从解冻过程中恢复过来可以稳定生长的细胞进行细胞转染，传代次数高(>30-40)时，细胞的生长速度和形态会改变。 (2)如果提总蛋白，一般选择六孔板进行转染，因为转染的细胞提取蛋白的总量能达到200ug，一般够做并且需要的DNA和Lipofectamine又相对比较少。 (3)传代条件取决于所用的细胞系。对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK293)。对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)。 (4)转染当天，将细胞铺板。如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降，如果是简单细胞系的转染，可以直接在前一天晚上铺板，第二天来转染。转染时，细胞密度会影响转染效率，细胞密度保持在汇合率为70-90%(这个前提是转染24h，如果转染48h则需要汇合率为50-70%)，细胞的铺板和转染也可同时进行。 2、细胞转染 吸去培养皿中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。更换无血清培养基。准备转染制备液，用灭菌后的EP管制备。 以六孔板为例，A液：用200μl Opti-MEM稀释4μg质粒;B液:用200μl Opti-MEM稀释10μl lipo2000，分别将A液、B液轻轻混匀，静置5min，吸取B液加入至A液中，轻轻混匀，室温静置20min。 加入转染试剂到每个孔的培养基中，6h后，更换成完全培养基，继续培养到24-48小时(不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。质粒：脂质体=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例，一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率)。以下为不同规格的培养板需要加DNA和lipo2000的量。 转染时，应使用优质质粒： 1、通过测量OD 值来确定DNA纯度和浓度，测得的OD值应介于1.7-1.9之间。脂质体转染基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。 2、含有内毒素的质粒对细胞有很大的毒性作用。 转染时，小心轻柔的将lipo2000加到培养基中并轻轻混匀，避免粗暴用力吹打，会导致脂质体失效。 血清一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后用PBS洗细胞然后在无血清培养基条件下转染，但有些对此敏感的细胞会受到损伤，甚至死亡(比如贴壁较差的细胞，在PBS洗涤时很容易冲刷细胞)导致转染效率极低。 不过转染产品配方几经革新后的今天，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率，但是血清的存在会影响DNA-转染复合物的形成，在DNA-转染复合物形成时需用无血清培养基opti-MEM来稀释DNA和转染试剂，在转染过程中是可以使用血清的。 转染后6小时更换培养基，因为lipo2000具有一定毒性。 细胞培养过程中往往会添加抗生素来预防污染，但是抗生素可能对转染造成困扰。比如青霉素和链霉素，青链霉素是我们常用来预防污染的抗生素，就会影响转染，虽然这些抗生素一般情况下对于真核细胞无毒，但当转染试剂增加了细胞的通透性时，就会使抗生素也进入细胞从而间接导致细胞死亡，造成转染效率低。 目前转染试剂有些已经可以全程都用有血清和抗生素的完全培养基来操作，非常方便，省去了污染等麻烦。 3、观察转染的效果 在转染后24小时，用荧光显微镜观察实验结果并记录荧光蛋白表达情况，如下图所示，说明转染成功，且转染效率还可以，如果不带有荧光，可以用GFP来对照，可以放在一个单独的孔中，或是与目标质粒共转染，同时用Q-PCR和者WB来检测。 转染后发现转染效率不高，可以通过两种方法： 1、复转染，即转染后12-24小时再次进行转染，前提是该细胞对脂质体的耐受性较好，转染后细胞死亡数较少。 2、通过药筛来杀死未转入成功的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。 你还没学会，没关系，学霸姐姐推荐——普诺赛（Procell） Procell生物可以为你的细胞培养提供全程的帮助，产品丰富多样就不说了，以上各个环节所需要的细胞系、完全培养基、无血清培养基、基础培养基、血清、转染试剂、胰酶等等产品都有！学霸姐姐自己所在的实验室验证过了，非常可靠优质！ 同时，这家还有很多生物实验技术方面的服务，强大的技术实力+丰富的经验，可以让你的细胞实验，全程无忧。 好了，学霸姐姐只能帮你到这里了，剩下的，只能靠你自己了！ 生物女学霸，一个自称学霸其实很渣的生物汪， 努力将有趣的、有用的、有血有肉的科研那些事儿呈现给大家， 关注一个好不啦~

两者在本质上并没有区别。无论是质粒转染，还是病毒转染，均是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。扩展资料：转染的原理：外源基因进入细胞主要包括电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。参考资料来源：百度百科-转染参考资料来源：百度百科-细胞转染

要看你是什么细胞，是想过表达还是knock down一个基因，稳转还是瞬转。细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。方法脂质体转染法阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。常用细胞类型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。电穿孔转染法电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔。当遇到某些脂质体转染效率很低或儿乎无法转入时建议用电穿孔法转染。一般情况下，高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。现在针对细胞死亡开发出了一种电转保护剂，可以大大的降低细胞的死亡率，同时提高电穿孔转染效率。病毒感染对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒感染，此法可以快速100%感染，检测成功率高。常用步骤1. 转染试剂的准备① 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。② 震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。2. 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体[1] 体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。3. 将混合液在室温放置10―15分钟。4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。

跟一般的片段插进质粒构建一样啊 只是过表达的话扩增出来的片段必须包含该基因完整的CDS序列 然后插入位点要在质粒的promoter后面 序列不能有突变 转染也和别的一样 用Lipo啥的

转速原理。根据jetprime转染原理的介绍显示，是转速原理。转染(transfection)是细胞在一定条件下主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。

最好告诉大家你现在用的方法，然后才有改进的余地

在生命科学领域，稳定细胞株的构建是非常重要的技术之一。稳定细胞株是一种被修改的细胞系，具有特定的基因表达模式和功能，因此具有许多应用前景，例如基因功能的研究和蛋白质生产等。本文将介绍细胞稳转株构建的方法和流程。构建稳定细胞株有两种主要方式，一种是使用病毒载体介导的基因递送，另一种是利用质粒转染。使用病毒介导的基因递送通常会导致细胞的死亡或转化，因此它不适用于需要形成稳定表达的蛋白质的应用。因此，本文将重点介绍利用质粒转染构建细胞稳转株的方法。1. 选择合适的细胞系在开始构建稳定细胞株之前，需要选择合适的细胞系。一般来说，常用的细胞系有293、HeLa和CHO等。在选择细胞系时，需要考虑到其易于培养和转染等因素。此外，还要和实验室的其他研究项目协调，以确保所选择的细胞系适合于研究计划。2. 选择合适的质粒载体质粒序列是构建细胞稳转株的基础。一般来说，在选择质粒载体时，需要考虑到以下几个因素：(1) 选择带有适当的选择标记基因的质粒，以便筛选得到稳定转染的细胞。(2) 选择带有高效表达启动子的质粒，以确保转录的效率。(3) 选择带有正确的多聚体信号（PolyA）序列的质粒，以确保转录末端处理正确。在选择质粒时，还需要注意其易于制备和纯化的程度，以确保所构建的稳定细胞株是高质量的。3. 质粒转染质粒转染是构建稳定细胞株的关键步骤，这也是该技术选择的优势之一。质粒转染可以通过多种途径实现，例如电穿孔法、钙磷转染法或利用交联剂等。对于小规模实验，利用商业化转染试剂进行转染也是一种方便、快捷的方法。4. 筛选和扩展细胞转染完成后，需要筛选转染后稳定表达所需基因的细胞。通常使用特定的筛选方法，例如使用特定的抗生素来筛选具有选择标记基因的细胞，以确保只有稳定转染的细胞才得以存活和扩展。5. 验证细胞稳定性和表达在细胞筛选和扩展完成后，需要验证构建的细胞稳定性和表达情况。这可以通过多种方法实现，例如荧光染色、Western blotting等。通过这些方法，可以确定哪些细胞具有稳定的基因表达，并选择这些稳定细胞株用于后续的研究应用。总之，细胞稳转株的构建是一项困难但非常重要的技术，在基因功能研究和蛋白质生产等领域具有广泛的应用前景。上述方法提供了构建稳定细胞株的主要步骤和流程，希望能够对相关研究者提供帮助。

简略回答 不懂追问：1. 基因沉默一般用siRNA或者质粒 ， siRNA是双链RNA，其中一条链与靶基因的mRNA序列互补。将此双链RNA转染至细胞 能够沉默靶基因的表达shRNA质粒 转染进细胞能够表达shRNA（发卡结构） 和双链RNA差不多 只不过是发卡结构。发卡的一条臂与靶基因mRNA互补。 shRNA质粒可以做稳定转染 达到持续干扰的效果 人工合成的siRNA不能稳定转染2. 转染。 就是通过转染试剂 将外源核酸（比如siRNA 质粒等）导入细胞的过程

转染试剂直接加到质粒中步骤如下：1、将需要转染的细胞培养在培养皿中，至于适宜的细胞密度和培养时间需要根据具体实验进行调整。2、准备含有转染试剂的培养基，按照转染试剂的使用说明或实验室的标准操作程序进行制备。3、将培养基中的转染试剂加入到需要转染的细胞培养物中，一般建议使用最终浓度在0.5-5μg/ml之间。4、轻轻摇晃培养皿，使细胞和转染试剂充分混合，然后将培养皿放回到37℃的细胞培养箱中进行培养，一般建议培养6-48小时。5、在转染后适当的时间收集细胞，进行下一步实验。

如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或 2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。 培养基中的血清 在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。其实，只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。 培养基中的抗生素 抗生素是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。这时候可以选择 英格恩生物的Entranster转染试剂 ， 非脂质体试剂，培养基可加抗生素，避免了细胞染菌 。 设置阳性对照和阴性对照。 一般在转染24-48h，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。 如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。 启动子的选择 启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。 质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。纯化质粒的质量也会影响转染效率，一定要选择高质量的质粒。 质粒DNA的浓度和量 既然质粒纯化已经不成问题，初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA，但是要注意的是，DNA量过少固然转染效率不高，DNA量过多同样会降低转染效率。所以预实验需要按照说明书的要求，按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂。有的转染试剂要求DNA的量多些，有的转染试剂效率高只要很少DNA。 转染试剂的选择 在确定了质粒的质量之后，就要考虑转染试剂的选择了。目前大多数用的是脂质体类的转染试剂，但这类试剂的毒性较大，转染效率低，最好 选择非脂质体的转染试剂 ，如Entranster试剂 。 优化条件：质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种情况下需要对质粒转染试剂的配比进行优化。另外， 可选用更合适的转染试剂，如Entranster试剂 。 抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。 细胞状态及融合度：长势旺盛的细胞转染效果更佳，细胞密度应该在转染时融合度至少70%以上。 DNA纯度及数量：确保质粒OD值A260/A280在1.8~2.0之间。DNA量不能太高，单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响。

质粒提取是指去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。 目录 一、质粒提取原理 质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。 从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。 质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间。 二、质粒提取方法 质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案。 (一) 碱裂解法： 此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1. 接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2. 37℃振荡培养过夜。 3. 取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4. 加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5. 加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6. 加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7. 以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管 8. 加入等体积的异戊醇，混匀后于0℃静置10min。 9. 再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10. 用70％乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11. 待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中 (二) 煮沸法： 1. 将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。 2. 弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3. 将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中，涡旋混匀。 4. 加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)， 涡旋振荡3秒钟。 5. 将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。 6. 用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。 7. 用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 8. 取20ml进行电泳检查。 (三) 酚氯仿裂解法： 1. 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中（含有卡那霉素30 μg/mL）摇菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 μL TE，充分混匀；加入400 μL酚氯仿（1∶1体积）混合液，剧烈振动10 s，混匀；12 000 g/min离心5 min，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层；上清经国产0。22 μm针式滤器过滤1次；向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s，12 000 g/min离心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴。 2. 按PstI内切酶说明书进行酶切反应（37℃，1 h）。 酶切产物10 μL，10 g/L琼脂糖凝胶电泳。 3. PCR引物根据参考文献〔1〕设计，预计扩增产物片断大小为714 bp。 4. 常规制备感受态菌E。coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素（30 μ/mL）LB培养平板中，37℃培养，15 h后观察筛选克隆情况。 三、质粒提取常见问题 (一) 溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：1. 螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;2. EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 (二) 溶液II－NaOH－SDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：1. 溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。2. 解聚细胞中的核蛋白。3. SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。 (三) 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液： NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。 (四) 为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。 (五) 在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。 (六) 加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？ 加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。 (七) 为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。 (八) 如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀DNA？ 采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最终PEG浓度为12％。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。 (九) 抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？ 酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。 作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。 (十) 为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？ 在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 (十一) 为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？ 因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。 保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。 (十二) 未提出质粒或质粒得率较低？ 1. 大肠杆菌老化 请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2. 质粒拷贝数低 由于低使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷 贝数载体。 3. 菌体中无质粒 有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。 例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4. 碱裂解不充分 使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、 P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能 有助于增加质粒提取量和质粒质量。 5. 溶液使用不当 溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的 溶液，才能使用。 6. 吸附柱过载 不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若 用富集培养基，例如TB 或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高 的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。 7. 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时） 洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 8. 乙醇残留 漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加 入洗脱缓冲液。 9. 洗脱液加入位置不正确 洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱 效率。 10. 洗脱液不合适 DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris?Cl, pH 8.5) 或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保 其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱 缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。 11. 洗脱体积太小 洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降 低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。 12. 洗脱时间过短 洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。 (十三) 质粒纯度不高？ 1. 混有蛋白 不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有 微小蛋白悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。 2. 混有RNA RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如 果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。 3. 混有基因组DNA 加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从 而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用 量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，不要超过16 小时。 4. P3溶液加入时间过长 P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。 5. 含大量核酸酶的宿主菌 宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完 整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。 6. 裂解时间过长 加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。 7. 质粒的二聚体和多聚体形式 质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。

perfect

转染(transfection)：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。转染目的：研究你的目的片段到细胞内的表达。转染一般是将目的基因构建到某个载体，将构建好的重组质粒导入细胞中，这样就能表达你所要的目的蛋白用于后续实验。

质粒DNA纯化的试验原理：溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多溴化乙锭，直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。尽管这些方法大多数均被束之高阁，但其中最好的方法，也应是聚乙二醇分级沉淀法。从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可利用分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。碱基性法抽提效果良好，既经济且得率较高。抽提到的质量DNA可用于酶切、连接和转化。对于分子量较大拷贝较少对的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用吕华铯密度超高离心法抽提DNA，且具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质量DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用少量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于基因操作。质粒DNA纯化的试验步骤：测量DNA溶液的体积，按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl, 将溶液加温至30℃助溶。温和地混匀溶液直到盐溶解。每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水）；立即将溴化乙锭溶液（漂浮在表层）与DNA－氯化铯溶液混匀， 溶液的终密度应为1.55g/ml（溶液的折射率为1.3860）溴化乙锭浓度大约740μg/ml。【溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子），于室温保存。室温下用Sorvall SS34头（或与其相当的转头）以8000rpm离心5min， 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到离心管中。用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。以20℃对所得的密度梯度以45 000rpm离心16h（VTi65 转头）、 以45 000rpm离心48h（Ti50转头）、以60 000rpm离心24h（Ti65转头）或者以60 000rpm离心24h（Ti70.1转头）。普通光照下，在梯中心可见两条DNA区带， 上部区带材料通常较少，由线状的细菌（染色体）DNA和带切口的环状质粒DNA组成：下部区带则由闭环质粒DNA组成。管底部深红色的沉淀是溴化乙锭RNA复合物，位于CsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。Beckman Quick-Seal离心管中的CsCl－溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒DNA而不至超负荷。如有更大量的质粒存在，将扩展为一条宽带，并与染色体DNA相重叠。这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现负荷，可收集整个DNA区高产水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现超负荷，可收集整个DNA区带，用CsCl溶液（ρ=1.58g/ml）将体积调到15ml，在两个离心管中再度离心，使DNA达到平衡。收集DNA带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入，为尽量减少污染的机会，首先用18号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带（杂色体DNA）：用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后将一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将18号皮下注身针头（其斜面向上）插入管中，以便使针头的斜面开口恰好位于染色体DNA区带之下并与该区带相平行。将粘稠状DNA收集到一次性使用的管内，用造型粘土块封住皮下注射针头的末端并将第2根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第3根皮下注射针头（18号），将下部的质粒DNA区带收集到玻璃或塑料管中。

质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。实验原理提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。[1] 另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。碱裂解法人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。煮沸法煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取少至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。质粒小提试剂盒用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部操作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。

看这个，我们都用这个方法

大提质粒和小提质粒的基本原理是一样的，都是通过一定的方法（如加碱裂解）使在细菌内大量扩增的质粒释放出来，然后经过去蛋白去RNA等一系列步骤纯化DNA，最终将DNA提取出来。区别：1.大提用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。2.一般试剂盒中大提比小提多了溶菌酶、异丙醇（回收沉淀核酸）、含一定量PEG的氯化物（回收质粒DNA）及乙酸铵等，其作用及目的都是有利于细菌的裂解和质粒的纯化，所以大提的产物比小提的量多很多，而且纯度很高。3.小提一般用于质粒鉴定和对纯度要求不是很高的实验，大提用于质粒的大量提取和转染等纯度要求很高的实验。

转入质粒的原理：质粒上连的片段转录后能够自身互补形成双链（shRNA），在细胞内被细胞自己剪切成siRNA。两种转染方法在功能上是一致的。但是siRNA转染以后发挥作用的时间较短，用于短期抑制试验（一般维持一周以内）。而因为质粒存在于细胞内比较稳定（载体上含有抗生素标记，可以筛选），能够持续表达产生shRNA，然后不断产生新的siRNA，因此维持作用的时间长（可以超过两周）。另外用质粒还可以同时转入报告基因作为对照，确定质粒确实已经转染进去了。

1定义编辑最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体。2特征编辑阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。已有众多的文献报道，脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC（蛋白激酶C）通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30)；如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777(4):362-8)；如与线粒体膜发生作用(J Biol Chem. 1989 Jan 25;264(3):1508-15)；转染siRNA造成脱靶效应等等。细胞毒性的大小往往意味着对细胞生理活动影响的大小，脂质体这些作用是造成细胞毒性的根本原因。这会对相关研究数据产生严重的干扰，甚至影响研究的结论。这已引起了许多研究者的注意。虽然人们早已发现脂质体对细胞的毒性，对研究的影响，但由于一直没有更好的方法尤其是更高效的转染方法代替脂质体，所以脂质体转染试剂一度应用非常广泛。同时，人们也一直在寻找更有效、毒性小同时对研究影响也小的转染试剂。由于脂质类转染试剂对细胞的毒性是由其脂质特性决定的，众多的研究者和生物公司将新一代转染试剂的开发聚焦在非脂质体的聚合物上，一种纳米材料的聚合物已经研发出来，其原理是：分子内含有许多氨基，在生理PH下会发生质子化，这些质子化的氨基可以中和DNA质粒表面的负电荷，使DNA分子由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子，并包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解。转染复合物主要是通过细胞内吞作用将DNA转移进入细胞，形成内含体(endosome)，DNA从内含体释放，进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。通过纳米技术生产出的转染试剂在纳米尺度表现出结合保护DNA能力强、毒性低的独特性能。

转入质粒的原理：质粒上连的片段转录后能够自身互补形成双链（shRNA），在细胞内被细胞自己剪切成siRNA。两种转染方法在功能上是一致的。但是siRNA转染以后发挥作用的时间较短，用于短期抑制试验（一般维持一周以内）。而因为质粒存在于细胞内比较稳定（载体上含有抗生素标记，可以筛选），能够持续表达产生shRNA，然后不断产生新的siRNA，因此维持作用的时间长（可以超过两周）。另外用质粒还可以同时转入报告基因作为对照，确定质粒确实已经转染进去了。

转染(transfection)：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程.常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类. 转染目的：研究你的目的片段到细胞内的表达. 转染一般是将目的基因构建到某个载体,将构建好的重组质粒导入细胞中,这样就能表达你所要的目的蛋白用于后续实验.

质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。 另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。碱裂解法人们使用碱与SDS裂解法从E. coli(大肠杆菌)中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。煮沸法煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取少至lmL(小量制备)，多至250mL(大量制备)菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株(其中包括TGl)能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。质粒小提试剂盒用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部操作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA(OD260/OD280=1.7-1.9)，此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。 生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。 每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。

既然你说是菜鸟级的问题你就自己解决啊，这个都不会，你还真是菜鸟

你的问题我都没有搞清楚，你是要从质粒上扩一小段序列出来，还是通过PCR扩增出完整的质粒并在其中引入点突变？

基本的基因工程技术步骤简单来说五个字：切、接、转、增、检。“切”就是将加入酶切位点的外源基因和拥有相同酶切位点的载体进行限制性内切酶酶切反应，克隆质粒可以单酶切也可以双酶切，要是做表达质粒就需要双酶切以确定正确的基因表达方向；“接”就是将前面用内切酶处理后有着相同粘性末端的外源基因和质粒载体通过连接酶连接起来，形成重组质粒；“转”就是将重组好的质粒载体转染宿主细胞，有热激还有电转等方法；“增”就是转入了重组质粒载体的宿主细胞增殖培养，通过抗性基因或其他筛选方式筛选含有目的质粒载体的阳性单克隆细胞增殖培养；“检”就是检验了，做克隆就是提取质粒之后PCR方法检验目的重组质粒和携带基因正确性，做表达就是通过表达蛋白相应检测方法检测外源基因表达情况，一般情况做克隆也是用于后面做表达，也就是一般步骤就是走一遍这五个字的克隆，再走一遍这五个字的表达。可能不是非常准确差不多这意思吧，再往细里说东西有点多了，得细问了。

1.菌体收集不应过量，过量会导致裂解不完全，菌体太少时，提取质粒浓度可能不高。2.加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管，过于剧烈会导致基因组断裂。3.加入溶液3立即上下颠倒几次混匀，时间不宜过长。4.溶解时溶解液体积不要太少，太少洗脱效率低，产量低。

传统方法与试剂盒提取质粒的主要不同在于样品破碎、裂解和纯化的步骤。传统方法通常需要通过机械破碎、超声波处理或化学方法（如碱裂解）等手段来打开细胞并释放DNA，然后通过离心、柱层析等手段进行纯化。而试剂盒则通常采用了改进的化学方法，将上述步骤集成在一起，简化了过程，同时也提高了提取DNA的纯度和产率。试剂盒提取质粒的基本步骤包括：细胞破碎/溶解，去除杂质，结合DNA到载体，洗涤，再溶解，最终获得高纯度的质粒DNA。其中，试剂盒改进的步骤主要包括以下几个方面：细胞破碎/溶解：试剂盒中通常包含有专门的细胞破碎/溶解缓冲液，可以快速有效地破坏细胞膜和细胞壁，释放出DNA。去除杂质：试剂盒中会添加一些化学试剂，例如盐和碱性成分等，用于去除细胞杂质和蛋白质等。去除杂质的过程可以通过离心或柱层析来实现。结合DNA到载体：试剂盒中多数采用硅胶或玻璃纤维膜等固定相材料，通过将DNA在其表面吸附并结合，来提高提取的纯度和产量。洗涤：经过固定相的DNA需要洗涤以去除非特异性结合的物质，例如残留的碱基、盐、蛋白质、RNA等。洗涤步骤可以使用高盐缓冲液和无水乙醇等试剂进行多次反复洗涤。再溶解：最后，DNA/载体复合物会被释放到恰当的缓冲液中，使其中的DNA易于储存和使用。试剂盒提取质粒的原理是利用化学方法将质粒DNA从细菌细胞中裂解和收集到纯化介质中，同时去除其它核酸或杂质。其中，细胞裂解试剂包含了一些快速有效的细胞破碎/溶解缓冲液，可以迅速地打开细胞并释放DNA。而纯化过程中，固定相材料可以选择性地吸附DNA，并去除非特异性的杂质。经过多次洗涤和溶解后，最终获得高质量、高产量和高纯度的质粒DNA。

转染的意思解析如下：转染是细胞在一定条件下主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程，从本质上讲和转化没有根本的区别。转染可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染。1、瞬时转染是指外源DNA或者RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。2、稳定转染是指外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在，尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高，外源DNA整合到染色体中概率很小，通常需要通过一些选择性标记反复筛选得到稳定转染的同源细胞系。3、无论是转染还是转化，其关键因素都是用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA分子能够容易进入细胞内部。细胞转染实验原理：外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

细菌没染色体

质粒提取主要包括三个步骤：1、菌体扩繁。2、菌体裂解释放质粒DNA。3、质粒DNA的分离与纯化。质粒提取办法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特色。其原理是：强碱（pH12.0-12.6）环境下，SDS损坏细胞壁并裂解细胞，一同使宿主细胞的蛋白质、染色体及DNA发生变性，而质粒DNA因为其分子量小而缠结严密不易变性。pH调至中性时可恢复天然构象，在高盐条件下，细胞碎片、变性的蛋白质和染色体DNA发生沉积，离心后可去除。上清中的质粒DNA可经过乙醇沉积或许硅胶膜特异性吸附等方法，将质粒DNA从上清中回收。

转化(transformation)、转导(transduction)、转染(transfection)和感染(infection)是分子生物学实验中将外源基因导入受体细胞的4种技术，它们词形相近，概念上容易混淆。具体区别：意思不同，用法不同、侧重点不同。1、意思不同（1）转化：含外源基因的重组质粒（载体）将外源基因直接导入原核细胞（如细菌）。（2）感染：在基因转移实验中强调重组病毒载体入侵受体细胞的过程。（3）转导：通过重组病毒载体将外源基因导入真核细胞或原核细胞。（4）转染：指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞。2、用法不同（1）转化：当载体是重组质粒时，如受体细胞是原核细胞应使用“转化”。（2）感染：受体细胞是真核细胞则使用“转染”。（3）转导：当载体是重组病毒时，如强调转移物进入受体细胞应使用“转导”。（4）转染：强调重组病毒载体进入受体细胞的过程则使用“感染”。3、侧重点不同（1）转化：转化进入受体细胞的则是染色体DNA的片断或质粒DNA。（2）感染：转染过程中进入细胞的是完整的病毒DNA。（3）转导：一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。（4）转染：用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA分子能够容易进入细胞内部。

转化(transformation)、转导(transduction)、转染(transfection)和感染(infection)是分子生物学实 验中将外源基因导入受体细胞的4 种技术，它们词形相近，概念上容易混淆。“转化”是指含外源基因的重组质粒（载体）将外源基因直接导入原核细胞（如细菌）；“转导”指通过重组病毒载体将外源基因导入真核细胞或原核细胞；“转染”指重组质粒载体或游离核苷酸在脂质体等介导下进入真核细胞；“感染”在基因转移实验中强调重组病毒载体入侵受体细胞的过程。在使用这4 个名词时， 应仔细分析基因转移实验的四要素——转移物、载体、介导方法、受体细胞类型，而正确区 分载体和受体细胞类型是辨析的关键点。当载体是重组质粒时，如受体细胞是原核细胞应使 用“转化”，如受体细胞是真核细胞则使用“转染”；当载体是重组病毒时，如强调转移物进 入受体细胞应使用“转导”，如强调重组病毒载体进入受体细胞的过程则使用“感染”。

转染就是把你要放到细胞里面的东西搁进去呗。。。。。。成功的证明可以将要转染的东西进行荧光基团的修饰 载体的话加上报告基因等方法来确定 意义不是显而易见么。。。

蛋白表达实验是一种常用于生物学研究的实验方法，它用于在细胞中表达、生产和纯化蛋白质。以下是蛋白表达实验的一般流程：1. 购买或构建表达载体：选择适当的表达载体，它通常是一个质粒或病毒载体，用于将目标基因（编码目标蛋白质的DNA序列）插入到细胞中。2. 转染或转化细胞：将构建好的表达载体转移到目标宿主细胞中。这可以通过转染（对于质粒载体，利用化学方法导入细胞）或转化（对于病毒载体，利用病毒感染细胞）完成。3. 诱导表达：在转染或转化后，需要诱导细胞表达目标蛋白。这通常是通过添加适当的诱导剂（如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）来实现，以启动目标基因的转录和翻译过程。4. 收集细胞：在表达一定时间后，收集表达目标蛋白的细胞。收集时可以用PBS洗涤细胞以去除培养基。5. 蛋白提取：对收集的细胞进行蛋白质提取，通常使用细胞裂解液来破裂细胞膜，并释放蛋白质。6. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白质纯化步骤，将目标蛋白从细胞裂解物中分离出来。这些步骤可以包括离心、柱层析、凝胶电泳等方法。7. 蛋白质检测：对纯化的蛋白样品进行蛋白质检测，常用方法包括SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot等。8. 结果分析：对蛋白表达实验的结果进行分析和解释，确定是否成功表达目标蛋白。蛋白表达实验是一项复杂的工作，需要仔细设计实验步骤、选择适当的细胞系和表达系统，并进行细致的实验操作和分析。实验中的每个步骤都需要精确控制，以确保获得可靠的结果。

你是潍坊医学院的？

在专门的细胞房和无菌的超净台里操作啊，质粒一般在-20度里面冻过一次的话就可以无菌了，其他用到的试剂和器材都要做到无菌。

具体问题是？

他们拿到穿刺的培养之后，先要进行培养，然后提质粒什么的，跟咱们在实验室里一样的。提了质粒之后，就和质粒测序没什么区别了。目前绝大多数测序公司用的都是Sanger双脱氧链终止法。

这个过程是转化，如果是进入细胞叫转染

1、质粒大小和转染量：在一般情况下，随插入片段长度的增加转染效率降低；而转染效率在一定的范围内与质粒转染量呈正相关。2、DNA质量：高质量的DNA对于转染的效率至关重要。如果质粒不纯会显著影响转染复合物的形成，进而影响转染效率。因此，可以选择提取纯度较高的试剂盒对DNA进行提取和纯化，以得到更高质量的DNA，从而提高转染效率。3、转染试剂的选择：转染试剂将外源核酸片段导入细胞，影响内源基因表达水平。在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂，例如在绵羊成纤维细胞转染过程中FuGene HD的转染效率更高，GenEscortTM I对小鼠胶质细胞则具有更好的转染效果。总之，可以遵循高效、低毒等原则进行选择。4、质粒与转染试剂比例：在一定范围内，转染效率与质粒/转染试剂比值成正相关，但毒性也会增加。可以根据转染试剂推荐比例确定合适的合适的转染比例。5、细胞状态：维持细胞生长及健康旺盛是提高转染效率的重要条件。建议选择对数生长期的细胞为佳，此时期的细胞生长旺盛，可能得到更高的转染效率，切勿选择传代次数过多，基因型可能发生改变的细胞。6、细胞密度：细胞密度过高或过低都会影响转染效果，过高则难以转染，过低则容易导致细胞死亡，因此需要选择合适的细胞融合密度进行转染，一般来说细胞密度在60%-80%时转染较为理想，但具体密度可参考转染试剂的说明书进行操作。7、血清：血清中含有大量的蛋白质，可能会降低转染效率。一般的转染试剂会要求转染时使用无血清培养基进行转染，转染完成后更换完全培养基。但现在有些新的转染试剂血清的存在已不造成威胁，甚至还有助于提高转染效率，如阳离子聚合物等。8、抗生素：抗生素，如青霉素和链霉素，一般是作为培养基中的添加物来防止细胞污染。这些抗生素对于真核细胞没有毒性，但是转染时有些转染试剂增加了细胞的通透性使抗生素进入细胞，可能会间接导致细胞死亡，从而降低转染效率。可以根据转染试剂的要求来选择是否在培养基中添加抗生素。质粒DNA细胞转染注意事项线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。纯化质粒的质量也会影响转染效率，一定要选择高质量的质粒。

大体分为一下几步： 1.设计目的片段引物（含限制性酶切位点，要求：表达载体上有而目的片段上没有的酶切位点） 2.PCR扩增片段 3.扩增后的片段与pMD18/19T克隆载体连接，通过蓝白斑筛选，提质粒并酶切鉴定；将正确连接的克隆载体重组质粒酶切，回收目的片段 4.目的片段与表达载体连接 5.转化到DH5a等克隆菌株，通过抗生素筛选，鉴定表达重组质粒。 6.测序检测 7.正确的表达重组质粒再转到表达菌株 8.表达

你的细胞应该是贴壁的吧。先把细胞消化下来，铺细胞，贴壁后，长到百分之七八十的样子，然后转染。你的转染试剂应该是lipofectimin2000吧。详细的转染步骤你看一下说明吧，或是百度。

内毒素对转染确实有影响，但不除的话也能做出来，就是效果不是那么好罢了。至于说SF-900Ⅱ培养基，其实对于转染影响不大，主要是你的细胞的状态及传代数。但是转染后最好使用加血清的培养基。因为如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免了这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1%），让血清给蛋白酶提供作用底物。

吵常常

实验一ApaLI (178)P(BLA) ALPHA质粒DNA的提取、 质粒DNA的提取、酶切 DNA的提取 及琼脂糖凝胶电泳ApaLI (2367)EcoRI (397) AvaI (413)XmaI (413) SmaI (415)APrpUC19BamHI (418) PstI (440)HindIII (448)P(LAC) ORI2686 bpApaLI (1121)一 实验目的掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。 的基本原理和操作要点。 掌握碱裂解法分离质粒 的基本原理和操作要点 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 的试验方法 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 的方法和技术 学习琼脂糖凝胶电泳检测二 实验原理质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子， 质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色体外小型（ 200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分 DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分 分子 DNAcccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 ），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。培养细菌使质粒扩增 三个基本步骤 收集和裂解细菌 分离和纯化质粒DNA 分离和纯化质粒DNA

现在的质粒抽提一般是利用碱裂解法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异达到分离目的。高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状不溶物质，从而可以通过离心除去。

1、质粒大小和转染量：在一般情况下，随插入片段长度的增加转染效率降低；而转染效率在一定的范围内与质粒转染量呈正相关。2、DNA质量：高质量的DNA对于转染的效率至关重要。如果质粒不纯会显著影响转染复合物的形成，进而影响转染效率。因此，可以选择提取纯度较高的试剂盒对DNA进行提取和纯化，以得到更高质量的DNA，从而提高转染效率。3、转染试剂的选择：转染试剂将外源核酸片段导入细胞，影响内源基因表达水平。在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂，例如在绵羊成纤维细胞转染过程中FuGene HD的转染效率更高，GenEscortTM I对小鼠胶质细胞则具有更好的转染效果。总之，可以遵循高效、低毒等原则进行选择。4、质粒与转染试剂比例：在一定范围内，转染效率与质粒/转染试剂比值成正相关，但毒性也会增加。可以根据转染试剂推荐比例确定合适的合适的转染比例。5、细胞状态：维持细胞生长及健康旺盛是提高转染效率的重要条件。建议选择对数生长期的细胞为佳，此时期的细胞生长旺盛，可能得到更高的转染效率，切勿选择传代次数过多，基因型可能发生改变的细胞。6、细胞密度：细胞密度过高或过低都会影响转染效果，过高则难以转染，过低则容易导致细胞死亡，因此需要选择合适的细胞融合密度进行转染，一般来说细胞密度在60%-80%时转染较为理想，但具体密度可参考转染试剂的说明书进行操作。7、血清：血清中含有大量的蛋白质，可能会降低转染效率。一般的转染试剂会要求转染时使用无血清培养基进行转染，转染完成后更换完全培养基。但现在有些新的转染试剂血清的存在已不造成威胁，甚至还有助于提高转染效率，如阳离子聚合物等。8、抗生素：抗生素，如青霉素和链霉素，一般是作为培养基中的添加物来防止细胞污染。这些抗生素对于真核细胞没有毒性，但是转染时有些转染试剂增加了细胞的通透性使抗生素进入细胞，可能会间接导致细胞死亡，从而降低转染效率。可以根据转染试剂的要求来选择是否在培养基中添加抗生素。质粒DNA细胞转染注意事项线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。纯化质粒的质量也会影响转染效率，一定要选择高质量的质粒。

为什么质粒转染要换液为了保证细胞正常生长所需的营养,需要在4～6小时后换...

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