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PeterFryePeterFrye，演员、编剧、导演、制作人，主要作品《Jesus》、《我喜欢迈克》、《Giv"a24EinaOna》。外文名：PeterFrye职业：演员代表作品：《Jesus》合作人物：JohnKrish

蛋白质含量测定方法比较本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH| + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。五种蛋白质测定方法比较如下：方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法（Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏50～100mg 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高～5mg 慢速 40～60分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高1～5mg 快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 二、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。H2OO=C C=OHN NHR-CH CH-RO=C Cu C=OHN NHR-CH CH-RH2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O64H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。（B） 0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。Folin—酚试剂法实验表格：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700） 2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。四、改良的简易Folin—酚试剂法（一）试剂1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。3. 标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。五、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表格：管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml)未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝G－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg）光吸收值（A595） （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。六、紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。下面介绍四种紫外吸收法：1. 280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。蛋白质浓度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)(Q 1%浓度10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm)溶菌酶 ： A1％1cm=22.8 (280nm)若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：管号 1 2 3 4 5 6 BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 A280 用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 1.8纯核酸的光吸收比值： A280/A260 0.5含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。3. 215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差D= A215 －A225以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。4. 肽键测定法蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。

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原理简介 BCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓度定量试剂盒是在世界上常用的蛋白浓度检测方法之一BCA法基础上改进而成。众所周知，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（biuret reaction），一价铜离子和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。 产品特点 1．步骤简单，45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。 2．灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。 3．BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。 4．在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。 5. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 BCA蛋白质定量检测试剂 在蛋白质的表达纯化，结构和功能的研究工作中，蛋白质的定量随处可见。但是，什么是理想的蛋白质定量方法？如何准确、快速的对蛋白质进行定量，对于不同的样本，如何选取相应的蛋白质定量试剂和方案？如何避免实验中引入的其它物质对蛋白质定量的干扰，PIERCE为这一切提供了可以信赖的解决方案。 PIERCE的BCA(bicinchoninic acid)蛋白质检测试剂是当前比Lowry法更优越的专用于检测总蛋白质含量的产品。该方法以快速灵敏、稳定可靠且对不同种类蛋白质变异系数甚小而深受专业人士的青睐。其中MicroBCA产品可检测到0.5μg/ml的微量蛋白，是目前已知的最灵敏的蛋白质检测试剂之一。 主要特点： · 准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml,采用加强方法可检测到 5μg/ml；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml。 · 快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。 · 经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量。 · 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。 · 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考玛斯亮蓝。 基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

克利夫兰戏院广场的开始几乎是举世公认的1921年2月5日，洛克的国家剧院开张，展示了过去的照片剧（无声电影）波莉。据一篇刊登在《平原商人》杂志上的文章称，这是一场盛大的活动，俄亥俄州州长哈里·L·戴维斯、克利夫兰市市长威廉·菲茨杰拉德、许多其他市州官员和商人，还有一支由马库斯·洛夫率领的无声电影明星队伍，马库斯·洛夫是这家新剧院的主人，也是一位，二十世纪初，美国电影娱乐业发生了革命性的变化。当天的日程还包括下午的 *** ， *** 在市政厅停下来，菲茨杰拉德市长向勒夫赠送了一把城市钥匙，然后前往豪华的斯塔勒酒店。在那里，扶轮社在饭店的大宴会厅举行午餐会招待客人。然而，在《平原商人》那一天的报道中，明显忽略了任何关于洛的斯蒂尔曼剧院（Stillman Theater）的报道，该剧院位于斯塔勒，就在举行午餐会的舞厅旁边。不管这个遗漏的原因是什么，回首今天，差不多一个世纪后，你可以提出一个很好的论点，如果没有斯蒂尔曼剧院（Loew的第一个市中心剧院）的话，1921年2月5日国家剧院就不会有盛大的开幕式，也许根本就没有剧场广场，或者至少不在克利夫兰的上欧几里得大街上。 斯蒂尔曼剧院，建于1915-1916年，比1921年的加拉剧场广场事件早了5年，并不是一个low剧院。这是伊曼纽尔·曼德尔鲍姆（Emanuel Mandelbaum）的创意，他是位于东83街和欧几里得大街的尼克伯克剧院（Nickerbocker Theater）的富有远见的老板，他想在市中心开设一家剧院，该剧院的设计和建造主要是为了放映无声电影，而不是杂耍表演。1915年，他获得了斯塔勒酒店西侧的房产租赁权，并与酒店业主建立了合作关系，使得斯塔勒在酒店西侧修建了一个附加设施，曼德尔鲍姆在酒店后面修建了他的剧院， 曼德尔鲍姆决定把他的新剧院叫做斯蒂尔曼剧院斯蒂尔曼”是斯蒂尔曼威特的名字，一个内战时期克利夫兰铁路男爵，以他的商业诚信和慈善捐赠闻名。1884年，在他1875年去世9年后，维特的家人在他以前的庄园最西边的土地上建了一家豪华酒店。为了纪念他，他们称之为“斯蒂尔曼”。这是第一家建在市中心公共广场以东的酒店。虽然这是19世纪末克利夫兰精英们最喜欢的酒店，但随着上欧几里得大道在约翰·哈特内斯·布朗、查尔斯·帕克等克利夫兰商人的视野下开始高度商业化，它以及附近的斯蒂尔曼·维特大厦在1902年或大约1902年被夷为平地。伊曼纽尔·曼德尔鲍姆将他的剧院命名为斯蒂尔曼酒店的旧址，以及斯蒂尔曼·维特的庄园，显然是希望克利夫兰人能将这座新剧院与过去的奢华之地以及该市早期受人敬仰的精英之一联系在一起。 ，而Statler的新加入酒店由乔治·B·波斯特父子公司（George B.Post&Sons）设计，同样的建筑师设计了东9街和欧几里得大街拐角处美丽的克利夫兰信托银行大楼，斯蒂尔曼剧院本身主要由托马斯·W·兰姆设计，一位建筑师，以二十世纪初他在美国城市建造的美丽剧院而闻名。按照设计，新剧院可以舒适地容纳1800名观众，其中1200人在主礼堂，600人在上面的阳台。它是如此的优雅，以至于一位建筑评论家将它与伦敦德鲁里巷的皇家剧院、梵蒂冈的斯卡拉瑞吉亚剧院和纽约市的斯特兰德剧院相提并论。除了它的优雅，新剧院有一个创新型的缎面电影屏幕，设置在剧院的舞台后部，和一个兽人赫斯特拉在舞台的正前方挖坑，所有这些都是为了改善观众的视觉和听觉体验。当地作家艾伦·杜特卡称之为克利夫兰“第一座真正的电影宫”的斯蒂尔曼剧院于1916年9月开幕，放映了《白雪公主》，这是一部在克利夫兰制作的无声电影，在克利夫兰高地费尔蒙特大道H.a.屈里曼庄园和其他地区拍摄，使用本地演员。 尽管其美丽和优雅，其创新的剧院改进，斯蒂尔曼剧院并没有得到一个良好的开端财政。在经历了两年的低上座率后，曼德尔鲍姆于1918年把剧院卖给了马库斯勒夫，后者降低了价格，做了更好的广告，并为剧院带来了更高质量的电影。斯蒂尔曼剧院很快成为克利夫兰最受欢迎的娱乐场所之一，多年来，它因首映了20世纪上半叶克利夫兰的几乎所有最伟大的电影而闻名，其中包括1928年的第一部“会说话”的电影《爵士歌手》，1940年轰动一时的电影《飘》。1936年8月10日，在德国慕尼黑举行的1936年奥运会上，克利夫兰·杰西·欧文斯的历史性径赛表演首次出现在这里，就在这位家乡英雄在那里获得第四枚金牌的一天后， 在购买斯蒂尔曼剧院后不久，马库斯勒夫开始努力整合美国各地的电影公司，包括在他的中西部总部克利夫兰。1919年，他与其他四家剧院的所有者达成协议，成立了一家名为Loew"s Ohio theaters，Inc.的公司。在成为新公司一部分的剧院中，有位于公共广场附近的上下商场剧院和位于东105街Euclid大道上的Alhambra剧院，这两家剧院均为部分，作者约瑟夫·拉隆格，也是克利夫兰一家房地产公司的老板。拉隆格成为洛伊在新公司的副总裁。此时，克利夫兰一些最宏伟的娱乐场所，包括阿罕布拉剧院和由汉弗莱家族拥有的著名溜冰场“极乐世界”，位于东105街欧几里得大街附近，这一地区当时常被称为克利夫兰的第二市中心。1919年，当媒体报道他打算在那里建克利夫兰最大的电影院时，勒夫就盯上了那个街区。然而，很可能是在约瑟夫·拉隆格的催促下，勒夫在第二年宣布，他打算在东14街附近的上欧几里得大街（upper Euclid Avenue）修建自己的大剧院，距离他的斯蒂尔曼剧院只有几个街区。Loew修改后的计划导致一年后，3446个座位的国家剧院开业时，Playhouse广场成立。其余的，正如人们常说的，是历史。 虽然现在大多数克利夫兰人甚至不记得斯蒂尔曼剧院，更不用说就它是否在1916年的开放无情地导致在上欧几里得大街上的剧场广场的建立展开辩论了，它显然是从20世纪20年代初开始的一个剧场广场剧院，是这样做的广告，一直持续到1963年关闭。如果它位于东面一个街区左右，远离斯塔勒酒店，更靠近其他剧场广场剧院的位置，也许它和其他剧院一样，在1970年代被雷·谢泼森拯救了，然而，它紧挨着一家有扩建计划的酒店的位置注定了它的命运。甚至在斯蒂尔曼剧院最后一部电影——史诗历史剧《 *** 的劳伦斯》（Lawrence of Arabia）上映之前，克利夫兰就有传言说，这部电影将被夷为平地，以便赌徒可以在这里建一个停车场。这对许多克利夫兰人来说都是一个打击，包括平庸的电影评论家W.Ward Marsh，他在1963年6月9日的专栏中报道了这个谣言。在分享了他对剧院的个人记忆之后，马什鼓励那些和他一样不想看到剧院被拆掉的人“保留他们的发现”rs划了十字“也许停车场不会来”很长一段时间。“不幸的是，对于马什和其他斯蒂尔曼剧院的爱好者来说，他建议的手指划没有起作用，剧院在第二年就被拆掉了。”

[=2,4-dithiobiuret]2,4-二硫代缩二脲，是一种化学有机试剂

《激情沸点》百度网盘高清资源免费在线观看：链接: https://pan.baidu.com/s/1bQ9kXSrufd8g-HDNvIYAPw?pwd=vt8t 提取码: vt8t《激情沸点》导演: 丹尼斯·霍珀编剧: 查尔斯·威廉姆斯、Nona Tyson主演: 唐·约翰逊、维吉妮娅·马德森、詹妮弗·康纳利、查尔斯·马丁·史密斯、威廉姆·赛德勒、杰里·哈德因、巴里·柯宾、莱昂·里皮、杰克·南斯、Virgil Frye、约翰·霍克、James N. Harrell、Edith Mills类型: 剧情、爱情、惊悚、犯罪 制片国家/地区: 美国语言: 英语上映日期: 1990-10-26(美国)片长: 130分钟又名: 激情热点 一名流浪客来到德克萨斯一个州的小镇，却为当地人带来了一场情欲和罪恶风暴，不久，他发现自己夹在两名女子和一个男人之间，而且性命不保……

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fly[flai]Frye[frai]区别很大啊！一个是fu"le~ai~itheotheroneisfu"ru~ai~i英文名叫什么的都有，有叫花名的，有叫水果名。Frye一般是姓，但没人规定不可以是名啊。还有James，Green。。。都是叫名叫姓的都有

常用紫外分光光度法测定蛋白质含量.以下引用：6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热.含氮有机物即分解产生氨（消化）,氨又与硫酸作用,变成硫酸氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量.若以甘氨酸为例,其反应式如下： nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成,反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行.为了加速消化,可以加入cuso4作催化剂,k2so4以提高溶液的沸点.收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸.实验和计算方法这里从略.计算所得结果为样品总氮量,如欲求得 样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得.如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6．25即得.二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物.在强碱性溶液中,双缩脲与cuso4形成紫色络合物,称为双缩脲反应.凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应. 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量.测定范围为1-10mg蛋白质.干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等.此法的优点是较快速 ,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少.主要的缺点是灵敏度差.因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定.（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度.如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液.牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制,酪蛋白用0．05n naoh配制.（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（cuso4u20225h2o）和6.0克酒石酸钾钠（knac4h4o6u20224h2o）,用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）.此试剂可长期保存.若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制.2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等.（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂.充分摇匀后,在室温（20～25℃）下放置30分钟,于540nm处进行比色测定.用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液.取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线.2、样品的测定：取2～3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度.注意样品浓度不要超过10mg/ml.三、folin—酚试剂法（lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一.过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购）,近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代.此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度.这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物.folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）.在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比.folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤.以后在生物化学领域得到广泛的应用.这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多.对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰lowry反应.而且对后者的影响还要大得多.酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用.浓度较低的尿素（0.5%）,硫酸纳（1%）,硝酸纳（1%）,三氯乙酸（0.5%）,乙醇（5%）,乙醚（5%）,丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线.含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定.若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍.进行测定时,加folin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定,但上述还原反应只在ph=10的情况下发生,故当folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生.此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定.此法可检测的最低蛋白质量达5mg.通常测定范围是20~250mg.（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（a）10克 na2co3,2克 naoh和0.25克酒石酸钾钠 （knac4h4o6u20224h2o）.溶解于500毫升蒸馏水中.（b）0.5克硫酸铜（cuso4u20225h2o）溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份（a）与1份（b）混合,即为试剂甲.（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠（na2wo4u20222h2o）,25克钼酸钠（na2moo4u20222h2o）及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫 酸 锂（li2so4）,50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴.冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤）.稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存.使用时用标准naoh滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1n左右.（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250mg/ml左右.牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9%nacl溶液.2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）.用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温（20～25℃）放置10分钟.再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂）,同样立即混匀.这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱.然后在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各管中溶液的吸光度值.以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线.注意：因lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即第1支试管加入5毫升试剂甲后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲,2分钟后加第3支试管,余此类推.全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后加第3支试管,余此类推.待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测定光吸收.每分钟测一个样品.进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格.表中是每个试管要加入的量（毫升）,并按由左至右,由上至下的顺序,逐管加入.最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值.folin—酚试剂法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（a700）2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克）,按上述方法进行操作,取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照.通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起,同时进行.即在标准曲线测定的各试管后面,再增加3个试管.如上表中的8、9、10试管.根据所测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而计算出样品溶液的蛋白质浓度.注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化.因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）.四、改良的简易folin—酚试剂法（一）试剂1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中,含0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜,配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后,最后加入.2. 试剂乙：与前面的基本法相同.临用时加蒸馏水稀释8倍.3. 标准蛋白质溶液：同基本法.（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同.只是试剂甲改为1毫升,室温放置10分钟后,试剂乙改为4毫升.在55℃恒温水浴中保温5分钟.用流动水冷却后,在660nm下测定其吸光度值.改良的快速简易法,可获得与 folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果. 五、考马斯亮兰法（bradford法）（一）实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法.1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法）,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的.这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用.这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法.考马斯亮兰g-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置（lmax）,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合.在595nm下测定的吸光度值a595,与蛋白质浓度成正比.bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高,据估计比lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg.这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质－染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多.（2）测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间.（3）干扰物质少.如干扰lowry法的k+、na+、mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法.此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差.（2）仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有：去污剂、 triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1n的naoh.（如同0.1n的酸干扰lowary法一样）.（3）标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液,用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa),配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液.（2）考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,用水稀释至1升.2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组按表中顺序,分别加入样品、水和试剂,即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用无离子水补充到0.1ml.最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除）.未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管.（2）加完试剂2-5分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595,空白对照为第1号试管,即0.1mlh2o加5.0mlg—250试剂.注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）,可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色.塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡.考马斯亮兰法实验表管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml)未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝g－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg）光吸收值（a595）（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标,用吸光度值a595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线.由此标准曲线,根据测出的未知样品的a595值,即可查出未知样品的蛋白质含量.0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.50.2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml h2o, 考马斯亮蓝g－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线,测定595nm的光吸收值.0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595约为0.29.六、紫外吸收法蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质.吸收高峰在280nm处,其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比.此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比.利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定.紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用.低浓度的盐,例如生化制备中常用的（nh4）2so4等和大多数缓冲液不干扰测定.特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值.此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差.故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质.若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰.核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正.但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差.此外,进行紫外吸收法测定时,由于蛋白质吸收高峰常因ph的改变而有变化,因此要注意溶液的ph值,测定样品时的ph要与测定标准曲线的ph相一致.下面介绍四种紫外吸收法：1. 280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收,且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大,因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法.测定时,将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中,用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照,在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值a280.蛋白质浓度可控制在0.1～1.0mg/ml左右.通常用1cm光径的标准石英比色皿,盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时,a280约为1.0左右.由此可立即计算出蛋白质的大致浓度.许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（a1％1cm）有文献数据可查,根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度.下式列出了蛋白质浓度与（a1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%,光径为1cm时的光吸收值）的关系.文献值a1％1cm,?称为百分吸收系数或比吸收系数.蛋白质浓度 = (a280′10 )/ a1％1cm,280nm (mg/ml)(q 1%浓度?10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ： a1％1cm=6.3 (280nm)溶菌酶 ： a1％1cm=22.8 (280nm)若查不到待测蛋白质的a1％1cm值,则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质,用标准曲线法进行测定.标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml.常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（bsa）.标准曲线的测定：取6支试管,按下表编号并加入试剂：管号 1 2 3 4 5 6 bsa（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0h2o 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0a280用第1管为空白对照,各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度a280,以a280为纵座标,各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图,标准曲线应为直线,利用此标准曲线,根据测出的未知样品的a280值,即可查出未知样品的蛋白质含量,也可以用2至6管a280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的a1％1cm,280nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收,在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克）,但核酸在260nm处的吸收更强,其吸收高峰在260nm附近.核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍,而蛋白质则相反,280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值.通常：纯蛋白质的光吸收比值：a280/a260 ? 1.8纯核酸的光吸收比值： a280/a260 ? 0.5含有核酸的蛋白质溶液,可分别测定其a280和a260,由此吸收差值,用下面的经验公式,即可算出蛋白质的浓度.蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×a280－0.74×a260 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的.3. 215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时,可用215nm与225nm吸收值之差,通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度.用已知浓度的标准蛋白质,配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液,分别测定215nm和225nm的吸光度值,并计算出吸收差：吸收差d= a215 －a225以吸收差d为纵座标,蛋白质浓度为横座标,绘出标准曲线.再测出未知样品的吸收差,即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度.本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内,蛋白质浓度与吸光度成正比,nacl、（nh4）2so4以及0.1m磷酸、硼酸和tris等缓冲液,都无显著干扰作用,但是0.1n naoh, 0.1m乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大,必须将其浓度降到0.005m以下才无显著影响.4. 肽键测定法蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱,与肽键的多少成正比.因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50～500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液,测定238nm的光吸收值a238,以a238为纵座标, 蛋白质含量为横座标,绘制出标准曲线.未知样品的浓度即可由标准曲线求得.进行蛋白质溶液的柱层析分离时,洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位.本方法比280nm吸收法灵敏.但多种有机物,如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用.所以最好用无机盐,无机碱和水溶液进行测定.若含有有机溶剂,可先将样品蒸干,或用其他方法除去干扰物质,然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定.

美国 弗莱

常用紫外分光光度法测定蛋白质含量。以下引用：6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制，酪蛋白用0．05n naoh配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（cuso4u20225h2o）和6.0克酒石酸钾钠（knac4h4o6u20224h2o），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、folin—酚试剂法（lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。folin—酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。进行测定时，加folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（a）10克 na2co3，2克 naoh和0.25克酒石酸钾钠 （knac4h4o6u20224h2o）。溶解于500毫升蒸馏水中。（b）0.5克硫酸铜（cuso4u20225h2o）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（na2wo4u20222h2o）,25克钼酸钠（na2moo4u20222h2o）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫 酸 锂（li2so4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准naoh滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%nacl溶液。2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。folin—酚试剂法实验表管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0（250mg/ml）未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（a700）2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。四、改良的简易folin—酚试剂法（一）试剂1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。3. 标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。改良的快速简易法，可获得与 folin—酚试剂法（即lowry基本法）相接近的结果。五、考马斯亮兰法（bradford法）（一）实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰lowry法的k+、na+、mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1n的naoh。（如同0.1n的酸干扰lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰g—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰g—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595，空白对照为第1号试管，即0.1mlh2o加5.0mlg—250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

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烁【读音】shuò【基本字义】 光亮的样子：闪～。珠～晶莹。【详细字义】形：1.　形声。从火,乐声。本义:发光的样子2.　同本义3.　热;烫;烤灼。如:烁玉流金(烁石流金。动：1.　摇曳;闪烁2.　通“铄”。销熔3.　又如:烁金(熔化金属;另指伤人的谗言)【常用词组】1.　闪烁 指闪闪发光的东西。2.　烁亮 shuòliàng :明亮异常3.　烁烁shuòshuò :〖glisten〗(光芒)闪动的样子

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Hey! Hey! Hey! Hey! Hey![Rainbow Dash]Awesome as I wanna be[The Rainbooms]Hey! Hey! Hey! Hey! Hey! Hey![Rainbow Dash]Awesome as I wanna beFirst you see me riding on a sonic boomGot my guitar shreddin" up my latest tuneThere is nothin" you can do to beat meI"m so good that you can"t defeat me[Rainbow and the Rainbooms]Yeah, I"m awesome, take cautionWatch out for me, I"m awesome as I wanna be(Yeah!) I"m awesome, take cautionWatch out for me, I"m awesome as I wanna be[The Rainbooms]Hey! Hey! Hey! Hey! Hey! Hey!Hey! Hey! Hey! Hey! Hey! Hey![Rainbow Dash]Step aside now, you"re just gettin" in my wayI got sick chops you could never hope to playWhen it comes to makin" music, I"m the rulerYou wish you could be twenty percent cooler[Rainbow and the Rainbooms]Yeah, I"m awesome, take cautionWatch out for me, I"m awesome as I wanna be(Yeah!) I"m awesome, take cautionWatch out for me, I"m awesome as I wanna be!Welcome To The Show[The Dazzlings][vocalizing][Adagio Dazzle]Welcome to the show[Sonata Dusk and Aria Blaze]Ah-ah-ah-ah, ah[Adagio Dazzle]We"re here to let you know[Sonata Dusk and Aria Blaze]Ah-ah-ah-ah-ah-ah[Adagio Dazzle]Our time is now[Sonata Dusk and Aria Blaze]Ah-ah-ah-ah, ah[Adagio Dazzle]Your time is running out[Sonata Dusk and Aria Blaze]Ah, ah, ah[The Dazzlings][vocalizing]Feel the wave of soundAs it crashes downYou can"t turn awayWe"ll make you wanna stayWe will be adoredTell us that you want usWe won"t be ignoredIt"s time for our rewardNow you need usCome and heed usNothing can stop us now[The Rainbooms]Oh-oh, oh-whoa-ohI"ve got the music in meOh-oh, oh-whoa-oh[Twilight Sparkle]Don"t need to hear a crowdCheering out my nameI didn"t come here seekingInfamy or fame[The Rainbooms]The one and only thingThat I am here to bringIs music, is the musicIs the music in my soulGonna break out (Out!)Set myself free, yeahLet it all go (Go!)Just let it be, yeahFind the music in your heartLet the music make you startTo set yourself apart[The Dazzlings]What we have in storeAll we want and moreWe will break on throughNow it"s time to finish you![drum solo][Sunset Shimmer]You"re never gonna bring me downYou"re never gonna break this part of meMy friends are here to bring me "roundNot singing just for popularity[Sunset Shimmer and Twilight Sparkle]We"re here to let you knowThat we won"t let it goOur music is a bomb and it"s about to blowAnd you can try to fightBut we have got the light of[The Rainbooms]Friendship on our side!Got the music in our heartsWe"re here to blow this thing apartAnd together, we will neverBe afraid of the darkHere to sing our song out loudGet you dancing with the crowdAs the music of our friendshipSurvives, survives[All sans Dazzlings]Got the music in our heartsWe"re here to blow this thing apartAnd together, we will neverBe afraid of the darkHere to sing our song out loudGet you dancing with the crowdAs the music of our friendshipSurvives, survives, survives!Shine Like Rainbows[Applejack]Once upon a timeYou came into my world and made the stars align[Rarity]Now I can see the signsYou pick me up when I get down so I can shine[The Rainbooms]Shine like rainbowsShine like rainbowsShine like rainbowsShine like rainbows[Rainbow Dash]Friends, you are in my lifeAnd you can count on me to be there by your side[Sunset Shimmer]And when the music comes aliveWe sing our songs to lift us up so we can shine[The Rainbooms]And the sound that we hear in our heartsMakes a crescendoAnd the light that ignites in the darkIt makes us all glowAnd shine like rainbowsWe shine like rainbowsShine like rainbowsWe shine like rainbowsTogether we standAs the rain begins to fallAnd holdin" our heads up highAs the sun shines through it all[The cast]And the sound that we hear in our heartsMakes a crescendoAnd the light that ignites in the darkIt makes us all glowAnd shine like rainbowsWe shine like rainbowsShine like rainbowsWe shine like rainbows[The Rainbooms]We shine like rainbows希望你喜欢，支持我哦！

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Dazzling Red - 这个人（uc774 uc0acub78c）孝琳（sistar）&妮可（kara）&泫雅（4minute）&孝盛（secret）&Nana（after school）Producer：xuxinfinallyI Know this love will kill meBut(I don"t know why) uc65c ub0a0 uc774ub9acub3c4 uad34ub86dud788ub294 ub2c8uac00 为什么你要这样折磨我(I don"t know why) uc65c ub0a0 uc774ub9acub3c4 ubab0ub77cuc8fcub294 ub2c8uac00 为什么你这么不懂我(I don"t know why) ubb50uac00 uadf8ub9acub3c4 ub09c uc88buc740uc9c0 为什么这样我还是喜欢你uc774uc0acub78c uc774uc0acub791 ub55cuc5d0 uc8fduaca0uc5b4Let go 这个人 这份爱 足以令我死去 Let goub9d0ub3c4 ucc38 ubb34ub69dub69dud558uac8cub9cc ud558uace0 说话的时候语气真的很生硬ub098ubcf4ub2e4 uce5cuad6cuac00 ud56duc0c1 uba3cuc800uace0 比起我总是先想到朋友uc8fcub9d0ub9cc ub418uba74 uc2e0ub098uac8c ub180uae30ub9cc ubc14uc058uace0 到了周末就兴奋地忙着玩ub0b4 ub9d8ub3c4 ubaa8ub974ub294 uc774uc0acub78c uc5b4ub5a1ud560uae4cuc694 连我的心都不懂 对你这个人我要怎么办ub2c8uac00 ub2c8uac00 ubb54ub370 你 你算什么uc65c ub098ub97c uc6b8ub824 ubbf8uc6ccuc8fduaca0uc5b4 为什么让我哭泣 讨厌死你了uc18duc0c1ud574 uc0b4 uc218 uc5c6uc796uc544 ub2c8uac00 ub2c8uac00 ubb54ub370 悲伤地要活不下去了 你 你算什么uc790uafb8ub9cc ub04cub824 ubbf8uc6ccuc8fduaca0uc5b4 总是被你吸引 讨厌死你了uc774uc820 uc5b4uca54 uc218 uc5c6uc796uc544 现在我什么也做不了了(I don"t know why) ub0b4 ub9c8uc74cuc774 我的心(I don"t know why) uc65c uc774ub7f0uc9c0 为什么这样(I don"t know why)ubaa8ub974uaca0uc5b4 我不明白uc774uc0acub78c uc774uc0acub791 ub55cuc5d0 uc8fduaca0uc5b4 这个人 这份爱 足以令我死去ub0a0 uc6b8ub9acub294 uc774uc0acub78c uc774uae30uc801uc774 uc774uc0acub78c 让我哭泣的这个人 自私的这个人ubc14ub78c uac19uc740 uc774uc0acub791 ubb50uac00 uadf8ub9acub3c4 uc88buc740uc9c0 像风一样的爱情 为什么我这样喜欢你ub0a0 uc6b8ub9acub294 uc774uc0acub78c uc774uae30uc801uc774 uc774uc0acub78c 让我哭泣的这个人 自私的这个人uac08ub300 uac19uc740 uc774uc0acub791 uc774uc0acub791 ub55cuc5d0 uc8fduaca0uc5b4 像芦苇一样的爱情 这份爱 足以令我死去uc774 uc0acub78cuc740 ub0b4uac8c uc65c uc774ub7f4uae4cuc694? 这个人 为什么要这样对我？ub300uccb4 uc5b4ub290 ubcc4uc5d0uc11c uc654uc744uae4cuc694? 到底是从哪个星球来的啊？uc5b4uca5c uc774ub9acub3c4 uadf8ub807uac8c ub9d0ud574ub3c4 就算我这么向他表明心意ub9e8ub0a0 uc9c0ubc16uc5d0 ubaa8ub97cuae4cuc694? 这个人为什么就是不明白uc774 ub098uc05c uc0acub78cuc774 ub09c ubb50uac00 uadf8ub9ac uc774uc058ub2e4uace0 你这个坏人 到底我觉得你哪里好ub09c ud558ub8e8uac00 uba40ub2e4ud558uace0 uc9d5uc9d5ub300 ub610 ubcf4uace0uc2f6ub2e4uace0 我一天不停地发牢骚 却又想念他ub2c8uac00 ub2c8uac00 ubb54ub370 你 你算什么uc65c ub098ub97c uc6b8ub824 ubbf8uc6ccuc8fduaca0uc5b4 为什么让我哭泣 讨厌死你了uc18duc0c1ud574 uc0b4 uc218 uc5c6uc796uc544 ub2c8uac00 ub2c8uac00 ubb54ub370 悲伤地要活不下去了 你 你算什么uc790uafb8ub9cc ub04cub824 ubbf8uc6ccuc8fduaca0uc5b4 总是被你吸引 讨厌死你了uc774uc820 uc5b4uca54 uc218 uc5c6uc796uc544 现在我什么也做不了了(I don"t know why) ub0b4 ub9c8uc74cuc774 我的心(I don"t know why) uc65c uc774ub7f0uc9c0 为什么这样(I don"t know why) ubaa8ub974uaca0uc5b4 我不明白uc774uc0acub78c uc774uc0acub791 ub55cuc5d0 uc8fduaca0uc5b4 这个人 这份爱 足以令我死去ub0a0 uc6b8ub9acub294 uc774uc0acub78c uc774uae30uc801uc774 uc774uc0acub78c 让我哭泣的这个人 自私的这个人ubc14ub78c uac19uc740 uc774uc0acub791 ubb50uac00 uadf8ub9acub3c4 uc88buc740uc9c0 像风一样的爱情 为什么我这样喜欢你ub0a0 uc6b8ub9acub294 uc774uc0acub78c uc774uae30uc801uc774 uc774uc0acub78c 让我哭泣的这个人 自私的这个人uac08ub300 uac19uc740 uc774uc0acub791 uc774uc0acub791 ub55cuc5d0 uc8fduaca0uc5b4 像芦苇一样的爱情 这份爱 足以令我死去uc81cubc1c ub108 uc815uc2e0 uc880 ucc28ub824 拜托 你清醒点uc81cubc1c ub108 ub0b4 ub9d0 uc880 ub4e4uc5b4Boy 拜托 你听一下我的话Boyuc5b8uc81cuae4cuc9c0 ub0b4 ub9d8 uc544ud504uac8cud560ub798 这样伤害我的心要到何时uc5b8uc81cuae4cuc9c0 ub0b4 ub9d8 ubab0ub77c uc904ub798 这样不懂我的心要到何时(I don"t know why)Baby I know this love will kill me(I don"t know why) Baby you know Can"t stop love you(I don"t know why)Baby I know this love will kill meuc774uc0acub78c uc774uc0acub791 ub55cuc5d0 uc8fduaca0uc5b4 这个人 这份爱 足以令我死去

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你好，你是想问黑色的十字标志是什么牌子的项链吗?黑色的十字标志是梵克雅宝项链。梵克雅宝的黑色十字形徽标是其标志性的标记之一，代表着其高端、精湛的工艺和设计。梵克雅宝最著名和经典的珠宝设计之一是“Alhambra四叶草”系列，这个系列搭配了黑色十字的形状。这个设计灵感来源于具有西班牙穆斯林历史遗迹的Alhambra遗址，梵克雅宝设计师在此受到了启发，将其转化为了四叶草的形状，并赋予其寓意，每个四叶草都代表着幸运、健康、财富和爱情。

　　艾里奥特，一个充满着幻想的小男孩，有个老想着作弄他的哥哥和一个还不太会讲话的小妹妹歌蒂，兄妹三个和不久前离异的母亲住在一起。由于工作忙碌加上心情糟糕，所以母亲时常会忽视和孩子们的关爱和沟通。 　　E.T.，一个被同伴不小心留在地球上的小外星人，却幸运地被善良的小艾里奥特发现，他瞒着妈妈偷偷收留下了孤独无助的E.T.，给它吃巧克力，还把它介绍给自己的狗狗、哥哥和妹妹，虽然语言上E.T.和艾里奥特还无法沟通，但是他们的感情却跨越了一切外在的障碍联系到一起，虽然他们的外型有如此大的差异，但却都有着一颗善良敏感、渴望着爱和呵护的童心。在他们之间，建立起一种奇妙的心灵感应，E.T.难过的时候，艾里奥特也会感觉忧郁，E.T.病了，艾里奥特也跟着不舒服。孤独的E.T.和孤独的艾里奥特成了最好的朋友，于是他们都不再孤独。 　　直到有一天，E.T.不可避免地被大人们发现了。一个活着的外星人！这还得了！于是人们如临大敌，警察、军队、FBI……蜂拥而至，大人们不顾孩子们的苦苦哀求，无情地抓走了E.T.，根本无视此时的它是那么的无辜、脆弱和绝望，他们只想把这个外星人当成千载难逢的珍贵试验品进行研究。 　　艾里奥特在哥哥和伙伴们的帮助下终于从研究中心救出了九死一生的E.T.，不料大人们根本没有放过他们，沿路设下重重关卡意图拦截这支“营救小队”，就在大人的眼皮底下，E.T.展现了它不可思议的神奇力量，带着大家摆脱了“包围圈”。 　　在当初发现E.T.的树林里，来接E.T.回去的外星飞船赶来了，一直念念不忘要回家的E.T.终于要走了，艾里奥特和恋恋不舍地和他的外星朋友告别，望着远去的飞船划破天际艳丽的夕阳，艾里奥特知道，他将会永远永远记住这段短暂却美丽的友谊……