C3植物C4植物CAM植物在碳代谢上各有何异同点

在高等植物中，光合碳同化主要有3种类型：C3途径，C4途径和景天酸代谢途径(CAM)。C3植物中，CO2的固定主要取决于1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的活化状态，因为该酶是光合碳循环的入口钥匙。它催化1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)羧化，将大气中的CO2同化，产生两分子磷酸甘油酸，可见RuBPCase在C3植物中同化CO2的重要性。C4植物是从C3植物进化而来的一种高光效种类。与C3植物相比，它具有在高光强，高温及低CO2浓度下，保持高光效的能力。C4植物固定CO2的酶为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)，与C3作物中RuBPCase相比，PEPCase对CO2的亲和力高。C4植物的细胞分化为叶肉细胞和鞘细胞，而光合酶在两类细胞中的分布不同，如PEPCase在叶肉细胞固定CO2，生成草酰乙酸(OAA)，OAA进一步转化为苹果酸(Mal)，Mal进入鞘细胞，脱羧，被位于鞘细胞内的RuBPCase羧化，重新进入卡尔文循环。这种CO2的浓缩机理导致了鞘细胞内的高浓度的CO2，一方面提高RuBPCase的羧化能力，另一方面又大大抑制了RuBPCase的加氧活性，降低了光呼吸，从而使C4植物保持高的光合效率。正是因为C4途径具有高光合能力，自60年代以来，试图利用C4光合特性来改进C3植物的光合效率，一直是一个引人注目的研究问题。多年来，人们希望通过C3植物与C4植物杂交，将C4植物同化CO2的高效特性转移到C3植物中去，但至今尚未取得令人满意的结果，其杂种F1和F2代的光合效率均比任何一个亲本都低，基于上述情况，试图通过杂交将具有C3途径的许多作物(如水稻、小麦，大豆)改造为具有C4途径植株的可能性极微。但却可能从C3植物中筛选出有PEPCase及C4途径表达较高的变异株，并加以遗传改进，从而提高C3植物的光合效率。所以几十年来，人们设想在那些利用杂种优势不明显的品种内，如C3作物大豆、小麦中筛选高光效品种。Winter(1974)指出C3植物(如小麦、大麦)不同的绿色器官中，PEPCase，RUBPase的活性存在显著差异。这不仅表现在碳同化速率上，同时也表现在碳素同化的途径上。随着人们发现C3植物中存在C4途径，根据这一特点，寻找C4途径表达强的C3植物逐渐成为光合研究的一个侧重点。为此，大量的工作已经被开展并已取得许多令人欣喜的成果。不仅证明了在C3植物中C4途径的存在，而且发现同种植物中不同品系间C4途径的强弱有较大差异。但是有关C4途径在C3植物中的表达方式及途径的研究开展还很少，人们仅发现C3植物中C4途径的客观存在，至于C4途径在C3植物中的作用机理及在植物光合作用中所占的比例，均有争议，但无论如何，有关C3植物中C4途径存在的发现及由此进行的筛选高光效品系工作，为基因工程改造培育新品种和高产农作物提供了理论依据。

1 C3植物中C4途径的发现及研究现状

C3植物中C4途径的发现是伴随着C4途径的发现而发现的。1953年Calvin确定了植物体内C3途径的存在，1965年Kortschack等在夏威夷甘蔗试验中观察到CO2固定的初期产物是四碳酸，1966年，澳大利亚的Hatch在甘蔗研究上获得了证实，并提出了C4途径。从此植物界光合碳同化方式有了C3途径和C4途径的区分。但是随着研究的日益深入，科学家们发现C3植物和C4植物的区分并非绝对的。Duffus等(1973)报道在C3植物大麦颖片中，具有高于叶片中的PEPCase含量，而PEPCase是C4途径中关键性酶，因此提出了C3植物中可能有C4途径的存在。Nutbeam等(1976)发现，非成熟的C3作物大麦种子固定CO21 min后，84%的14C分布在苹果酸中，其余的在戊糖磷酸和蔗糖中。固定后2 min，主要标记产物是蔗糖，6分钟后，蔗糖中的14C占整个固定14CO2的94%。从而进一步证实了C3植物中C4途径的存在。在粟米草属(Mollugo nudicaulis)中同一植物内可同时存在光合作用的C3和C4途径，嫩叶属C3途径，老叶属C4途径，中部叶属于中间类型。在其它C3植物中，亦发现有C4途径的存在，如宽叶香蒲(Typha latifolia)和芫荽(Coriandrum sativum)(刘振业等，1983)。Cheng等(1988)，Moore等(1989)和Ku等(1991)曾报道，在黄花菊属(Flaveria)中有类似C4途径的种类，它们表现出C4植物的特征；另外Bowes等(1989)指出在水韭属(Isoeres)种类中也具有同样的现象。Reiskind等(1997)发现一种两栖植物黑藻(Hydrilla verticillata)，在冬季C3代谢很旺盛，而在夏季水生条件下，尽管不具有“Kranz”结构，但仍有活跃的C4代谢。看来，高等植物CO2的两种类型代谢途径，C3和C4途径不是截然分开的，而是相互联系的，在一定条件下可以相互转化的。

Hatch等(1990)经过数年的观察，他们认为判定植物体内是否具有C4途径，必须符合以下两个条件：①酶学研究，即C4途径有关的酶PEPCase，NAD(P)-苹果酸酶，NAD(P)-苹果酸脱氢酶，丙酮酸磷酸双激酶及碳酸酐酶等，与C3植物体内相应的同功酶比较，活性较高。②14CO2示踪试验证明：CO2的最初产物为C4酸即苹果酸(Mal)和天冬氨酸(Asp)，而且这些有机酸脱羧后，CO2转移到有机物如糖类、淀粉中去。

1.1 酶学研究

近几十年来，人们围绕着C3植物中C4酶的存在做了大量工作，并取得了许多成果。PEPCase是C4途径的最初固定CO2的酶，大量研究表明，PEPCase不仅存在于C4植物中，而且也广泛存在于C3植物中。Ting等(1973)认为C3植物PEPCase对底物PEP，HCO3的亲和力也比C4植物中同功酶的亲和力约高6倍。因此PEPCase在C3植物中碳代谢作用是不可忽视的，尤其当植物体内外条件发生变化时，其活性发生显著变化。如烟草感染花叶病毒时，RUBPase被抑制，其功能可部分地被PEPCase代偿；小麦和大豆在干旱条件下，PEPCase活性可被显著提高。近来，Jenkins(1989)用PEPCase专一性抑制剂3，3-2氯-2-(二羟膦甲基)-丙烯酯(DCDP)证明，C3植物中C4光合酶PEPCase对CO2的同化有一定的贡献。郝乃斌等(1991b)的研究表明，大豆不同器官中的PEPCase/RuBPCase的比值差异显著，其中叶片中的比值最低，为0.27，而种皮中的比值最高为8.66，子叶中为6.49，这说明大豆种皮和子叶中PEPCase活性要比该器官中的RuBPCase活性高出几倍。而且还证明，PEPCase不仅大量固定呼吸作用所释放的CO2，同时还可以通过C4途径固定CO2。C4途径的存在标志着细胞有可能通过“CO2泵”的方式提高光合碳循环的CO2浓度，使RuBPCase的催化方向朝着有利于形成碳水化合物的方向运转。Kelly(1977)等认为与C4植物中的PEPCase相比，C3植物体内的活性较低，但与碳同化中的一些限速酶的活性相比，C3植物中的PEPCase的活性仍然是可观的。

碳酸酐酶(CA)在C4光合中是种很关键的酶，它催化CO2到HCO3的快速转化，而HCO3是PEPCase的底物。Hatch等(1990)利用生化和分子生物学技术研究发现，CA有两种，即细胞质CA和叶绿体CA，C4植物体内的CA主要是细胞质CA，而C3植物的CA主要是叶绿体CA，这2种CA动力学性质及对CO2的亲和力和对抑制剂的敏感性相似。Popova等(1990)发现CA位于C3植物的叶绿体中，它的浓度变化因植物种类而异，一般在86%～96%的范围，在C3植物中，CA同样有效地将CO2转化为HCO-3，为PEPCase提供底物，从而为C3植物中的C4途径顺利进行打下基础。

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4途径的专一性酶，Duffus等(1973)在大麦颖果的青色种皮中，Kisaki等(1973)在烟草的幼苗及Meyer(1982)在未熟的小麦颖果中相继发现PPDK的存在。Aoyagi等(1986)年也证实在C3植物中，存在着与C4植物同样的丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)。Hata等(1987)及Aoyagi等(1984)证明，PPDK不但位于叶绿体中，而且还存在于小麦种子的细胞质中；Imaizumi(1991)通过Northern blot分析发现，在水稻种子的细胞质中有PPDK存在。Rosche等(1994)认为PPDK是C4光合作用的关键酶，它催化固定CO2的最初受体PEP的再生。PPDK大部分位于叶肉细胞，它的活性已在C3植物的光合组织中被测定。Imaizumi等(1997b)发现水稻开花6天后，外稃中的苹果酸中14C分布比开花初期高，而外稃中的PPDK在开花6 d的含量也相应地高于开花初期，这些结果显示，PPDK的功能与外稃中的C4代谢有关。已报道C3植物中的PPDK与C4植物中的PPDK具有相同的酶学特征，如被光激活(Aoyogi等，1984)，对冷胁迫的敏感(Aoyogi等，1984)，催化性质(Meyer等，1982)等。Hata等(1987)发现C3植物水稻幼苗体内的PPDK与C4植物玉米的PPDK无论在蛋白分子量，抗原决定簇和蛋白质结构等方面都相同。

Edwards等(1983)认为NAD(P)-苹果酸酶是催化L-苹果酸脱羧的酶，在C3，C4及CAM植物中广泛存在。Scheibe(1990)发现NADP-苹果酸脱氢酶是催化草酰乙酸转化为Mal的酶，在自然界中广泛存在，因此认为C3植物的NADP-MDH在碳代谢中与C4型植物的NADP-MDH同样重要。

在大豆的豆荚，西红柿的果皮，小麦及水稻的颖果中存在着一种C3-C4中间型或类似C4的光合途径(Edwards等，1983)。有关C4途径的光合酶，如PEPCase，PPDK，NAD(P)-ME及NAD(P)-MDH在这些器官中具有较高的活力。在大麦和小麦的穗中，在大豆的豆荚中有较高的PEPCase和RuBPCase活性，在西红柿的果皮中也具有相同的现象。Imaizumi等(1991，1997a)指出在水稻的园锥花序的外稃和内稃中，有关C4途径的酶(PEPCase，PPDK，NAD(P)-ME及NAD(P)-MDH)的活性分别是在RuBPCase活性的67%～171%之间浮动。因为植物体内的物质代谢是多重的，例如Latzko等(1983)认为C3植物体内的PEPCase的作用不仅行使C4途径，固定外界CO2，生成苹果酸，而且生成的Mal还可以用来维持细胞的pH，也还可以作为三羧酸循环(TCA)的中间产物来参与呼吸代谢。

1.2 CO2同化后的最初产物及转换

Hatch等(1961)提出，在C4途径中固定外界CO2的最初产物为苹果酸(Mal)和天冬氨酸(Asp)，为此许多人用14CO2示踪技术，来证明C3植物中不仅存在高活性的C4途径光合酶，同时从CO2同化产物方面来证实C4途径的存在。

Nutbeam等(1976)证明，在C3作物大麦中不仅具有高活性的PEPCase，而且利用14CO2示踪还证明14C的最初固定产物为四碳酸—Mal，而不是3-磷酸甘油酸(3-PGA)。在小麦穗中，用同位素示踪技术也同样发现，CO2的最初产物为Mal和Asp。

Imaizumi等(1997b)发现水稻圆锥花序显示出高的CO2同化速率(在叶绿素含量的基础上)，有利于产量的提高。在水稻圆锥花序中，不仅存在较高的C4途径酶活力，同时采用14C脉冲12C追踪实验，发现外稃中有大约35%和25%的14C分别固定在3-PGA和Mal中。在C4酸中大约有一半的14C转移到卡尔文循环的中间产物中去。这个结果表明，在水稻外稃中，光合途径主要表现为C3途径，然而它们可能有某种程度地利用PEPCase固定CO2。

Imaizumi等(1997b)利用LED技术研究CO2同化产物在水稻圆锥花序的外稃中的代谢，其结果也证明在水稻中存在C4途径。所谓LED技术，就是在外界空气条件下，植物组织接受光照20分钟后，将其移入一个密闭系统，然后关掉光源，注射进14CO2，使14CO2的浓度达到0.03%。在暗中固定14CO2 120 s后恢复光照，同时用含12CO2的空气代替14CO2。在不同的时间间隔，杀死叶片组织，然后测组织中的14C含量。Samejima等(1978)曾报道说，利用LED技术，在玉米叶片中，大量的14C被固定在Mal和Asp中，并且在LED技术的暗处理过程中，14C水平保持恒定。C4植物玉米叶片的特征之一是C4酸的C-4位置的14C的转移是严格光依赖的。在水稻的外稃中，暗中固定的大部分的14C积累在Mal和Asp中，并且没有转移到其它产物中去，这一点与玉米的14CO2固定结果相同。Samejima等(1978)报道，利用真空渗入法把NaH14CO3溶液直接饲喂给玉米叶片的鞘细胞，14CO2的光合起始产物为3-PGA；然而通过LED技术，14CO2的最初产物为Mal和Asp。他们认为，用真空渗入法技术得到的结果是由少量的RuBPCase造成的，而非玉米叶片的PEPCase作用结果。如果存在预光照期或通过预光照中止法，RuBPCase活力迅速减少。因此，在水稻的外稃中，尽管主要以C3途径固定CO2，但由于存在比RuBPCase活力更高的PEPCase以及其它C4途径光合酶，同时利用LED技术已经证明，在水稻的外稃中可产生大量的14C标记的C4酶，而且Mal中的14C主要转移到3-PGA和蔗糖中，因此可说明在水稻外稃中确实存在着C4途径。

下一个问题是C3植物中被固定到四碳酸的CO2是否像C4植物那样直接由PEPCase催化固定而来的；或像来自RuBPCase所催化固定的，即空气中的CO2先被C3植物中的RuBPCase固定在产物如蔗糖中，然后通过呼吸作用分解产生的CO2被PEPCase重新固定。Hatch(1976)证明，在C4植物中，95%的Mal中的14C位于C-4位置上。然而在C3植物中，Mal的14C只有60%位于C-4位置，33%位于C-1位置。Imaizumi(1997b)采用14CO2示踪和LED技术证明水稻外稃中，分别有90%和71%的14C出现在Mal中。在14CO2示踪试验中，光照10分钟后，水稻外稃中，90%的14C被标记在Mal的C-4位置；然而在水稻的旗叶中，Mal中的14C只有72%在C-4位置上。这些结果表明，水稻外稃中的14CO2是通过PEPCase被直接固定下来的。Samejima等(1978)用示踪试验证明，C4植物叶片中几乎所有的C4酸中的14C都转移到其它产物，而水稻外稃中四碳酸的14C，大约50%进入到3-PGA，然后转移到磷酸糖中，大约另一半的14C在其它的生化途径中缓慢代谢，如参与氨基酸合成或糖异生途径等。实验结果还表明水稻外稃的C4酸代谢像C4植物那样是光依赖性的。

Usuda等(1973)认为14C从Mal到3-PGA的转化，至少有2种可能途径：1)Mal脱羧，形成的14CO2被RuBPCase重新固定，产生3-PGA；2)Mal脱羧产生丙酮酸，丙酮酸经磷酸化再产生3-PGA。若Mal中的14C完完全全位于C-4位置，则第二种可能性可忽略不计。Imaizumi等(1997b)的试验结果显示，在光合作用固定14CO2 10 s和LED的110 s后，Mal中的14C分别有90%和83%位于C-4位置。这种比例还不足以排除第二种可能，但却有力地支持了第一种可能性的存在。

Nutbeam等(1976)也发现，通过14CO2饲喂发育中的大麦颖果，在颖片中有一些C4途径的特征。水稻开花后30 d，从圆锥花序中分离颖片(开花后60 d，谷粒成熟)，在饲喂14CO2 1 min后，标记的产物是Mal，长时间喂饲14CO2，14C标记出现在蔗糖中，进一步研究证实Mal中的C-4位置的14C转移到3-PGA的C-1位置，证明了C4途径的存在。

综上所述，无论从酶学，还是从四碳酸代谢均可充分地证明在C3植物中确实存在着C4途径。

2 C4途径在C3植物中作用机理的探讨

2.1 C4途径的酶分子生物学的研究进展

随着C3植物中C4途径存在的证实及分子生物学手段的运用，人们更深刻地了解C4途径酶类的分子机理及它们在C3植物体内的表达。Agarie等(1997)认为，近年来研究最为成功的例子是PPDK在一种两栖类植物荸荠(Eleocharis)体内表达的研究。荸荠在陆生条件下，进行C4型光合作用，而在水生条件下，进行C3方式CO2同化。通过对陆生和水生条件下，丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)的同源基因ppdk1和ppdk2的研究证明，尽管同源基因同源性极高，但却不完全相似。PPDK1蛋白是cDNA的核序列编码的，包含一个特殊的N端区域，可能作为叶绿体的转移肽，然而PPDK2缺乏这个特殊区域。因此ppdk1和ppdk2分别编码一个叶绿体PPDK1和一个细胞质PPDK2。基因组的Southern印迹分析显示，在荸荠的基因组中存在小的ppdk基因家族。Northern印迹分析显示无论叶绿体PPDK1或是细胞质PPDK2同时在同一光合器官—空心秆中表达。但不同的生态环境下，这些基因的表达不同。荸荠缺乏叶片，原来的空心秆表现出所有的光合功能。这种植物依赖环境条件发育成不同的光合器官(即C3类型空心秆和C4类型空心秆)，当水生空心秆露出空气中，空心秆就迅速死掉，而长出新的空心秆就具有Kranz结构和C4光合特征。相反地，如果具有C4途径的陆生空心秆被淹没在水中，植物就会发育成过渡态新空心秆，几个月后，就有C3方式光合，即从C4方式逐渐向C3方式转化。在C4植物中，PPDK位于叶肉细胞的叶绿体，在那里催化丙酮酸向PEP的转化。PPDK基因的细胞专一性表达是在转录水平上调控。PPDK是核DNA编码，基因从两个不同的起始点转录。在两个不同的起动子的控制下，大的转录产物是叶绿体PPDK，包括转运肽；小的产物是细胞质PPDK。两栖类型的荸荠，其光合特征的独一无二的进化方式为阐明C4途径的基因表达机理提供了有用的系统。由于有关同一基因组的多种基因的不同表达依赖于生长环境，正如两栖类荸荠的基因表达，也为分子水平上研究C4途径的代谢提供了很好的模式。

另外，人们对PEPCase基因也作了许多研究，对C3，C4，C3-C4的PEPCase基因进行克隆，基因结构分析和调控表达进行广泛的研究。Hermans(1990)在黄花菊属(Flaveria)中发现有C3，类似C3，类似C4，C3-C4，C4等不同代谢类型，分析它们的PEPCase基因，发现同源性极高，由共同的原始祖先进化而来的，由于表达不同，所以活性高低不同，C4植物PEPCase基因与C3植物PEPCase基因有71%的同源性。Gupta等(1994)通过诱导，使C3植物冰叶日中花(M.crystallinum)中PEPCase的同源基因转录水平大大提高。Hermans等(1990)通过研究C3和C4植物中特殊酶专一性同源基因，发现同种黄花菊属种类中的PEPCase基因具有相同的序列段，研究表明这些同源基因是由共同的原始基因进化而来，只是在不同的植物中有不同的表达。前面谈到在植物中CA有C4型(细胞质CA)和C3型(叶绿体CA)，它们基因的不同仅仅是表达水平的不同，细胞质基因高水平表达，而叶绿体基因低水平表达。Badger等(1994)指出两种CA的启动子区域不同导致了两种CA的不同表达。有关C4植物与C3植物PEPCase基因表达区可能为启动子作用不同而使不同种类的PEPCase表达不同，即C4植物高水平表达，而C3植物则低水平表达，说明光调节光合酶基因的表达具有复杂的机理。由于同源基因在不同环境下的表达不同，因此能否通过人为的方法修饰启动子，使C4途径的酶在C3植物中大量表达呢?如果这种设想取得成功，那么C4途径在C3植物中的表达将大大提高，C3植物光合效率也将会有较大改变，从而为作物改良提供了新的分子生物学途径。

2.2 影响C3植物中C4途径的出现和表达的因素

2.2.1 环境因子 Ueno等(1988)发现两栖类植物荸荠已经进化成在不同的生长条件下、具有不同的光合类型。在陆生条件下，表现为C4碳代谢特征；而在水生条件下，则表现为C3植物特征。Teese(1995)发现在高温下，黄花菊属的lineanis类似C4途径特征的表现增强，同时提高CO2同化效率。Reiskind(1989)发现，在低浓度的CO2条件下，能使C3植物诱导出类似C4植物特征，随着类似C4途径的出现，它们的光呼吸强度和CO2补偿点降低。Reiskind等(1997)发现黑藻(Hydrilla)虽然没有复杂的细胞内区域化，但极易通过诱导出现类似C4途径特征，从而提高CO2同化率，所以在研究C3植物诱导出现C4光合途径，黑藻被认为是一个优秀的材料。

2.2.2 植物不同发育阶段的影响 影响C4途径表达的因素是多方面的，除了环境是一个重要因素外，不同的植物发育阶段也是一个重要影响因素，这一现象已在许多植物中被发现。

在粟米草属(Mollugo nudicaulis)中同一植物内，嫩叶进行C3途径，老叶属C4途径，中部叶植物中间类型。甘蔗本来为C4型植物，但植物老化时，出现C3植物的特征。Khanna等(1973)报道过高梁在开花后其光合碳同化向C3途径的转变，此时RuBPCase活性大于PEPCase活性，而且初期产物中磷酸甘油酸(3-PGA)较多，但叶片仍保持有Kranz构造。这些说明不同的发育阶段确实影响C4途径的表达。

2.3 几种C3植物中C4途径的作用机理

尽管人们已经发现环境因子的诱导对C4途径表达很重要。但是C3植物既不具备C4植物的Kranz结构，也没有C4途径酶的区域分隔，即叶肉细胞和鞘细胞之分。那么，C3植物中的C4途径又如何运行的呢?对此许多研究工作者作过探索，并提出几种设想。

2.3.1 碳酸酐酶作用机理 在C4植物中CA定位在叶肉细胞的细胞质中，在鞘细胞中只有极微的CA活力。在C3植物中CA定位于叶绿体中，在不同植物中，叶绿体CA含量占整个细胞CA含量的比例为86％～95%。Popova等(1990)发现在低CO2条件下，CA参与C3植物对低CO2浓度的适应。CA和叶肉细胞中的PEPCase联合起来，反应过程如下：CO2→HCO3→OAA，CA位于叶绿体中，OAA通过NADP-苹果酸脱氢酶被还原成Mal，并且Mal能被脱羧；另一种反应也可能是OAA直接被脱羧，并生成底物PEP。在这两种情况下脱羧生成的CO2将加强CO2被固定，伴随着CA的参与，CO2与H2O反应，会生成HCO3，通过这种方式，CO2进入细胞质，并且运转到叶绿体的RuBPCase作用的部位。在C3植物中，这种反应将作为一种CO2同化适应机理运行。