石蜡切片免疫组化染色实验方法是什么？

免疫组化和特殊染色是做病理的，两个必须具备的步骤，因此要一个个做，不要急，不要慌

免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。免疫组织化学的优势在于专一性、灵敏度、简便快速以及成本低廉，所以广为医院采用，通常是借由特定的肿瘤标记来筛选癌症。免疫组织化学染色法对基础研究及预防和诊疗上都是相当重要的一个方法。

MLH1(+)、MSH2(+)PMS2(+)、MSH6(+)，即微卫星稳定型大肠癌，提示适合于含氟尿嘧啶类药物的化疗方案，并且分化差是高危因素之一。免疫组化和特殊染色是病理检查中常用的检测方法，免疫组化全称是免疫组织化学染色，病理检查中最常用的是HE染色，使用非HE染色的检测方法都可以称为特殊染色。都是病理检查中对送检组织进行的处理方法，组织经过一系列的处理之后才能在显微镜下观察其有无病变，病变是什么等。扩展资料：免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。参考资料来源：百度百科-免疫组化

良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和"杂音"染色片（有阳性信号）。 　　一、 无色片 　　染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 　　解决阴性染色的问题非常简单，就是设立"阳性对照".如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为"自身对照"或"内部对照"，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为"外部对照"，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为"外部对照".在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、"腊肠""春卷"切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。 　　设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。 　　抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。 　　二、“杂音”染色片 　　免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为"杂音"染色。"杂音"染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种。 　　1、 全片着色 　　全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有： 　　（1）、抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。 　　（2）、抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。 　　（3）、DAB变质和显色时间太长：DAB现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。 　　（4）、组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。 　　（5）、切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4？C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。（6）、一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

其为制成病理切片，将病变组织包埋在石蜡块里，用切片机切成薄片，进行染色。病理切片为取一定大小的病变组织，用病理组织学方法制成病理切片，将病变组织包埋在石蜡块里，用切片机切成薄片，再用苏木精－伊红（H-E）染色，用显微镜进一步检查病变。病变的发生发展过程，最后作出病理诊断。制作时将部分有病变的组织或脏器经过各种化学品和埋藏法的处理，使之固定硬化，在切片机上切成薄片，粘附在玻片上，染以各种颜色，供在显微镜下检查，以观察病理变化，作出病理诊断，为临床诊断和治疗提供帮助。扩展资料：病理切片的相关内容：1、根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。2、要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。3、切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。参考资料来源：百度百科-病理切片

软组织肿瘤类型很多，由于普通病理切片还不能确定是哪种类型的肿瘤，因此通过一些特异性表达某种肿瘤的抗体进行标记，有望获得明确的病理诊断，所以要借助于免疫组化及特殊染色。经过上述技术，明确诊断后才能分析是否良恶性，所以还得等待结果。如有结果，我可以进一步帮你进行分析。祝好运！

免疫组化非特异性染色建议楼主还是查询文献吧，一般文献中讲解比较详细的哈

近年来，免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可。由于免疫组化染色过程中存在许多步骤或环节，每一步操作都可能影响到染色的最终结果，因此，把握好免疫组化的染色过程意义重大。　　为大家整理一些关于免疫组化染色中经常遇到的问题和处理方法。希望能帮助老师们解决日常工作中遇到的问题。

免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)，免疫组化又称免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。

1.缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条；2.一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议用单克隆抗体看看；3.内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4.非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果5.缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；6.适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；7.防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色多次实验的总结，望采纳

免疫组化染色影响因素影响免疫组化染色质量的因素有很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段，严格的技术操作和对照等。1。假阴性反应可发生在：1) 组织内待测抗原已被分解破坏，或抗原含量过低；2) 抗原被遮盖，多由于醛类固定剂的使用，使组织中的大分子蛋白借醛键形成交联而遮盖待检抗原；3) 抗体质量不佳或稀释度不当；4) 技术操作失误等。2．假阳性反应可发生在：1) 抗体与非待检抗原发生交叉反应，在使用多克隆抗体时易出现；2) 组织对抗体的非特异性吸附，特别是在有大片组织坏死或组织中有较多富于蛋白的液体时容易发生；3) 内源性过氧化酶的作用，在脾脏、骨髓及一些炎性病变组织的染色中易出现；内源性碱性磷酸酶的作用，特别是肠黏膜上皮和肾近曲小管的刷状缘有高浓度的碱性磷酸酶，若处理不彻底，易出现假阳性结果；4) 判断失误，将肿瘤组织中残留的正常组织的免疫组织化学阳性信号误认为是肿瘤的染色反应；5) 当肿瘤浸润破坏正常组织时，使被破坏的正常细胞胞浆内的可溶性蛋白释放，后者被肿瘤细胞非特异吸附或吞噬，使瘤细胞出现该种抗原的阳性反应；⑥外源性和内源性色素的干扰。

免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)，免疫组化又称免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等

免疫组化DAB染色，结果应该是棕黄色。 和染色时间有关系,一般应该是细胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞.楼主可以注意以下操作:1.标本进行PBS 清洗时，以5 分钟清洗3 次为标准。2. PBS 清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4. TdT 酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5.快速进行脱水操作!

免疫组化是利用抗原与抗体间的特异结合原理和特殊的标记技术，对组织和细胞内的特定抗原、抗体进行定位、定性、定量的一们技术。我们都是先进行免疫组化，在DAB染色后进行HE染色。既能看到免疫组化的结果，又能看到细胞的形态，CD34+免疫组化染色后是棕色的颗粒，效果很好。 1）做免疫组化的片子最好不要同时做HE染色，因为那样会掩盖阳性着色的结果；而且用苏木素复染细胞核也是淡染，若要在免疫组化的片子上观察形态学的改变，除非有非常典型的表现，一般是有很大的难度的。 2）你是培养的细胞做免疫组化吗？如果是的话，那就每个样本只有一张片子吧？唯一的办法是进行免疫双染，同时做CD34和AFP（甲胎蛋白）。我觉得后者阳性便可以或多或少的获得向肝细胞分化的证据。 3）用HE染色来识别造血干细胞向肝细胞分化，也就是说要看到肝细胞的典型形态学改变后才可以下结论。问题是：早期的肝细胞仅凭形细胞态学观察并不能很容易的被识别。病理大夫看组织切片，重要的是看其组织学结构，对肝细胞也是这样。如果单拿出来一个细胞，还是培养的细胞，染色后真的不容易区分。所以我觉得你设计的用HE染色来确定早期细胞向哪个方向分化不是很有说服力。 4）如果是切片，也就是说每个样本可以有多张切片，那可以在连续切片上分别染CD34和AFP，拍照时选择相同视野，也有一定说服力。但是还是不如双染法更可靠。 5）用双染最大的问题在于：这两者都表达在胞浆中，染色容易相互覆盖。所以在双染的方法选择上你还要再考虑一下，可不可以用免疫荧光双染？这样也很有说服力的

希望你的问题更加详细；因为和不同类型的肿瘤细胞也有很大的关系。总体来说：Ki-67(+,<5%) ，表示肿瘤细胞的增生程度不是非常高；Syn(-)，提示不是神经内分泌或者神经元来源的成分；其它的，就要看是什么类型的组织细胞了希望对你有用

非特异染色，或者因核定位蛋白在胞质中的表达修饰阶段。

Ki67>20%是什么

区别如下：1、免疫组化染色是用一抗与被检测组织中目的蛋白抗原结合，然后HRP等标记的二抗与一抗进行结合，最后通过DAB显色反应，进而确认所要检测蛋白抗原的定位、半定量等目的。2、HE染色是用苏木素和伊红分别染上胞核和胞浆，可以区分出一般细胞的形态，在实际应用中可以鉴定组织细胞坏死、水肿、变性和炎性细胞浸润等异常病理学改变，在临床上是诊断恶性肿瘤和肿瘤的很好的方法。3、免疫组化染色和HE染色的不同之处可能是HE染色比较粗略地辨认不同细胞形态学改变；而后者能够针对特异性细胞标志物来检测特异性细胞的改变（数量）、也可检测细胞内细胞因子的转位（如active-caspase3和cleaved-caspase3的胞核和胞浆分布状态）、组织中一些特异性蛋白的表达的量改变（通过图像分析系统分析颜色深浅、分布的面积等综合分析）。

近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中，5%-10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面：⑴恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；⑵确定转移性恶性肿瘤的原发部位；⑶对某类肿瘤进行进一步的病理分型；⑷软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；⑸发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。⑹为临床提供治疗方案的选择。

免疫组化是化学显色 不是发光免疫荧光是通过抗体上标记的荧光基团发光

1、免疫组化是活检的一部分。活检确定具体分型比较困难，借助免疫组化染色可以极大提高准确率。2、应用免疫学基本原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。3、进一步的对病情作出准确的诊断。4、根据检查结果针对性治疗。扩展资料免疫组织化学的临床应用：1、恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断。2、确定转移性恶性肿瘤的原发部位。3、对某类肿瘤进行进一步的病理分型。4、软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的。5、发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。6、为临床提供治疗方案的选择。参考资料：百度百科-免疫组化

免疫组化是利用抗原抗体结合的原理的一种检测方法，常用于病理检查，帮助明确肿瘤的来源，鉴别肿瘤的类型等。

在确诊乳腺癌的检查中，对穿刺活检和手术活检取得的组织，都要做常规病理检查。免疫组化是对取下的人体组织做进一步的处理，进行特殊的染色，这对于明确是不是癌症、是什么类型的乳腺癌有很大的帮助。如果常规病理尚不能确定肿块的性质，则需要进行免疫组化染色，以进一步明确疾病的性质。

上面都是病理切片免疫组化染色的结果。结果显示组织中的上皮细胞阴性（ck-),淋巴细胞阳性（LCA+).这些染色只表明这些细胞的来源是淋巴，但不显示良恶性。所以正常的淋巴细胞浸润（喉咙里是有的）还是淋巴瘤都可以有这些表现，不能够通过这个区分的。

在病理诊断工作中，乳腺某些良恶性病变的鉴别往往给病理医生带来很大的困难，如某些腺病与癌的鉴别、导管/小叶增生和不典型增生与原位癌的鉴别、原位癌与浸润癌的鉴别、导管内乳头状瘤与高分化囊内乳头状癌的鉴别、盲管性腺病与小管癌的鉴别等。一般来说，几乎所有的乳腺良性增生性病变(除微腺性腺病外)都存有肌上皮细胞（myoepithelial cell, MEC）；而绝大多数乳腺恶性上皮病变(除腺肌上皮-肌上皮细胞癌、腺样囊性癌、化生性癌和某些分化差的浸润性导管癌等少数癌外)通常查不到MEC[1]。因此，MEC的存在与否常常是区分乳腺良恶性病变的重要依据之一。在正常乳腺组织的H-E切片上MEC往往容易识别，但许多良性增生性病变（如硬化性腺病）常引起乳腺终未小叶单位结构和细胞成分的改变，致使MEC难以辨认。而且，在H-E切片上MEC有时和某些上皮细胞（epithelial cell，EC）、肌纤维母细胞、血管平滑肌细胞、血管周细胞、梭形或胞浆透亮的肿瘤细胞、上皮样组织细胞很难鉴别[2,3]。 因此寻找MEC敏感、特异强的标记物显得尤为必要。 目前常用的MEC标记物主要有肌源性蛋白、S100蛋白（包括S100-α、S100-β）、CD10、P63、CK和GFAP等。本文仅就各标记物在识别MEC上的优缺点做一综述。 ⒈ 肌源性蛋白 肌源性蛋白抗体中，肌动蛋白（actin）、肌特异性肌动蛋白(muscle-specific actin,MSA)、α-平滑肌肌动蛋白 (α-smooth muscle actin,α-SMA)、 calponin、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain, SMMHC)等均在MEC的胞浆内表达。 1.1 actin、MSA和α-SMA 前两者为全肌肌动蛋白。这3种抗体是目前识别乳腺MEC最常用的抗体，均具有较高的敏感性和相对的特异性，乳腺EC和癌细胞通常不表达，但某些伴有肌上皮分化的癌(如化生性癌、低分化浸润性癌)常阳性。此外，他们也都可在血管平滑肌细胞及间质肌纤维母细胞中表达，而乳腺许多良恶性病变常伴有间质肌纤维母细胞和小血管的增生，这无疑为MEC的判定带来了困难[4-11]。。 1.2 calponin和SMMHC 这2种抗体是近年来应用于识别乳腺MEC的。Calponin是一种分子量为34KD的钙调节蛋白，具有结合原肌球蛋白和actin的功能，参与调节平滑肌细胞的收缩。SMMHC是分子量为200KD的多肽，是六聚肌球蛋白的结构成分。Dabbs 研究发现[12]，在乳腺良性病变的组织切片和针吸细胞涂片中，用免疫组织/细胞化学方法可检测到表达calponin和SMMHC的MEC，而间质细胞均为阴性；浸润性导管癌不表达calponin和SMMHC，但在少许区域中有calponin阳性的间质细胞；在导管原位癌中，calponin和SMMHC阳性的MEC沿癌细胞外周分布，其calponin阳性的MEC呈细线状，染色程度较正常乳腺小叶弱，而SMMHC在MEC的表达更弱，在显著扩张的导管周围缺少阳性细胞。Dabbs还在针吸细胞学观察中发现，大多数导管原位癌可见中等数量表达calponin的MEC细胞，因此认为在乳腺的针吸细胞学标本中，calponin和SMMHC二种抗体有助于乳腺浸润性导管癌和导管原位癌的鉴别，但某些导管原位癌的外周可缺乏MEC，因此calponin阴性不能作为诊断浸润性癌的依据。calponin和SMMHC仍然在血管平滑肌细胞上有表达，但肌纤维母细胞是否表达，意见尚不一致。多数人认为肌纤维母细胞一般不表达calponin和SMMHC，但有时可有极少数的肌纤维母细胞阳性[11]。和actin、MSA、α-SMA相比，calponin和SMMHC抗体有更高的敏感性和特异性，所以许多专家推荐用calponin和SMMHC抗体替代actin、MSA、α-SMA抗体，作为识别乳腺MEC的首选抗体。 ⒉ S100、S100-α和S100-β S100蛋白是一种酸性钙结合蛋白，是由α和β亚单位组成的二聚体，并因此被分成三种亚型：S100a0（α、α）、 S100a（α、β） 、S100b（β、β）。Egan等的免疫组化研究发现[13]：在乳腺纤维囊性病、硬化性腺病、乳头状瘤等良性病变中，MEC S100蛋白阳性，而EC、间质细胞和基底膜均为阴性。 在导管内癌和小叶原位癌中，肿瘤细胞和其周围残存的MEC均为S100蛋白阴性。故Egan认为S100蛋白有助于乳腺良性增生性病变和原位癌的鉴别。但Egan也发现在上皮增生病变中，不仅小导管周围的MEC S100蛋白阳性，增生的上皮细胞中也有散在的S100蛋白阳性细胞。。后来又有研究发现[14,15]：S100蛋白不仅表达于MEC和EC，大多数乳腺癌(包括乳腺原位癌)癌细胞也表达S100蛋白，所以S100蛋白作为MEC的标记物是不合适的。而且S100蛋白的免疫组化染色结果很不稳定，易受固定和免疫组化技术的影响。Egan和Smith发现用PAP法染色导管原位癌的MEC为S100阴性，而用免疫金银法时MEC则为S100阳性。这无疑为结果的判断带来了混乱。。 鉴于S100蛋白作为MEC标记物的局限性，有人试图利用S100蛋白的两个亚单位S100-α、S100-β来识别MEC。Ichihara研究发现[16]：在正常乳腺组织中，S100-α主要表达在EC，偶尔在MEC中也有表达。S100-β主要表达于MEC，少数EC也有表达。在乳腺良性上皮增生性病变中，增生的EC呈异质性，即增生的细胞为S100-α和/或S100-β阳性，而且S100-α和/或S100-β的阳性细胞与阴性细胞相间存在。导管原位癌的肿瘤细胞染色为同质性，均为S100-α阳性和S100-β阴性。Funahashi[17]在正常乳腺组织和乳腺良性病变中得到了类似的结果，在浸润性导管癌中，癌细胞只表达S100-α，不表达S100-β，认为S100-β作为MEC标记物比S100具有更高的特异性；但S100-β也低表达于少许EC和癌细胞，仍然需与actin连用才能特异的标记MEC。由于S100-α和S100-β在乳腺良性肿瘤中共同表达，而在乳腺癌的病例中只表达S100-α，故S100-α和S100-β抗体有助于乳腺良恶性疾病的鉴别. 3 CD10 CD10亦称普通急性淋巴母细胞性白血病抗原，主要用于恶性造血系统肿瘤的诊断。后来发现CD10也表达于非造血细胞，例如人的乳腺MEC，超微结构研究证实CD10主要表达于MEC的细胞膜[18]。Moritani[19]在石蜡切片上分别用CD10和SMA标记MEC，并将各自结果作了比较，发现CD10恒定表达于正常乳腺MEC的细胞膜上，在导管腺瘤、腺病、囊性腺体、导管增殖、纤维腺瘤和叶状肿瘤等良性病变中，MEC均为阳性，EC、血管平滑肌细胞和间质细胞为阴性；而在浸润性癌中，检测不到CD10阳性的MEC。因此CD10有助于腺病和浸润性导管癌、导管腺瘤和导管癌的鉴别。在伴有梗死的导管内乳头状瘤中，CD10能清楚地显示坏死区小导管的MEC，而SMA在该区域的染色很模糊。因此CD10和SMA相比能更清楚地显示梗死区域的MEC，有利于良恶性病变的鉴别。由于MEC和血管平滑肌细胞SMA均为阳性，所以在复杂的乳头状病变中，很难断定靠近EC的SMA阳性细胞是MEC还是血管平滑肌细胞；而MEC表达CD10，血管平滑肌细胞则为阴性，因此用CD10在复杂的乳头状病变中识别MEC优于SMA。在肿瘤细胞巢和间质之间，有时可发现一些间隙，在区分该间隙是人工间隙还是小血管常很困难。在浸润性导管癌中，由于不存在MEC，所以用SMA抗体有助于区分人工间隙和小血管。但在导管原位癌中，由于在某些癌细胞巢周围可查见MEC，因此SMA在此种情况下不能用于区分人工间隙和小血管。但SMA和CD10联合使用则可区分人工间隙和小血管。。尽管用CD10抗体识别MEC取得了较好的效果，但也有研究发现CD10表达于少许癌细胞和一些梭形间质细胞[18]。Moritani本人也发现CD10在正常乳腺组织的EC中有散在阳性[19]。 ⒋ P63 P63是P53基因家族的一个成员，表达于多种器官的基底细胞，如前列腺、皮肤和子宫颈等。P63蛋白的免疫组化染色主要定位于细胞核。在乳腺组织中，P63表达于MEC，EC不表达 [20]。Barareschi[2]研究也发现：在正常乳腺组织及乳腺良性病变组织中，P63只表达于MEC，在EC和肌纤维母细胞中皆无表达。在浸润性乳腺癌组织中，未见P63的表达。乳腺良性病变的细胞学涂片中，MEC呈“裸核”状， P63呈高表达；而浸润性癌的细胞学涂片中则无P63的表达。由于肌纤维母细胞不表达P63，所以P63抗体有助于肌纤维母细胞和MEC的鉴别。因抗P63为核阳性，所以在细胞学标本中，用P63标记MEC优于以上提到的胞浆和胞膜阳性的标记物。Werling在比较P63、calponin和SMMHC时发现[3]：P63敏感性低于后两者；但血管平滑肌细胞和间质肌纤维母细胞不表达P63，因此特异性高于后两者。P63抗体应用的局限性为：（1）少许肿瘤细胞可有表达；（2）由于P63为核阳性，而MEC在正常乳腺组织及良性乳腺病变组织中虽然是连续的，但MEC细胞核是分离的，因此P63在良性乳腺病变组织中不能显示连续的MEC，这虽然在大多数乳腺良恶性病变的诊断中不会造成困难，但在小管状硬化性腺病和小管癌鉴别时就会遇到困难。 ⒌ CK CK主要表达于上皮细胞中，根据分子量的不同将CK分为20种不同的类型。其中CK5、CK14和CK17都是基底细胞角蛋白，在乳腺组织中可表达于MEC的胞浆，因此三者的抗体都被用于识别MEC。其中CK14和CK17具有较高的敏感性，几乎表达于所有的乳腺MEC，CK5敏感性较前两者低。CK14和CK17也在极少许的EC中表达，CK5在部分EC中表达。在乳腺原位癌中，癌细胞不表达CK14和CK17；而9-31%的浸润性癌则有CK14和CK17表达；94%的浸润性癌CK5阳性[21,22]。 ⒍ GFAP GFAP是一种中间丝蛋白，主要存在于星形细胞内。免疫组化研究发现：在正常乳腺和乳腺的良性病变组织中，有部分MEC表达GFAP。乳腺原位癌中残存的MEC不表达GFAP。在乳腺原位癌和浸润性癌中，各种癌细胞均不表达GFAP。在乳腺的各种良性病变中，部分EC和间质的肌纤维母细胞可表达GFAP。但在乳腺癌的间质中，即使间质纤维化很严重，肌纤维母细胞也不表达GFAP，而表达SMA。综合以上结果可以发现：（1）GFAP的免疫组化染色有助于癌细胞与良性增生的EC和MEC的鉴别，而且在小管癌中有助于癌性小管（阴性）和良性增生性小管（阳性）的鉴别。（2）GFAP在乳腺病变中作为MEC的标记物的缺点是敏感性和特异性均较低，因为在正常乳腺组织中只有5-20%的MEC表达GFAP；导管上皮增生症中也只有20-30%的MEC有GFAP表达；在纤维腺瘤、叶状肿瘤和导管腺瘤中有表达GFAP的MEC在25-95%之间；在腺病中敏感性较高，有50-95%的MEC表达GFAP。GFAP也可表达于乳腺良性病变的EC和间质中的肌纤维母细胞，在乳腺良性病变中，10-25%的EC表达GFAP[23]。 总之，以上标记物在识别乳腺MEC时各有优缺点，每种抗体也都可以和某些非MEC出现阳性反应（见表1）。这些标记物中，敏感性较高的是actin/MSA、α-SMA、calponin、SMMHC、CD10、P63、CK14 /17；敏感性较低的是GFAP。特异性较高的是P63、SMMHC和calponin，其次是actin/MSA、α-SMA，最低的是S100、GFAP。敏感性和特异性均较高的标记物是P63，敏感性和特异性均较低的是S100及GFAP。在日常的病理诊断工作中，我们应该根据不同的病变选用合适的标记物，或同时采用二种或多种标记物搭配，才能更好的标记乳腺MEC。例如：MEC和EC鉴别时选用actin/MSA、α-SMA、calponin、SMMHC、CD10和P63较好，MEC和癌细胞鉴别时选用calponin和SMMHC较好。MEC与血管平滑肌细胞和间质肌纤维母细胞鉴别时选用P63、CK14/17、S100、S100-β较好。用双标记法能更好的标记MEC，例如：采用P63和actin/MSA、α-SMA、calponin或SMMHC共同标记同一细胞，如果该细胞双标记均为阳性即为MEC。相信随着科学技术的不断发展，能不断发现更敏感、更特异的MEC的标记物和/或标记方法，为乳腺良恶性病变的鉴别诊断提供更有力的手段。

师兄用的晶安生物的细胞爬片。晶安生物细胞爬片免疫组化法： 1 胰酶消化细胞，收集至离心管；调整样本细胞数为1×106 /ml； 2 将单细胞悬液滴加至平皿内无菌载玻片表面，置于37℃ 5%的加湿CO2孵箱中过夜，使细胞爬片。 3 吸弃平皿内培养上清，加入新鲜培养基，用无菌培养基洗3次； 4 PBS冲洗相应方案的载玻片3次； 5 将载玻片置于95%乙醇中固定约1h； 6 倒置相差显微镜下观察，并划定载玻片上细胞爬片密集区； 7 在相应区域滴加按一定比例稀释后一抗，4℃冰箱内过夜湿孵。阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。 8 先暂复温30min，后PBS冲洗载玻片3次； 9 滴加二抗，室温湿孵30min；后PBS冲洗载玻片3次； 10 DAB显色：将配置好的DAB溶液滴加至载玻片上，室温下孵育3min至载玻片略显黄色； 11 清水充分冲洗载玻片，苏木素复染核3-5min，清水冲洗，盐酸酒精分化20s，清水冲洗，氨水返蓝3min，清水冲洗，后置于75%-80%-95%-无水酒精中脱水，每步骤约2min； 12 将载玻片置于1、2、3道二甲苯中，各约15min，中性树脂封片，置于阴凉通风处风干。

主要用于病理诊断，协助判断疾病类型和严重程度。H.E的话主要观察大体病变，一般的组织学病变，而免疫组化可以检测某一种因子或者抗原抗体的表达，进行定位定量

(1)首先要确定免疫组化技术是否合格，合格的染色结果应该是背景颜色浅淡或无着色，而阳性标志物清晰和定位明确。(2)不仅要判断所检组织中有或无阳性标记物，还要注意阳性信号的分布部位和形态特征。一般说来，阳性信号应与被测抗原所在的部位一致。此处所说的部位包括组织和细胞的不同区域。(3)阴性染色结果是组织内预期特定区域中未见抗原表达，但阴性结果不能立即认为是否定意义。免疫组化的意义（1）恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断。（2）确定转移性恶性肿瘤的原发部位。（3）对某类肿瘤进行进一步的病理分型。（4）软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的。（5）发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。（6）为临床提供治疗方案的选择。

　　【中图分类号】R739．85 【文献标识码】A 【文章编号】1672－3783(2012)08－0296－01　　概述：当前，经过权威资料认证的免疫组化实验方法，已经对免疫组化的最基本问题做出了解答，并可以作为免疫组化技术中一种相对的标准。本文对免疫组化的操作步骤作出了一些具体的描述，提出了一些注意事项，并且对当前、今后的免疫组化自动化和标准化作出了评价和展望。 　　免疫组织化学在病理诊断中的作用已得到广泛的认同，具有特异性高、敏感性高、程序相对一致等特点，并已成为病理诊断中不可或缺的重要辅助技术。尽管免疫组化的理论比较简单，但方法与步骤却比较繁琐，在实际应用中还存在不少问题，直接或间接地影响了最终的病理诊断。要想达到可靠的实验结果，最重要的是将免疫组化技术的全部程序形成一种概念上的标准化。本文就免疫组化技术的标准化进行一些浅显地探讨。 　　1 标本的固定 　　为了使细胞和组织保持原有的形态结构，防止组织自溶和抗原性丢失，固定是关键。标本离体后要求在15分钟内用10%中性缓冲甲醛固定，在常温下时间为8-24小时，避免过度固定，固定时间过长，切片中容易产生甲醛色素颗粒，会影响结果观察以及抗原的破坏。固定组织的固定液为标本体积的5-10倍，脱钙液对抗原也有较强的破坏，所以浓度和脱钙时间不易太长。 　　2 防脱片的制备 　　目前通用的是Sigma多聚左旋赖氨酸（Poly-L-ly-sine）或硅化片，具有很理想的防脱片效果。 　　3 包埋与切片 　　用过高温度的石蜡包埋组织会破坏抗原，对于固定不太好的组织影响更大，包埋用的石蜡应选用低熔点的石蜡，切片的厚度在3-4微米，以利于观察，太厚的切片会影响染色结果和诊断。 　　4 烤片 　　切片在50-60℃的恒温箱里烤片2小时，至少1小时才不至于脱片，烤片时间过短易脱片，时间过长或温度过高会破坏抗原。 　　5 脱蜡 　　免疫组化的脱蜡应与常规HE脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，脱蜡不彻底会影响组化染色结果，切片脱蜡后进入梯度乙醇脱水至水化。 　　6 抗原修复 　　6.1 抗原修复是组化的关键技术 　　免疫组化染色中最关键的步骤可以说是抗原修复了，组化染色结果的表达与抗原修复直接相关。因组织被甲醛固定后蛋白质发生交联，抗原决定簇封闭，只有恢复抗原的免疫原性才能完成免疫化学反应。抗原修复方法有多种，主要是酶消化法与加热修复两种方法，现在由于加热抗原修复方法的广泛应用，酶消化法在免疫组化中的应用已很少。免疫组化的加热抗原修复方法包含微波法、水煮法、高压法，现在比较公认的修复效果是高压法大于水煮法，水煮法大于微波法。 　　6.2 抗原修复液的选择 　　抗原修复液有多种，有柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）、EDTA（PH8.0）、Tris（PH7-8）等，目前柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）可作为首选的常规使用的抗原修复液，它适合于大多数种类抗体，染色背景清晰。一般抗原难以表达的可以选择EDTA和Tris缓冲液，这两种修复液对一部分抗原修复效果较强，但染色背景较深。 　　6.3 抗原修复实例 　　在全国，有多家实验室对ER、PR进行了反复实验，得出的结论是强力推荐使用高压抗原修复方法。 　　我们单位在最近的免疫组化测评赛中，对参赛的5个待测抗原进行抗原修复，取得了比较满意的结果。根据我们得出的经验，检测CD10、CD30这两项抗原，我们推荐使用高温水煮修复，修复液为tris-EDTA(PH9.0)，检测ER、PR、CK这三项抗原，推荐使用压力锅，修复液为柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），各单位可根据实验室的具体条件和经验选用微波、水煮、高压修复以及抗原修复液。 　　6.4 高压抗原修复方法 　　组织切片经二甲苯脱蜡至水，浸泡于蒸馏水中待用，取一定量抗原修复液于压力锅中，修复液必须浸没整张切片，加热沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，放入已沸腾的修复液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气（整个时间约需4-5分钟），开始计时1-2分钟后，压力锅离开热源，室温冷却15分钟，取下气阀，打开锅盖，切片冷却至室温后，蒸馏水洗，PBS洗2min×3次。 　　7 生物素封闭 　　一般进行抗原修复处理的切片都需要进行内源性生物素封闭处理； 　　7.1 3%H2O2浸泡切片10min 　　在免疫组化染色中如果采用过氧化物酶检测系统，必须进行封闭处理，这样可以消除组织中的红细胞、粒细胞对染色结果的干扰。虽然3%的H2O2对抗原有轻微的损害，但封闭效果非常显著。 　　7.2 血清封闭 　　一般在加载一抗之前使用封闭血清（室温15-20分钟），可以减少非特异性显色。血清的种属一般与二抗的种属相同，一抗中若含正常血清则可以免去此步骤。 　　实验中通常用的冲洗缓冲液为PBS和TBS，加入Tween20可以加强冲洗效果，在组化染色中严格的冲洗可防止背景着色。 　　8 一抗孵育 　　加载一抗50-100ul，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时，如4℃过夜后需在37℃复温45分钟，PBS洗3次各2分钟。 　　9． 加一滴（50ul-100ul）检测试剂（二抗），室温或37℃放置30分钟， PBS洗三次，每次2分钟。 　　10. DAB显色5-10分钟 　　11. 苏木素复染、脱水、透明、封片。 　　衬染的步骤十分简单，但衬染的好坏对染色质量的影响很大，不易太深或太浅。首选的是Harris苏木素衬染，它在水中洗涤后可以呈鲜亮的兰色，与DAB染色对照效果很好，使用简单方便。 　　对于即用型抗体，厂商已进行多种实验条件的检测，可以直接使用，而浓缩性抗体，可按照供应厂商提供的稀释度进行预实验，一般在厂家提供的滴度前后各加一个滴度做预实验，抗体的最佳稀释度为在无背景染色的情况下获得最强阳性信号。 　　通用的检测系统是生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法，有SP、LSAB、ABC等方法，都是目前实验室广泛采用的检测方法，其方法简便易行且试剂稳定。SP三步法和Envision二步法高效经济，为国内免疫组化首选的检测系统。 　　显色系统通常采用的是辣根过氧化物酶系统，因此选择DAB（棕色）和AEC（红色）酶底物，常规组化显色首选的是DAB，它定位清晰，易于保存。 　　在免疫组化的质量控制中，最重要的是设立阳性和阴性对照，每批实验中最好有一张阳性对照和阴性对照，这样才能确保实验的可靠性，虽然很多医院病理科的工作量很大，但是不要怕麻烦，可以每月进行一次室间质控，以保证免疫组化染色结果的可靠性和准确性。 　　自动染色仪，它是一种各种试剂高度通用的仪器，可使用大多数免疫组化染色的抗体、检测系统和其他试剂，是当今最流行的开放式的自动染色仪。它利用电脑控制代替技术人员手工操作，大大地减少了手工操作出现的误差。自动染色仪能精确泵出每次滴加试剂的量，以及将每一步的染色时间精确到秒，空气压缩泵能均匀地吹掉切片上多余的液体，这一切彻底避免了免疫组化染色过程中人工操作的误差，染色仪将所有的染色步骤存储在电脑里，这些优点保证了染色结果的一致性，不同单位的实验室选择相同的试剂及染色过程就可以达到相同的染色结果。 　　近年来，随着免疫组化标准化的逐步实行，免疫组化自动染色仪将逐步进入病理科，技术人员将从烦琐的人工操作中解脱出来，会极大提高免疫组化的工作效率，同时也将免疫组化标准化推上了一个新的台阶。 　　为了尽快实行免疫组化标准化，还需具备以下条件：① 有丰富经验的病理医生② 有丰富经验的技术人员 ③ 可靠的标准化操作方法④ 合格稳定的免疫组化试剂⑤ 科学地设立对照实验⑥ 阳性和阴性的正确判定⑦ 诊断中抗体的联合应用⑧ 自动化的免疫组化染色。 　　同时，病理技师必须树立高度的责任心，技师的工作质量是免疫组化染色结果成功的关键，而免疫组化的标准化是质量控制的关键。虽然免疫组化的工作和质控工作比较烦琐，且工作量大，但对于一个病理科实验室来说，有序有效地实行这两项工作是至关重要的，它不仅提高了病理诊断的可靠性，也将进一步促进免疫组化工作持续健康的发展。

（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L.2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g.3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml.4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0，加水至1000ml.5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；b、油和TBS（或PBS）配制。8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1）抗原热修复（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。3、免疫组织化学染色SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗2～3次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；6）PBS洗2～3次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20.13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗10～15分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。SABC法1）脱蜡、水化。2）PBS洗两次各5分钟。3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。4）抗原修复。5）PBS洗5分钟。6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7）滴加Ⅰ抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。8）PBS洗三次每次2分钟。9）滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分钟。10）PBC洗3次每次2分钟。11）滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。12）PBS洗4次每次5分钟。13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15）脱水、透明、封片、镜检。

1、HE染色也叫苏木精-伊红染色法，是病理科切片染色技术中最常见的染色方法之一。HE染色法也是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。HE染色利用苏木素和伊红分别显示胞核和胞浆，可以区分出一般细胞的形态，在实际应用中可以鉴别组织、细胞的病理学改变，在临床病理工作中是诊断良恶性疾病的最基本的染色方法。 2、免疫组化染色。是根据抗原和抗体特异性结合的原理，通过化学反应，使标记抗体的显色剂显色，来确定组织细胞内抗原的定位、定性及相对定量，是临床病理诊断中常用的辅助病理诊断和分子分型、预后预测等重要的病理学染色技术。 3、PAS染色。又称过碘酸-雪夫染色，糖原染色。一般用来显示细胞内或细胞外的糖原和其他多糖物质。 4、巴氏染色。是脱落细胞染色中最好的染色方法。收起全部↑

Ki67，在很多肿瘤病理中做，它是判断肿瘤细胞增殖情况的一个指标，越高表示正在肿瘤细胞增殖多，恶性程度越高。P16，是一个抑癌基因，直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的基因，细胞内P16蛋白减少，会引起细胞周期调节紊乱，使细胞无限制增生，甚至癌变。

DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4 度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。百替生物专业帮助您代做免疫组化方面的实验，网址http://www.100biotech.com/index.php，来看看吧！

I、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。II、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。III、切片必须完整、均匀、平展、无邹折、应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，　不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引起混淆。IV、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。V、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此，对切片的质量要求很高，尤其是切片的附贴程度。以往有人主张切片在60℃以下烘烤30-60分钟即可按此进行结果是切片掉片严重，切片松动率占100%。切片究竟烘烤多长时间才合适，既不脱片和适合各项要求，又不至于破坏抗原。几组实验[]诊断P173认为，切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时最为合适。这是因为：抗原可耐受如此的温度，病理科一般使用的石蜡，其熔点在60℃左右，组织浸蜡时，浸蜡箱中的温度，一般都调在65℃左右，组织在这样温度中要浸泡2小时以上，才能达到彻底地浸蜡。组织中的抗原已经受了65℃的温度考验，保存下来的抗原，都已具有耐热性。另外，经上述时间烘烤出来的切片，附贴牢固，抗原保存好，染色成功率达100%，保证了病理诊断的及时性和准确性。特需要注意的是，不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片，烘烤后应尽快进行染色。如果切片切完后，迟迟不进行染色，存放于室温中或工作冰箱中，切片中的抗原将会随着时间的延长而逐渐消失，甚至出现假阴性。原则上是新鲜切片，即行染色，染多少张切多少张，这样才能尽可能的保存表达更多的抗原。VI、切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果。蜡不溶于水，不与其它的临床使用的抗体相融合。它只能靠特用的试剂，处理足够的时间，才能将其除去。如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起许多弊病，如染色不均匀，阳性物时隐时现，真假难辨，背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短。较受使用者的青睐。脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜程度采用不同脱蜡时间。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定脱蜡的时间，原则上是要彻底，干净，完全地脱去切片上的蜡。为了做到这一步，切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要求。比如：当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果也会更好。VII、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。在各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶，尤其在红细胞，中性粒细胞，单核细胞嗜酸性细胞，出血的组织坏死的组织等等。含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制，它们将会在DAB底物的显色时，与HRP一样催化底样，使之显色，使之生成与阳性物一样的黄棕色，造成混乱。为止，在免疫组化染色前，都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。当然，对它们进行彻底的消除是不行的，因为抑制太厉害，对抗原也会有相同的抑制作用。氢在抑制内源性过氧化物酶时，也要注意对抗原的保护，抑制也只能针对它们中的大部分，在DAB显色后，显示出淡黄色，这就足以与真正阳性物区别。抑制剂常用的是0.3%的H2O2，也可将其称为1%H2O2，因为市售的H2O2的浓度为30%，按其净含量则为0.3%，如果按其溶液的用量则为1%。关于H2O2的使用，有的使用是单纯的H2O2稀释溶，有的使用是H2O2甲醇混合物。根据实验，认为H2O2甲醇较适合于大多数的情况，因为除了H2O2外，甲醇对各种酶，都有钝化的作用，因此H2O2甲醇的双重作用效果较好。陈尚平等认为在多数情况中，用甲醇H2O2已经获得令人满意的结果。VIII、须适当合理地使用封闭试剂为了减少背景产生的非特异性染色，在免疫组化染色的过程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色，陈尚季等认为：抗体是高度的电荷分子，可能与带有相应电荷的组织成分无特异性地结合（如胶原）。由于这种非特异性结合，将导致标记的部分局部化（轭合物）和胶原的假阳性染色。要用一种不相干的抗体居先处理，可能减少和标记的抗体无特异性结合。以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，马血清，山羊血清，绵羊血清，兔血清，浓度也有很多种，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.必须选择合适的抗体以及对作适当的保存和配制。VVI、选择合适的抗体至今为止，应用于临床的常用抗体有几十种，在这当中又可分为两种类型。

MLH1(+)、MSH2(+)PMS2(+)、MSH6(+)，即微卫星稳定型大肠癌，提示适合于含氟尿嘧啶类药物的化疗方案，并且分化差是高危因素之一。免疫组化和特殊染色是病理检查中常用的检测方法，免疫组化全称是免疫组织化学染色，病理检查中最常用的是HE染色，使用非HE染色的检测方法都可以称为特殊染色。都是病理检查中对送检组织进行的处理方法，组织经过一系列的处理之后才能在显微镜下观察其有无病变，病变是什么等。扩展资料：免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。参考资料来源：百度百科-免疫组化

MLH1(+)、MSH2(+)PMS2(+)、MSH6(+)，即微卫星稳定型大肠癌，提示适合于含氟尿嘧啶类药物的化疗方案，并且分化差是高危因素之一。免疫组化和特殊染色是病理检查中常用的检测方法，免疫组化全称是免疫组织化学染色，病理检查中最常用的是HE染色，使用非HE染色的检测方法都可以称为特殊染色。都是病理检查中对送检组织进行的处理方法，组织经过一系列的处理之后才能在显微镜下观察其有无病变，病变是什么等。扩展资料：免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。参考资料来源：百度百科-免疫组化

MLH1(+)、MSH2(+)PMS2(+)、MSH6(+)，即微卫星稳定型大肠癌，提示适合于含氟尿嘧啶类药物的化疗方案，并且分化差是高危因素之一。免疫组化和特殊染色是病理检查中常用的检测方法，免疫组化全称是免疫组织化学染色，病理检查中最常用的是HE染色，使用非HE染色的检测方法都可以称为特殊染色。都是病理检查中对送检组织进行的处理方法，组织经过一系列的处理之后才能在显微镜下观察其有无病变，病变是什么等。扩展资料：免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。参考资料来源：百度百科-免疫组化

软组织肿瘤类型很多，由于普通病理切片还不能确定是哪种类型的肿瘤，因此通过一些特异性表达某种肿瘤的抗体进行标记，有望获得明确的病理诊断，所以要借助于免疫组化及特殊染色。经过上述技术，明确诊断后才能分析是否良恶性。如果做病理后医生要求做免疫组化，则一般可能有两个可能，第一，目前无法确认是否属于癌症，需要进一步明确；第二，已经知道属于癌症，但是癌症细胞的来源、类型还需要进一步的明确以知道后面的治疗。免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

免疫组化染色是一种检查方法，是可以辨别疾病预后情况的，现在的情况如果是是免疫组化预后良好，一般是不会恶变的，只要是积极治疗就可以的

MLH1(+)、MSH2(+)PMS2(+)、MSH6(+)，即微卫星稳定型大肠癌，提示适合于含氟尿嘧啶类药物的化疗方案，并且分化差是高危因素之一。这些检查结果为阳性，可以见于胃癌，结肠癌等疾病，具体需根据伴随症状分析，如果是有胃痛，胃胀，打嗝，反酸，可以见于胃癌，需做个胃镜检查，如果是左下腹部疼痛，腹胀，排便困难，可以见于结肠癌。需去医院就诊，来明确诊断，如果是有胃癌或结肠癌，需尽早使用手术切除治疗，然后使用些化疗药物，中医中药治疗。

多重免疫酶标记染色以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。在光镜下可以同时观察和对比，样品保存时间相对较长，一次曝光即可成像，故较双重免疫荧光染色法更为常用。常用标记酶与底物的配伍单酶双底物--HRP--DAB (棕色):4CN(蓝色)AEC(红色):4CN(蓝色)AP-萘酚AS-MX-坚固红(fast red 红色)-坚固蓝(fast blue 蓝色)双酶双底物--HRP (DAB ) :AP(萘酚AS.MX-坚固蓝)HRP(4CN):AP(萘酚AS.MX-坚固红)（直接法、间接法、桥法均可使用，灵敏度以桥法中的复合物法最高，特异性则以直接法最佳）

免疫组化是利用抗原与抗体间的特异结合原理和特殊的标记技术，对组织和细胞内的特定抗原、抗体进行定位、定性、定量的一们技术。我们都是先进行免疫组化，在DAB染色后进行HE染色。既能看到免疫组化的结果，又能看到细胞的形态，CD34+免疫组化染色后是棕色的颗粒，效果很好。 1）做免疫组化的片子最好不要同时做HE染色，因为那样会掩盖阳性着色的结果；而且用苏木素复染细胞核也是淡染，若要在免疫组化的片子上观察形态学的改变，除非有非常典型的表现，一般是有很大的难度的。 2）你是培养的细胞做免疫组化吗？如果是的话，那就每个样本只有一张片子吧？唯一的办法是进行免疫双染，同时做CD34和AFP（甲胎蛋白）。我觉得后者阳性便可以或多或少的获得向肝细胞分化的证据。 3）用HE染色来识别造血干细胞向肝细胞分化，也就是说要看到肝细胞的典型形态学改变后才可以下结论。问题是：早期的肝细胞仅凭形细胞态学观察并不能很容易的被识别。病理大夫看组织切片，重要的是看其组织学结构，对肝细胞也是这样。如果单拿出来一个细胞，还是培养的细胞，染色后真的不容易区分。所以我觉得你设计的用HE染色来确定早期细胞向哪个方向分化不是很有说服力。 4）如果是切片，也就是说每个样本可以有多张切片，那可以在连续切片上分别染CD34和AFP，拍照时选择相同视野，也有一定说服力。但是还是不如双染法更可靠。 5）用双染最大的问题在于：这两者都表达在胞浆中，染色容易相互覆盖。所以在双染的方法选择上你还要再考虑一下，可不可以用免疫荧光双染？这样也很有说服力的

CKpen阳性，提示为上皮性肿瘤；ki67中等阳性，提示肿瘤细胞增殖较活跃，恶性程度较高，预后较差；

20%。根据查询免疫染色通透液配方，500毫升免疫染色通透液含有曲拉通200毫升，为20%。曲拉通成分为聚氧乙烯-8-辛基苯基醚，又称为聚乙二醇对异辛基苯基醚。

MLH1(+)、MSH2(+)PMS2(+)、MSH6(+)，即微卫星稳定型大肠癌，提示适合于含氟尿嘧啶类药物的化疗方案，并且分化差是高危因素之一。免疫组化和特殊染色是病理检查中常用的检测方法，免疫组化全称是免疫组织化学染色，病理检查中最常用的是HE染色，使用非HE染色的检测方法都可以称为特殊染色。都是病理检查中对送检组织进行的处理方法，组织经过一系列的处理之后才能在显微镜下观察其有无病变，病变是什么等。扩展资料：免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。参考资料来源：百度百科-免疫组化

不合理！

免疫组化操作步骤一 免疫组化（ LP 法）操作步骤 ： 1． 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行 2. 缓冲液洗 3min/2 次。 3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。 4. 缓冲液洗 5min/2 次。 5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。 （注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。） 6. 缓冲液洗 5min/2 次。 7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定） 8. 缓冲液洗 5min/2 次。 9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。 10 ．缓冲液洗 5min/2 次。 11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。 （注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。） 12 ．缓冲液洗 5min/2 次。 13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。（具体时间由染色深浅决定。） 14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。 二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤 ： （ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。 （ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。 （ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。 （ 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 （ 6 ）、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。 （ 7 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 （ 8 ）、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。 （ 9 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 （ 10 ）、显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ） （ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。 三. 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片 4-8um ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。以下同石蜡切片免疫组化

低度恶性 意思转移慢 容易治疗

可做NF、NSE、S－100、Syn。NF：神经细丝（neurofilaments, NF）分布于神经纤维

【释义】：是广谱上皮标记，是上皮来源。免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究。【分类】：免疫荧光细胞化学技术。免疫酶细胞化学技术。免疫胶体金技术。动物体内外的所有游离面上被覆着的细胞层。构成它的组织称为上皮组织，其细胞称为上皮细胞。原则上在上皮内见不到血管，并且几乎没有非细胞部分（细胞间隙部分）。具有借基底膜与结缔组织相邻接等特征。