带酶切位点的引物设计问题带酶切位点的引物设计时计算Tm值,退火温度及GC含量时是否要把酶切位点和保护碱基计算在内?我觉得

（1）若要构建重组质粒，一般要用同一种限制酶进行切割，形成相同的黏性末端，然后再用DNA连接酶连接．因此在目的基因和质粒上必须存在同一种限制酶的切割位点，需要对目的基因进行测序，以确定选用何种酶．限制酶的作用的部位是磷酸二酯键．
（2）若用EcoRI酶对目的基因和质粒进行酶切，再用DNA连接酶处理，则由两个DNA片段连接形成的产物有3种：重组质粒、目的基因与目的基因连接物、载体和载体连接物．由于EcoRI酶的识别位点刚好在四环素抗性基因上，因此重组质粒中，该抗性基因已经被破坏，而目的基因与目的基因连接物上没有该基因，只有载体和载体连接物上把两个切割后的四环素抗性基因进行拼接形成两个完整的四环素抗性基因．
（3）为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用EcoRI和BamHI两种酶同时切割目的基因和质粒．由于这两种酶能切割形成不同的黏性末端，使得目的基因与目的基因、载体和载体之间无法连接，而目的基因和质粒却能够连接．
（4）核糖体由蛋白质和rRNA构成，可以利用酶的专一性用蛋白酶将蛋白质水解，从而提纯rRNA，A正确；无水乙醇可以溶解所有光合色素，没有利用生物分子间的特异性结合，B错误；分子杂交手段是利用了碱基互补配对的原则，C正确；抑制成熟基因的mRNA与催化成熟酶基因的mRNA之间发生了碱基互补配对，也利用了分子间特异性结合，D正确．
（5）从变异的角度看，基因工程的原理是基因重组；而植物细胞杂交的原理是染色体变异．
故答案为：
（1）限制性DNA内切酶 磷酸二酯键
（2）3 载体和载体连接物
（3）EcoRI、BamHI
（4）ACD
（5）基因重组染色体变异

点评：
本题考点： 基因工程的应用．

考点点评： 本题围绕分子间的特异性结合的性质，综合考查了基因工程、基因结构、酶的作用特性等知识，本题难度适中，主要考查对教材的熟悉程度及对生物术语的规范运用．

（1）PCR技术能在短时间内大量扩增目的基因，所以已获得的目的基因可利用PCR技术进行扩增．
（2）DNA连接酶连接形成的是磷酸二酯键．
（3）将试管I中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是使目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达，即进行转化；大肠杆菌需事先用Ca²⁺进行处理，增大细胞壁的通透性，使之处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态．
（4）培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质包括碳源、氮源、无机盐、水和生长因子．由于质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此导入质粒的大肠杆菌能抗氨苄青霉素，所以培养基中还应加入氨苄青霉素，作用是筛选出导入pUC18质粒的大肠杆菌．此外培养基中还应加入IPTG、X-gal．
（5）重组质粒上的LacZ基因被破坏，不能产生β一半乳糖苷酶，若大肠杆菌中已成功导入了重组质粒，则其在含有IPTG和X-gal的培养基中形成白色菌落．如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则无论大肠杆菌是否导入重组质粒，均会呈现蓝色菌落，这样不利于重组质粒的筛选．
故答案为：
（1）PCR
（2）磷酸二酯
（3）进行转化 使大肠杆菌细胞处于感受态
（4）碳源、氮源、无机盐、水 导入pUC18质粒的大肠杆菌
（5）白 无论大肠杆菌是否导入重组质粒，均会呈现蓝色菌落

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术；微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用．

考点点评： 本题结合流程图，考查基因工程的相关知识，意在考查考生的识图能力和识记能力；能从题文提取有效信息的能力；能理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能力；能运用所学知识，解决问题的能力．

（1）由于含有目的基因的DNA片段和质粒上均含有EcoRI酶的切割位点，所以用此酶切割后产生相同的黏性末端．这样，具有相同黏性末端的片段用DNA连接酶均可连接，从而产生3种连接产物，目的基因-载体连接物、载体-载体连接物、目的基因-目的基因连接物，所以要进行分离纯化．
（2）由于将细胞放入含四环素的培养基，要将存活tct^R 为四环素抗性基因结构要保持完整，用EcoRI酶切后再用连接酶连接的三种产物只有载体-载体连接物基因结构保持完整．
（3）防止目的基因和基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，需要有两种限制酶，而amp^R为青霉素抗性基因，P启动子，T为终止子，ori为复制原点，结构不能被破坏，故选择EcoRⅠ和BamHⅠ这两种限制酶．
故答案为：
（1）目的基因-载体连接物载体-载体连接物目的基因-目的基因连接物分离纯化
（2）载体-载体连接物
（3）EcoRⅠ和BamHⅠ

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．

考点点评： 学生基因工程工具原理的应用理解不到位，特别是2种工具酶与获取目的基因和表达载体之间的联系与拓展．

A、每个DNA分子上至少有1个酶位点被该酶切断，可以切得的种类有：a、b、c、d、ab、bc、cd、abc、bcd九种，不是3种，A错误；
B、每个DNA分子上至少有1个酶位点被该酶切断，可以切得的种类有：a、b、c、d、ab、bc、cd、abc、bcd九种，不是4种，B错误；
C、每个DNA分子上至少有1个酶位点被该酶切断，可以切得的种类有：a、b、c、d、ab、bc、cd、abc、bcd九种，C正确；
D、每个DNA分子上至少有1个酶位点被该酶切断，可以切得的种类有：a、b、c、d、ab、bc、cd、abc、bcd九种，不是12种，D错误．
故选：C．

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．

考点点评： 主要考查学生对DNA重组技术的基本工具等考点的理解，要求学生能够识记和运用相关知识．

（1）质粒是环状DNA分子，不含游离的磷酸基团；外源DNA分子的每一条链都含有一个游离的磷酸基团，因此共含有2个游离的磷酸基团．
（2）DNA分子中，C与G之间有三个氢键，A与T之间有两个氢键，所以C与G含量越多，DNA分子的热稳定性越高．由表中信息可知，SmaⅠ的识别序列为CCCGGG，酶切位点在C与G之间，因此插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性将越高．
（3）用SmaⅠ酶切割外源DNA和质粒时，会导致目的基因与抗性基因被破坏，因此不能用SmaⅠ构建重组质粒．
（4）BamHⅠ和HinRⅢ两种限制酶切割产生的黏性末端不同，若用这两种限制酶同时处理外源DNA和质粒，再用DNA连接酶连接两者时，可避免切割的外源DNA、质粒的粘性末端自身环化．
（5）将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶．
（6）重组质粒中抗生素基因的作用是鉴别和筛选含有目的基因的细胞．
故答案为：
（1）0、2
（2）高
（3）SmaⅠ
（4）BamHⅠ、HindⅢ
（5）DNA连接
（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．

考点点评： 本题结合基因结构图和运载体结构图，考查基因工程的技术和原理，重点是限制酶和DNA连接酶，要求考生认真分析图1和图2，能根据图中和表中信息选择合适的限制酶，准确判断使用DNA连接酶连接的结果，再运用所学的知识答题．

（1）由图可知，质粒是环状的，切割前没有游离的磷酸基团，质粒中有一个SmaⅠ酶切割位点，所以切割后有两个游离的磷酸基团．
（2）DNA分子中C与G之间有三个氢键，A与T之间有两个氢键，所以C与G含量越多，热稳定性越高，由图可知，SmaⅠ酶切位点的配对方式是C与G配对．
（3）由图可知，目的基因和标记基因中都有SmaⅠ酶切割序列，如用SmaⅠ酶会破坏目的基因和标记基因．
（4）如只使用EcoRⅠ酶切割，会形成相同的黏性末端，可能出现质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化．
（5）DNA连接酶可将目的基因与质粒连接起来形成重组DNA．
（6）重组质粒中抗生素抗性基因是标记基因，作用是为了鉴别和筛选含有目的基因的细胞．
（7）大肠杆菌丧失吸收蔗糖能力，导入蔗糖转运蛋白基因后可恢复吸收蔗糖能力，所以在以蔗糖为唯一含碳营养物质的培养基中培养，可筛选出需要的表达成功的大肠杆菌．
（8）制备cDNA探针时，需提取、分离mRNA作用为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA探针．
（9）基因工程中，切割含有目的基因的DNA片段和载体时用同种限制酶．并用显微注射法导入受精卵中，再利用SRY探针 （Y染色体上的性别决定基因）进行检测，将检测反应呈阴性的胚胎进行移植培养．
故答案为：
（1）0、2　
（2）高
（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因
（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
（5）DNA连接
（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞
（7）蔗糖为唯一含碳营养物质
（8）mRNA 逆转录酶
（9）同种限制酶 显微注射 受精卵 阴性

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．

考点点评： 本题考查基因工程，识记所列知识点，并能运用所学知识做出合理的判断或得出正确的结论的能力．

A、如果用BglⅡ和Sau3A I切割目的基因，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用BglⅡ和Sau3A I切割Pl噬菌体载体也形成这两种相同的黏性末端，因此它们可构成重组DNA，故A正确；
B、由于Sau3A I的切割位点在EcoR I的左侧，因此用EcoR I和Sau3A I切割目的基因，目的基因两端将形成不同的黏性末端，同样用BglⅡ和Sau3A I切割Pl噬菌体载体也形成这两种相同的黏性末端，因此它们可构成重组DNA，故B正确；
C、P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个SmaⅠ的切点，因此用EcoR I切割后，该环状DNA分子变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团，故C正确；
D、从图甲看出，用EcoR I切割目的基因后两端各有一切口，与图乙中EcoR I切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，故D错误．

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．

考点点评： 本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生获取图示信息的能力、审题能力以及分析能力；能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力．

分析图解可知，限制酶Ⅰ在该质粒上有三个限制酶切点，限制酶Ⅱ在该质粒上只有一个酶切位点，如果同时用两种限制酶切割，质粒将会切割形成四种片段，即200（酶Ⅰ和酶Ⅱ切割，黏性末端不同）、200（酶Ⅰ切割，黏性末端相同）、80（酶Ⅰ切割，黏性末端相同）、50（酶Ⅰ和酶Ⅱ切割，黏性末端不同）．
用DNA连接酶处理，要求得到的质粒碱基数目最少，则为形成的片段自身连接，要求具有相同的黏性末端，因此得到的质粒碱基数目最少为80个．
故选：B．

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．

考点点评： 本题考查了基因工程的有关知识，要求考生能够掌握限制酶和DNA连接酶的作用特点；能够结合题意和图解判断切割形成的片段类型；再根据DNA连接酶的作用特点进行判断，难度适中，属于考纲中理解、应用层次的考查．

（1）由于质粒在切割前是一个环状DNA分子，因此上面没有游离的磷酸基团；当质粒被切割后形成了两个末端各有1个游离的磷酸基团，故共有2个游离的磷酸基团．
（2）SmaⅠ酶切位点越多，表示G和C这一对碱基对所占的比例就超高，而G和C之间含有三个氢键，故其热稳定性超高．
（3）质粒抗生素抗性基因为标记基因，由图可知，标记基因和外源DNA目的基因中 均含有SmaI酶切位点，都可以被SmaI酶破环，故不能使用该酶剪切质粒和含有目的基因的DNA．
（4）构建含目的基因的重组质粒A时，选用 BamhHI 和HindⅢ酶对外源DNA和质粒进行切割，这样使目的基因两端的黏性末端不同，可以防止含目的基因的外源DNA片段自身环化，同理，也可以防止质粒自身环化．
（5）为了使目的基因和质粒之间的磷酸二脂键相连，需要用DNA连接酶相连接．
（6）抗生素抗性基因是一种抗性基因，抗性基因是为了鉴别和筛选目的基因是否导入到受体细胞内．
（7）由于分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入大肠杆菌内，然后所给的培养基应为蔗糖为唯一含碳源的培养基．
故答案为：
（1）0、2
（2）高
（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因
（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化
（5）DNA连接
（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞
（7）蔗糖为唯一含碳营养物质

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．

考点点评： 本题以抗病香蕉味素材，考查基因工程和植物组织培养的相关知识，意在考查考生的理解能力、识记能力和应用能力．

A、每个DNA分子上至少有1个酶位点被该酶切断，可以切得的种类有：a、b、c、d、ab、bc、cd、abc、bcd九种，不是3种，A错误；
B、每个DNA分子上至少有1个酶位点被该酶切断，可以切得的种类有：a、b、c、d、ab、bc、cd、abc、bcd九种，不是4种，B错误；
C、每个DNA分子上至少有1个酶位点被该酶切断，可以切得的种类有：a、b、c、d、ab、bc、cd、abc、bcd九种，C正确；
D、每个DNA分子上至少有1个酶位点被该酶切断，可以切得的种类有：a、b、c、d、ab、bc、cd、abc、bcd九种，不是12种，D错误．
故选：C．

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．

考点点评： 主要考查学生对DNA重组技术的基本工具等考点的理解，要求学生能够识记和运用相关知识．

由于该DNA分子为环状，此时分三种情况讨论：
只被其中一种酶切割：无论被那种酶切割，均是长度为1的环状变成长度为1的链状；
被其中两种酶切割：AB切割，产生0.3和0.7长度的线状DNA；AC切割，产生0.2和0.8长度的线状DNA；BC切割，产生两个0.5长度的线状DNA；
被三种酶同时切割时，产生0.2、0.3、0.5三种不同长度的线状DNA．
综上所述，这些DNA分子最多能产生：0.2、0.3、0.5、0.7、0.8、1六种长度不同的线状DNA．
故选：D．

点评：
本题考点： 基因工程的原理及技术．

考点点评： 本题考查了基因工程的工具酶，意在考查考生的分析能力和综合运用能力，难度适中．解题关键是考生能够根据题意分三种情况讨论切割产生的不同长度的片段，然后综合三种情况进行相加即可．