如何分别从细胞浆和细胞核中抽提RNA

rna提取的流程和方法如下：1、异硫氰酸胍氯化铯超速离心法。原理：使用蛋白质变性剂异硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，经过起始密度为1.78g/ml的氯化铯介质，进行密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清中。使用这种方法，不但能得到高质量的RNA，而且能同时分离出细胞染色体DNA.本法对于冷冻时间长、细胞质和细胞核不易分离的组织标本以及富含RNA酶的组织细胞（如胰腺）的RNA提取尤其适合。此法提取的RNA的质量好和成功率高，已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。其缺点是操作复杂、流程长，一次提取的样品数量有限。2、盐酸胍-有机溶剂法。本法有MacDonald 1987年在Strohman报道的方法基础上改进而成的，适用于没有超速离心及设备的情况下提取细胞总RNA。它利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA，提取的RNA质量较好，但整个操作过程繁杂费时。3、氯化锂-尿素法。本法首先由Auffray报道，利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，3mol/L LiCl选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染，LiCl沉淀RNA会丢失一些小分子量的RNA，如5S RNA等。优点是快速简捷，尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取，其质量可以满足Northern分析，Oligo（dT）提取mRNA，SI核酸酶或RNase保护实验等。本法每提取107个细胞能提取总RNA约10?g。4、热酚法。本法主要用于少量细胞样品RNA提取，其产量不高，但简单易行。5、快速提取法。本法主要用于培养细胞，通过0.5%SDS裂解细胞，酚抽提去除蛋白质和DNA沉淀，快速纯化RNA。6、细胞质RNA提取法。本法主要适用于培养细胞，首先去除细胞核，然后用蛋白酶K消化蛋白质，酚/氯仿抽提去除蛋白质。操作简单，同时能进行多个样品操作，多数步骤在室温下进行，提取的RNA质量较高，可满足体外无细胞翻译系统、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保护实验。本法提取的RNA产量一般为30～500?g/107个细胞。7、酚-氯化锂法同时提取细胞RNA和DNA。本法是在Elion和Warner报道的方法基础上，有Sandeep等人于1990年改进而成。它通过酚和SDS裂解细胞，变性，解聚蛋白，抑制RNase，并用EDTA保护DNA，最后根据RNA和DNA在Li+中的不同沉淀速度，而分离DNA和RNA。整个过程在2小时内完成。RNA可用于Northern分析，DNA可用于内切酶消化以及Southern杂交实验。8、一步快速热酚抽提法。基于Shomczynki和Sacchi两人于1987年报道的RNA快速提取法，美国Promega公司有机地将这些试剂组合成总RNA试剂盒，使操作更为简单方便，并突出体现以下几个优点：1）将已知最强的RNase抑制剂异硫氰酸胍、b-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，增强了对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离进入溶液，提高了RNA的提取产量；2）RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩，对大量或少量组织的细胞RNA提取，均甚合适；3）可在3小时以内处理大量样品，省略了氯化铯密度梯度超速离心步骤及其它方法使用的长时间选择性乙醇沉淀或LiCl沉淀。LiCl沉淀不但会导致小RNA（<5.8S）的丢失，而且Li+盐的残留还会抑制DNA的合成反应。

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实验一：细胞中总RNA的提取及鉴定 一、目的： 掌握Trizol提取总RNA的原理和步骤，学习电泳鉴定总RNA的方法。 二、原理： RNA是核酸，具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。 常用的试剂为Trizol，该试剂可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，同时使RNA酶变性失活，保护RNA的完整性。Trizol的主要成分为异硫氰酸胍、酚和B-巯基乙醇，异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。提取中加入氯仿，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层，上层为水相，PH 5.1左右，只有RNA分子留在水相，DNA分子沉淀在酚与溶液的界面。加入异丙醇，主要沉淀大分子rRNA和mRNA。最后加入乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，去除杂质。 判断RNA 的质量主要有两个标准，一是完整性（是否被降解），二是纯度。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现28S、18S和5S rRNA对应的条带，如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。 三、步骤：

实验步骤：1. 提取组织RNA时，每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解：提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5~106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在试问15~30℃下放置5分钟；3. 在上述EP管中，按照每1mlTrizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15~30℃）放置2~3分钟后，12000g（2~8℃）离心15分钟；4. 去上层水相置于新EP管中，按照每1mlTrizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15~30℃）放置10分钟后，12000g（2~8℃）离心10分钟；5. 弃上清，按照每1ml Trizol加1ml75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2~8℃）离心5分钟，弃上清；6. 让沉淀的RNA在室温在自然干燥；7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀各试剂的作用：1、 TRIZOL主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。TRIZOL是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。※0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。※异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。2、 氯仿为有机溶剂与水互不相溶，RNA（核糖核“酸”的盐型）是离子化合物，溶于水相3、异丙醇能与与任意比例的水混合，因此加入异丙醇，能够夺取RNA/DNA周围的水分，RNA/DNA能够聚集而发生沉淀。

真菌菌丝的总RNA的提取RNA提取缓冲液（CTAB）：2%CTAB（W/V），2%聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100mMTris-HCl（pH8.0,DEPC处理的水配置），25mMEDTA,0.5g/L亚精胺Spermidine，2.0MNaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC处理的水配制即可。SSTE：1MNaCl，0.5%SDS（W/V），10mMTris-HClpH8.0，1.0mMEDTA10MLiCl直接用蒸馏水配10MLiCl，加1‰的DEPC过夜后，高温灭菌。3MNaAc氯仿:异戊醇（24:1）酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）DEPC处理水用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜，高温灭菌无水乙醇70%酒精1.实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热，离心管中加入ME（巯基乙醇）（10mL加80ul，50mL中加入300ul）。2.取约0.8g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了），在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液，颠倒混匀。3.65℃水浴3-10min，期间混匀2-3次4.加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提（10,000rpm，4℃，5min）5.取上清，等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提（10,000rpm，4℃，5min）6.加入1/4V体积10MLiCl溶液，4℃放置6hr以上(或过夜)7.10,000rpm，4℃离心20min8.弃上清，用500ulSSTE溶解沉淀9.酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次,氯仿:异戊醇（24:1）抽提1次（10,000rpm，4℃，5min）10.加2V体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上11.12,000rpm，4℃离心20min12.弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥13.加200ul的DEPC处理水溶解14.用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量（在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数）注意：提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。

分子克隆技术（华农） 实验一 质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。 实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。 实验原理：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 实验步骤： 1. 取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养； 2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜培养； 3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净； 4. 加入300 ml溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； （剧烈） 5. 加入300 ml溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟； 6. 加入300 ml溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；（温和） 7. 12000 g离心10分钟； 8. 吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟； 9. 12000 g 常温离心15分钟； 10. 倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）； 11. 室温放置或超净台上风干DNA； 12. 加40 ml灭菌超纯水或TE溶解； 13. 质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。 附注：质粒检测 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA

提rna步骤：1、样本前处理。2、室温静置5分钟，让RNA可以充分释放。3、按 1 mL Trizol 加入 200 μL 氯仿，盖好管盖。用手剧烈震荡 15秒，室温放置 3分钟。4、12000 g、4℃离心 15分钟。5、小心转移上清液（约500 μL）至新的 1.5 mL 无酶离心管中。6、加入等体积异丙醇，室温静置10分钟。7、12000 g、4℃离心 10分钟；弃掉上清，保留沉淀。8、加入 1 mL 75％乙醇，涡旋或颠倒混匀。9、7500 g、4℃离心 5分钟；弃掉上清。10、7500 g、4℃离心 30秒；用10 ul 小枪头尽量吸掉残留的液体。11、室温静置5~10分钟，晾干乙醇。12、加入适量RNase-free水溶解RNA，室温静置10分钟；令RNA可以充分溶解。13、分装少量RNA，剩余RNA冻存到-80℃冰箱备用。

病毒RNA提取分不同样本，也分做什么实验，一般来说是血清血浆样本的话，大部分实验都需要1ml的样本，Qiagen、BIOG提取方法都可以，因为病毒RNA量少不易提取，所以得率不会太高，但是不影响后续PCR检测。

小麦总RNA的提取实验目的从黄化小麦苗中提取总RNA，可以为cDNA文库的构建做好准备。我们重点是要保证RNA的完整性、产率、防止修饰和纯度，尤其是完整性、防止修饰和纯度。RNA是单链，2"OH是它的化学性质远比DNA活泼。所以，提取RNA颇为不易。加之RNA的不均一性，要将所有的RNA（rRNA、tRNA、mRNA）完全提出，更加有挑战性。而Rnase是无处不在的（这种酶遇高温后也不会丧失活性，复性容易，在胞内外都有分布，不需激活，不需要二价金属离子的配合）；RNA还最怕DNA污染，因为若做RT-PCR，DNA的存在会降低产物的纯度和效率所有以上的因素都构成了我们成功提取RNA的障碍。但是我们可以不用考虑RNA的机械剪切，因为RNA通常较小，一般不会受到机械剪切的影响。实验原理及过程实验步骤实验原理1所有容器高温灭菌两次，DEPC高温灭菌，所有的试剂用DEPC配制，高温灭菌。去除RNA酶（外源）的影响。高温灭菌两次可以破坏RNA酶的复性过程.虽然RNA酶极易复性，但两次连续的高温会打乱它的复性历程，从而使RNA酶失活。DEPC是RNA酶的非竞争性抑制剂。DEPC可以与RNA酶的活性中心的组氨酸咪脞环上的N结合，从而使RNA酶失活。因为DEPC能与RNA的N结合，从而修饰RNA，所以，必须将DEPC最终除去。在高温灭菌时，DEPC因高温分解而挥发。（UV也能修饰RNA，实验时应避免。）DEPC灭菌后称为DEPC水，它是不含DEPC的。实验过程中要勤换手套，必要时要在超净工作台中进行。2在一灭菌2mL管中加入:5mol/L异硫氰酸胍0.7mL苯酚0.4mL2mol/LNaAc(pH4.0)0.1mL必须提前准备好变性剂。异硫氰酸胍可以变性RNA酶，也可以破细胞。本试验不可以用酶法破细胞。因为蛋白酶K的适合的条件也可以是RNA酶有活性。NaAc酸性可以使DNA在有机相（酚相）中，而在碱性条件下，DNA和RNA都在水相中，无法分离，所以，Ph在本是严重很关键。苯酚用于抽提DNA和蛋白质。3称取0.2g小麦黄化苗的叶片，迅速在液氮中研磨成粉末,转入已准备好的离心管中。剧烈震荡。低温防止内源性RNA酶降解RNA。剧烈震荡是使所有的细胞散开，浸在变性剂中。低温的细胞在相对来说高温的液体中是会形成一团，这样就会使内部的RNA没有水解RNA的机会。小麦的黄化苗因为没有光合作用，所以含糖少，易于抽提。4混匀,冰浴30min。54℃,12000rpm,10min。6上清至另一离心管中加0.4Ml氯仿，剧烈震荡。冰浴放置5min。去脂类。740C,12000rpm,10min。8弃有机相（下层）加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室温放置5min。去脂类和蛋白质。940C,12000rpm,10min弃有机相，加入等体积异丙醇。-200C放置1h。去糖，脱水。因为体系高盐（2mol/LNaAc），所以可以使RNA沉淀。1040C,12000rpm,10min沉淀用70%乙醇洗两次。因为提出的量很少，可能不可见，所以离心是要有方向标记。11室温稍干燥。RNA是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因为有太多的糖的残余。12沉淀加20uLDEPC水溶解(-200C保存)DEPC水中不含RNA酶。13RNA电泳：1％琼脂糖胶20mL8μL样品1μL样品缓冲液1μLSYBR100V恒压电泳测OD260和OD260／OD280

Trizol作用原理：在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。扩展资料RNA和DNA一样，也是由各种核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接构成的多核苷酸链，但与DNA有一系列差异。1、在化学组成方面，RNA含核糖而不含脱氧核糖。含尿嘧啶而不含胸腺密啶。例外的是，每个tNA分子含有一个胸腺嘧啶，这是在RNA链合成后由尿嘧啶甲基化生的，此外，前面已提到，少数DNA含有少量核糖，但这些个别的例外并不能以此否定两类核酸组成上的差异。2、RNA一级结构的概念虽与DNA相同.但其基本结构单位是核糖核苷酸而不是脱氧核糖核苷酸。此外，部分RNA5′端或3′端有特殊的核苷酸序列，而且RNA一级结构中没有DNA那样复杂的顺序组织。3、绝大多数RNA为单链分子，单链可自身折迭形成发夹（hairpin）样结构而有局部双螺旋结构的特征，这是各种RAN空间结构的共同特征。RNA局部双螺旋结构中碱基互补配对规律是A对U和G对C。由于RNA分子内部不能全面形成碱基配对，故其碱基克分子比A不等于U，G不等于C，不存在DNA碱基比例的 Chargaff规律。

TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚／SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质．TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol试剂可用于小量样品（50-100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。预防RNase污染注意事项：1． 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2． 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交*污染。3． RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。4． 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v,放置过夜,高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。注意事项：1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底B．RNA沉淀未完全溶解A260/A280<1.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高B．样品匀浆时加的试剂量太少C．匀浆样品时未在室温放置5分钟D．吸取水相时混入了有机相E．RNA沉淀未完全溶解。RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃C.细胞在用胰酶处理时过度D.溶液或离心管未经RNase去除处理E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。DNA的分离准备试剂：乙醇 0.1M柠檬酸钠(含10%乙醇) 75%乙醇 8mM NaOH操作步骤:1. 样品加氯仿分层后,移去上层水相,用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml TRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2-8℃不超过2000×g离心5分钟。2. 移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。每用1ml TRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2-8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5-2 ml 75%乙醇,室温放置10-20分钟(不时颠倒混合)2-8℃2000×g离心5分钟, 弃上清。4. 室温放置晾干DNA 5-15分钟，用8mM NaOH溶解DNA。从50-70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300-600μl 8mM NaOH，DNA的浓度通常为0.2-0.3μg/μl 。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE，HEPES调节pH。从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。DNA的定量：取一份溶于8mM NaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人，大鼠，小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg , 6.5μg , 5.8μg 。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3-4μg 骨骼肌，脑组织，胎盘2-3μg 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5-7μg 成纤维细胞5-7μg应用：1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4,取0.1-1μg DNA用作模板。2.酶切反应 用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3-5单位的酶，80-90%的DNA是可消化的。1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节Final pH 0.1M HEPES(μl) Final pH 1M HEPES(μl)8.4 86 7.2 238.2 93 7.0 328.0 1017.8 1177.5 159注意事项：1. DNA在中间层和有机相中时可在2-8℃保存过夜。2．DNA沉淀在75%乙醇中2-8℃可保存几个月。3．DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7-8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃长期保存。

BIOG产品特点 ◎操作简便快速，可在半小时内完成血液 RNA 提取； ◎最大限度地去除了血红素、细胞碎片等杂质污染，提取的 RNA 纯度高，A260/A280 为 1.8-2.0； ◎RNA 提取得率高，可在 2mL 的全血中提取 50μg 以上基 因组 RNA； ◎不含苯酚和氯仿等有毒溶剂，安全无毒。 操作步骤 1. 请自行准备：无水乙醇、无 RNA 酶的 15mL 离心管。 2. 取出洗涤液，按以下操作： 洗涤液：10mL 加入 24mL 无水乙醇，混匀；20mL 加入 48mL 无水乙醇，混匀。 3. 取 15mL 无 RNA 酶离心管（自备）1 支，加入 2mL 裂解液，再加入 2mL 已经解冻或新鲜的血液，（冷藏血液需先轻振混匀后再加入）， 轻轻颠倒混匀 8 次，再加入 200μL 消化液及 100 μL 溶液 A，充分温和振荡混匀，56℃水浴 10 分钟。 如是凝血块，可取相当于 2mL 血液量的 5x5x5mm 大小的凝血块放入 15mL 无 RNA 酶离心管，用枪头反复敲打挤压至 1x1x1mm 以内大小，再加入 2mL 裂解液，震荡 混匀 1 分钟，56℃水浴 20 分钟。 注意：提取血液量建议在 1mL-3mL，裂解液随血液量增减。如提取血凝块，请尽量打碎后再加裂解液并适当延长消化时间。 4. 取出离心管，室温放置 2 分钟。加入 3mL 无水乙醇（自备），轻轻颠倒混匀 8 次，如有半透明悬浮物，不影响 RNA 的提取与后续实验。 5. 将吸附柱放入收集管内，将 3625 μL 上述溶液转入吸附柱内，静置 2 分钟，5,000 rpm 离心 2 分钟，弃收集管内废液。 6. 将吸附柱放入收集管内，将剩余 3625 μL 上述溶液转入吸附柱内，重复步骤 5。 7. 将吸附柱放回收集管内，加 3mL 洗涤液至吸附柱内，静置 2 分钟，5,000 rpm 离心 1 分钟，弃收集管内废液。 8. 将吸附柱放回收集管内，5,000 rpm 离心 2 分钟，离去残留的洗涤液。 9. 取出吸附柱，放入新的 15 mL 无 RNA 酶收集管内，加入 300 μL 洗脱液，静置 3 分钟，5,000 rpm 4℃ 离心 3 分钟，收集 RNA 溶液。 提取得到的 RNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。 注意事项： 1. 洗涤液含有刺激性化学物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛，请立即用清水或生 理盐水冲洗，必要时请就医。2. 裂解液如有白色絮状物析出属正常现象，置于 37℃水浴中溶解即可。

RNA提取步骤及注意事项（仅供参考）：实验步骤如下：1.取50—100mg的组织,加入1ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol先放于冰上)。2.将匀浆室温放置5min。3.加入200μl氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3min。4.12000rpm，4℃离心15min。5.将上清液小心转移到新的1.5ml离心管中（取400μl），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15min。（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。）6.12000rpm，4℃离心15min。7.小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。8.用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的）9.8000rpm，室温离心10min。10.尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。11.真空离心干燥3—5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。12.沉淀用30μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68℃处理10min。13.RNA检测(1)测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/ml RNA计算RNA的产量。OD260/OD280在1.8-2.0。(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。注意事项：1.获得RNA效率低有一下原因a:样品裂解或匀浆处理不彻底b:最后得到地RNA沉淀未完全溶解2.A260/A280＜1.65原因a:检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低PH条件下，A280值会较高b:样品匀浆时加地试剂量太少c:匀浆后样品未在室温放置2分钟d:水相中混有有机相e:最后得到地RNA沉淀未完全溶解3.RNA降解原因a:组织取出后没有马上处理或冷冻b:样品或提取地RNA沉淀保存于-5--20度，未在-60--70度保存c:细胞在胰酶处理时被破坏d:溶液或离心管未经RBase去处理

离心柱法提取rna原理如下。1、离心柱法提取rna原理是含有目的RNA的细胞破碎液通过该柱时，硅胶模对RNA的吸附2、使RNA与其他成分分开，在低盐浓度下可从硅胶模上直接洗脱。

提RNA 加TRIZOL 室温静置5分钟 再加氯仿4°离心15分钟 去上层澄清相 再加异丙醇 -20放置30分钟 然后4°离心10分钟 倒掉液体 加酒精4°离心5分钟 然后倒掉酒精 晾干 加DEPC水溶解

Trizol作用原理：在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。扩展资料RNA和DNA一样，也是由各种核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接构成的多核苷酸链，但与DNA有一系列差异。1、在化学组成方面，RNA含核糖而不含脱氧核糖。含尿嘧啶而不含胸腺密啶。例外的是，每个tNA分子含有一个胸腺嘧啶，这是在RNA链合成后由尿嘧啶甲基化生的，此外，前面已提到，少数DNA含有少量核糖，但这些个别的例外并不能以此否定两类核酸组成上的差异。2、RNA一级结构的概念虽与DNA相同.但其基本结构单位是核糖核苷酸而不是脱氧核糖核苷酸。此外，部分RNA5′端或3′端有特殊的核苷酸序列，而且RNA一级结构中没有DNA那样复杂的顺序组织。3、绝大多数RNA为单链分子，单链可自身折迭形成发夹（hairpin）样结构而有局部双螺旋结构的特征，这是各种RAN空间结构的共同特征。RNA局部双螺旋结构中碱基互补配对规律是A对U和G对C。由于RNA分子内部不能全面形成碱基配对，故其碱基克分子比A不等于U，G不等于C，不存在DNA碱基比例的 Chargaff规律。

我的实验是从血清中提取microRNA, 用过biog的，结果还可以。

细胞中的rna主要有三类：rrna约占80％－85％，trna和核内小分子rna约占10%-15%，mrna约占1%-5%，由于rrna占绝大多数，因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rrna，它也有三种类型：28s，18s，5s。所以我们看到的也应该是三条带，而且28s的亮度为18s的两倍。这样的rna才可以用来建库。在rna的提取时，一定要注意rnase的污染，因rna极易被rnase的降解，操作时应尽量少说话，并在洁净的环境中操作，主要防止手、唾液和空气中rnase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%depc溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无rnase,，可以不经处理直接用于提取rna，实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有rnase污染，使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品），另外，由于材料不同，机体内含有的糖、酚类物质不一样，因此材料不同用的方法也应该不一样。下面是两种提取方法，第一种适用于嫩组织或动物组织的总rna的提取，第二种适用于老组织的提取。试剂：提取缓冲液，kac(5m),异丙醇，无水乙醇，depc水仪器：离心机，恒温水浴锅，研钵方法一动物、植物（嫩叶）的总rna分离大约2克植物组织或动物组织用液氮研磨↓加5mltrizol裂解液↓12000rpm，4度，10分钟↓加入1ml氯仿↓剧烈振荡15秒，室温温育2-3分钟↓室温离心10分钟，8000rpm↓取上清，加入等体积的异丙醇，15-30度放置10分钟。↓12000g离心10分钟↓弃上清，加入10ml75%洒精洗沉淀。↓2-8度下，不超过7500g离心5分钟↓弃上清，干燥沉淀10分钟↓用depc水溶。方法二、植物老叶、老根或多糖含量高的材料的总rna分离1g组织液氮研磨，加入6ml提取缓冲液↓2min振荡↓65℃，20min↓加入1.5mlkac↓混匀，冰浴20min↓8000rpm,4℃,15min取上清，加入0.6倍异丙醇，-20℃，1小时（或室温15-20min）↓12000rpm,4℃,15min↓75%乙醇，12000rpm,20℃,5min↓晾干，溶60uldepc水，15min↓12000rpm,4℃,5min,上清即为rna。

在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNA PCR得到我们需要的基因呢？因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。1．RNA的提取RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。1．1 分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果。另外，分离poly(A)+RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+RNA会增加检测的灵敏度。1．2 RNA提取的最大影响因素-RNA酶在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，RNA酶催化的反应一般不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。1．3 常用的RNA酶抑制剂*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。*异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。*氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。*其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。1．4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作*尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。*操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入各种容器内或污染用具。尽量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free处，扩大污染。*尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如滤纸、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H、T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。*关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNase污染，买来后可直接用于RNA操作。用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNase，从而导致实验失败。*所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。*无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNase的活性。*配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。*有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。*配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。1．5 RNA提取的一般步骤RNA提取的一般步骤是：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。分离RNA一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。融解RNA一般使用TE。保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。TRIZOL是有毒物，接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤，一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。TRIZOL在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，建议保存在2-8°C的环境下。2．RT-PCRRT-PCR是指将逆转录(Reverse Transcription；RT)反应和PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。2．1 RT-PCR的原理RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。2．2 RT-PCR的步骤⑴在冰浴离心管里面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去离子水5uL，混匀，离心3-5秒；⑵70度水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；⑶加入5×反应液4uL，RNase抑制剂1uL，dNTP 2uL（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀；⑷37度水浴5分钟，加入1uL AMV-RT反转录酶，混匀；⑸37度水浴1小时（此步是反转录过程）；⑹70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70度保存。2．3 RT-PCR的引物设计RT-PCR引物设计和一般PCR引物设计可以遵循同样的原则。细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。设计理想的引物都有以下共同的特点，而设计失败的引物则各有各的缺点：* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。* 选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。* 设计5"端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。* 避免引物对3"末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。* 避免3"末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。* 避免3"末端的错误配对。3"端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5"端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。2．4 引物退火温度引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm 5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。2．5 提高逆转录保温温度较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。2．6 促进逆转录的添加剂包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4％，这不足以抑制PCR。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶：逆转录酶催化RNA转化成cDNA，不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。RNaseH-的MMLV逆转录酶及RNaseH-的AMV，比MMLV和AMV能得到更多量和更多全长。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。RNaseH-的逆转录酶可以显著提高长RT-PCR产物的产量，同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。2．7 RNaseH处理在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。2．8 小量RNA检测方法的提高当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250μg/ml。2．9 一步法同两步法RT-PCR的比较两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。2．10 增加RT-PCR特异性第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5"末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3"端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3"最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。2．11 提高逆转录保温温度为了充分利用GSP特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个GSP退火温度为55℃，那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性的37℃进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而某些特别的逆转录酶可以在50℃或更高进行反应，这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。为获得最大的特异性，可以将RNA/引物混合物直接从65℃变性温度转移到逆转录保温温度。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度转换。2．12 减少基因组DNA污染RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。

1 细胞总RNA的提取 1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时,取出无菌室,去其上清,用PBS洗两次后,每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司） 1 ml,摇匀,无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠,细胞脱壁）. 2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中,加新开的氯仿0.2 ml,轻摇15秒. 3）、室温静置2-3分钟后,12000 rpm,15 min,4℃,离心.然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过）,加0.5 ml新开的异丙醇,室温下静置10分钟. 4）、12000 rpm,10分钟,4℃,离心.观察总RNA在管底的白色沉淀,弃去上清（小心别丢了沉淀）,75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后,7500 rpm,5 min,4℃离心. 5）、去上清,点离,用小Tip吸干液体.气干沉淀5-10分钟,DEPC处理水20-30 ul加入,中枪打匀,55-60℃水浴10分钟溶解总RNA,测OD值. 6）、电泳. 2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022,QIAGEN） 1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中,用无RNase的水定容到250 ul. 2）、加入Buffer OBB 250 ul,Oligotex Suspension 15 ul.用Tip打匀或用手弹匀. 3）、70℃水浴,3分钟（裂解RNA的二级结构）. 4）、20-30℃条件下,静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）. 5）、高速离心2分钟,小心吸走上清（该上清要保留）,留下约50 ul的上清在原管里. 6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀,然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速离心1分钟. 7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加Buffer OW2 400 ul到柱子,高速离心1分钟,丢掉滤过液. 8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加20-100 ul热的（70℃）Buffer OEB到柱子上,用Tip来回吸打3-4次,高速离心1分钟. 9）、为保证最大的 mRNA产量,可再次重复第8步. 10）、电泳. RNA提取的原理就是核酸在异丙醇中的溶解度很低!其他步骤都是防止RNA降解和使RNA从细胞中溶出. 逆转录过程请看参考资料.

酵母rna的提取及组分鉴定实验报告如下：一、实验目的。1、掌握稀碱法提取酵母RNA勺原理和方法。2、掌握紫外线（UV吸收法测定核酸浓度的原理）。3、熟悉紫外分光光度计勺使用方法。二、实验原理。核酸是生命的最基本物质之一，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内。对核酸的研究是更深入研究生命体的基本前提之一。研究核酸需要纯度很高的核酸，所以核酸的提取方法也就在生物学研究中相当重要。本次实验提取酵母的核糖核酸(RNAo RNA,离体后稳定性很差，含量低，所以在提取的时候就要注意防止核酸的降解和变性，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止 RNA酶的作用。本实验是医药卫生领域与大工业生产的基础方法。核酸（RNA都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、碱基和磷酸以等分子比例构成的，故测定组成核苷酸的任意一种组分即可以测定生物体内核酸的含量或者是提取出来的核酸的含量。提取RNA勺方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者是利用碱使细菌细胞壁溶解，是RNA释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透胞壁溶解，是RNA释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。使用浓盐法提取RNA勺时候应该注意掌握温度，直接至90~100C浸提，避免在20~70C的时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。这两种方法是从废弃的啤酒酵母中提取RNA勺一般方法。但是这两种方法各有利弊，如浓盐法提取的RNA屯度高，而稀碱法提取的时间短，提取率高，更利于工业化生产。RNA 在260nm处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可以用紫外分光光度计通过比色来测定RNA含量。由于蛋白质在280nm波长处也有光吸收，对RNAM定有一定的干扰作用，但蛋白质的最大吸收峰在280nm 处，如同时测定280nm的光吸收，通过计算可消除其对 RNA测定的影响。因此如其中含有蛋白质时必须同时测定280nm和260nm 的吸光度，可通过计算测定溶液中 RNA的含量。三、实验器材。电子天平、离心机、量筒、烧杯、锥形瓶、紫外分光光度计、容量瓶（100mL、移液管（5ml)、试管和试管架、PH 1-14试纸。以上内容参考：百度百科-rna

大多数真核细胞mRNA的3"端通常具有由20-30个腺苷酸组成的polyA尾巴，寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（OligoT）可以与之配对结合，这就是提取mRNA最基本的原理。具体到实验手段上，现在磁珠法、纤维素柱层析法都有在用。磁珠法一般是用生物素标记OligoT，亲和素标记磁珠（生物素和亲和素间具有高度亲和力）。实验时生物素标记的OligoT与mRNA的polyA高效杂交形成复合体，此复合体又与标有亲和素的磁珠结合。用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来。最后用无RNase去离子水将mRNA从复合物中洗脱下来即可。寡聚dT纤维素柱层析法的大致流程：总RNA流经寡聚dT纤维素柱时，在高盐缓冲液中，带polyA尾的mRNA被特异地结合在柱上。降低盐浓度，mRNA被洗脱。一般过两次柱后，就可得到较高纯度的mRNA。当然有些mRNA没有polyA尾巴，这种就比较难办了，我最近的实验就是在对付这种东西。如果你是拿mRNA做RT-PCR，其实一般是不必分离mRNA的，设计好引物就可以用总RNA做了。

细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。RNA 提取流程1. 样品处理从各种不同来源样品（如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织和培养细胞）,或同一来源样品的不同组织（如植物幼嫩叶片、成熟根、茎等）中提取高质量的RNA，因细胞结构及所含的成分不同，样品预处理的方式也各有差异。样品的要求：最好使用新鲜的样品或取样后立即在低温（-20℃或-70℃）冷冻保存的样品，避免反复冻融，因为这会导致提取的RNA降解和提取量下降。样品预处理方式：植物材料-液氮研磨动物材料-匀浆、液氮研磨细菌-溶菌酶破壁酵母-液氮研磨、玻璃珠处理、混合酶破壁2. 细胞裂解异硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）这是一种传统的RNA提取方法，适用于大部分动植物材料，但对于次生代谢产物较多的植物材料提取RNA效果较差。异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将RNA释放到溶液中，采用酸性酚-氯仿混合液抽提，低PH值的酚将使RNA进入水相，而蛋白质和DNA仍留在有机相，从而可以完成RNA的提取工作。该法应用非常广泛，适用于包括动物组织、微生物、培养细胞等在内的各类动物性材料，同时还适用于次生代谢物较少的植物性材料，如幼苗、幼叶等。该法主要应用在动物组织和培养细胞的RNA提取中。胍盐/ β- 巯基乙醇法：适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。在这种方法中，胍盐使细胞充分裂解，β-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程中可以抑制RNaseA的活性，保护RNA不被降解。我公司的“GREEN ”系列总RNA 提取试剂盒是基于这种方法开发的产品，分别适用于各类不同的材料。此系列产品的具体实验步骤和适用范围在实验技术手册中有详细介绍，实验者可根据自己的需要进行选择。其它方法：有些植物材料多糖多酚含量较高，如植物果实，番茄的叶子等，有些植物木质化程度较高，如根茎等组织。针对这类材料本公司推出了一种全新的植物总RNA提取试剂，该试剂特别适合于从富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取纯度高、完整性好的总RNA，有关的具体步骤将在分论中详细介绍，实验者可根据自己的需要进行选择。3. RNA 纯化及获得纯化要求RNA样品中不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除DNA分子的污染。纯化方法及沉淀方法一：有机溶剂抽提法氯仿抽提在使用RNA提取试剂进行RNA提取时，常使用氯仿进行抽提，以去除蔗糖、蛋白等杂质，并促进水相与有机相的分离，从而达到纯化RNA的方法。在本公司的提取RNA的产品中，与TRIzol同型试剂法及其衍生试剂盒。沉淀氯仿抽提RNA后，一般采用了异丙醇或乙醇来沉淀水相RNA。加入0.6倍水相体积的异丙醇或与水相等体积的异丙醇，室温沉淀20-30分钟，高速离心，可获得RNA沉淀。洗涤沉淀 加入无RNase的75%乙醇，将RNA沉淀振荡悬浮，使RNA沉淀中的盐离子被充分溶解。然后再离心10-30分钟。再次沉淀RNA。离心后，小心倒掉上清（注意不要倒出RNA沉淀），随后快速离心1-2秒，将残留在管壁上的乙醇手机到管底后，用小枪头吸净，超静台中风干1-2分钟（注意不要晾得太干，否则RNA沉淀不易溶解）。溶解沉淀加入适量RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。方法二：硅基质吸附法随着实验方法的改进，现已发展出一种采用吸附材料纯化核酸的方法。目前较常见的有：硅基质吸附材料、阴离子交换树脂和磁珠等。硅基质吸附材料因其具有可特异吸附核酸，使用方便、快捷、不使用有毒溶剂如苯酚、氯仿等优点，成为核酸纯化的首选。本公司生产的总RNA提取试剂盒（ZP403-ZP407）和GREENspin系列总RNA提取试剂盒即采用硅基质吸附达到RNA分离纯化目的，通过专一结合RNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，使样品在高盐条件下与硅胶膜特异结合，而蛋白、有机溶剂等杂质不能结合到膜上而被洗脱，盐类则被含有乙醇的漂洗液洗涤，最后用RNase-free ddH2O将RNA从硅胶膜上洗脱下来。

【答案】：成功提取mRNA，最关键的问题是抑制RNA酶活性。因为mRNA呈单链状，容易受到核酸酶的攻击。异硫氰酸胍法(TriZol)原理：TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA，有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。[考点]总RNA中分离mRNA的原理。细胞中的总RNA包括mRNA、rRNA、tRNA以及一些小RNA(sRNA)。完整RNA的提取，是进行RNA方面的研究工作的前提。所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即(1)样品细胞或组织的有效破碎；(2)有效地使核蛋白复合体变性；(3)对内源RNA酶的有效抑制；(4)有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；(5)对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法(TriZol)。

1、盐析法：DAN与蛋白质结合形成的核蛋白溶于高盐溶液，但不溶于低盐溶液；而RNA形成的核蛋白易溶于低盐溶液，因此可用高盐溶液从细胞破碎液中提取DNA核蛋白，还可以除去RNA.。 2、凝胶电泳法 3、跑琼脂糖胶，RNA跑得快些，割胶可以得到。 4、利用DNA和RNA在PH不同的苯酚中溶解度不一样：DNA溶解于碱性酚，而RNA溶于酸性酚，从而分离。

可以。因为提取原理是用氯仿萃取rna，而rna不溶于酒精，但氯仿和酒精胡溶。可行的办法是用大量的氯仿萃取，减少酒精的干扰，最后再用异丙醇沉淀。

1．提取称取鲜酵母 159或干酵母粉 2.5g，倒入 100ml三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取lh。2．分离将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r／min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。3．沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内，并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却．待冷至10℃以下时，用6mol／L HCI 小心地调节pH值至2.0～2.5（注意严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。 4．洗涤和抽滤 上述悬浮液以 4000r／min离心 10min，得到 RNA沉淀。将沉淀物放在 10ml小烧杯内，用95％的乙醇 5～10ml充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95％乙醇5～10ml淋洗 3次。5．干燥从布氏漏斗上取下沉淀物，放在6cm表面皿上，铺成薄层，置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重，存放于干燥器内。

植物提取物的提取方法目前提取植物提取物常用的方法有溶剂提取法、超声波提取法、微波提取法和酶提取法，而超临界流体萃取法、微波辅助提取法等则作为新的提取技术被广泛使用。溶剂提取法溶剂提取法是用溶剂从固体原料中提取有效成分，所用的溶剂必须具备与所提取的溶质互溶的特性。将植物材料粉碎后，放入适合的容器内，加入数倍量溶剂，可采用浸渍、渗漉、煎煮、回流和连续提取法进行提取。巴科的丹参提取物就是用溶剂提取法提取的，精油类物质就是用溶剂提取法。在溶剂提取法的提取工艺过程中，溶剂的浓度、料液比、提取温度、提取的时间会直接影响有效成分的提取率。Cristina Juan等人通过溶剂萃取法提取大米中的赭曲霉素A，用荧光探测法和液相色谱法确定OTA的含量，研究表明在最适宜的料液比、提取温度和提取时间的情况下，提取物OTA含量最高为4.17ng/g。Monte D. Holt等采用溶剂萃取法从生的和熟的小麦种提取烷基间苯二酚，实验表明采用溶剂萃取法能够节约提取时间。超声波提取法超声波提取是利用超声波产生的强烈振动和空化效应加速植物细胞内物质的释放、扩散并溶解进入溶剂中，同时可以保持被提取物质的结构和生物活性不发生变化。超声波提取原理主要为物理过程，是近年来逐渐受到重视的一个较新的提取方法。对多数成分来说，超声波提取方法较常规的溶剂提取能大幅地缩短提取时问，消耗溶剂少，浸出率高，因此具有较高的提取效率。在超声波法提取工艺过程中，溶剂的选择和浓度、料液比、提取温度、提取的时间会直接影响提取率。Ling Zhou等人利用超声波提取法提取五味子，主要研究了超声提取率的影响因素，实验研究得出，提取率随着温度的升高而升高，随着功率的增大而增大。Hong Van Le等利用超声波提取樱桃中的维生素E和酚类化合物，主要比较了超声提取法和酶提取法在提取时间、提取率上的差异，实验结果表明超声波提取法时间上比酶提取缩短了6倍，超声波提取的提取率是酶提取的2～3倍。钟爱国等利用超声波萃取鲜竹叶中叶绿素的方法，用分光光度计来定量测定所萃取的叶绿素的含量。结果表明：与常用的有机溶剂提取法相比，超声波萃取法不仅萃取率高、速度快、效率高，而且是室温提取，无需加热，节约能源。

可以用试剂盒，总RNA提取的试剂盒和RT-PCR试剂盒，或者如果只需要单链cDNA也可以买相应的，看你的需要了，宝生物就有卖。至于过程，简单的说，先要弄清你所需的蛋白在什么阶段才有表达，就选这一时期的细胞或组织来提总RNA，反转录的时候是利用mRNA的polyA来设计引物合成单链cDNA，然后再根据你的基因设计特异引物来得到双链的cDNA.提RNA的过程中要防止RNA酶污染，这个可以在网站或试剂盒说明书上查到该如何操作。

厚百提供：1、在提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。2、将组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；在EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟。3、取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟。4、按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。Ps:在收集到生物材料之后，最好马上进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

一、BIOG特点 1、操作简便快速，可在 30 分钟内获得理想的 RNA，适用于一次处理较多样本的批量提取； 2、提取 RNA 纯度高，无抑制剂，A260/A280 为 1.8-2.0； 3、采用自主研发的改性硅基磁珠，同样的样本量提取的 RNA 更多； 4、可用于小量（200μL）血清、血浆、胸腹水、脑脊液、滑膜液、水样等液体样本中游离 RNA 的提取； 二、 microRNA 血清/ 血浆 BIOG操作步骤 1. 请自行准备：无水乙醇、异丙醇、1.5mL 去 RNA 酶离心管。 2. 取出洗涤液，按 70%比例加入无水乙醇，如 6mL 加入 14 mL 无水乙醇，12mL 加入 28 mL 无水乙醇，混匀。 3. 取 1.5mL 去 RNA 酶离心管，加入 200μL 裂解液、20μL 消化液、4μL Carrier，再加入 200μL 样本，振荡混匀，58℃温育 10 分钟。 4. 取出离心管，冷却到室温，加入 300μL 异丙醇，充分混匀，再加入 20μL 磁珠复合液（每次使用前须充分混匀），振荡混匀 3min（注意不 要颠倒混匀，以防磁珠粘附于管盖内壁），静置 2min。 5. 将离心管置于磁力架上放置约 20s 至磁珠完全吸附，开盖，彻底吸弃上清液（注意枪头不要接触磁珠）。 6. 加入 800μL 配制后的洗涤液，将离心管从磁力架上取下，充分振荡 2min，确保磁珠完全分散。将离心管置于磁力架上放置约 20s 至磁珠 完全吸附，开盖，吸弃上清液（注意枪头不要接触磁珠）。 7. 将离心管从磁力架上取下，开盖，干燥约 3-5min，至无明显乙醇气味。 8. 加入 50 μL 洗脱液，振荡至磁珠充分散开，室温静置 2min，振荡混匀 2min。 9. 将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，小心吸取上清液至一新的 1.5mL 去 RNA 酶离心管中，提取的核酸可直接用于下游实验，或 -70℃保存备用。 三、注意事项： 1. 为防 RNA 酶污染，实验过程中最好戴一次性干净手套、口罩，使用处理过的无 RNA 酶的容器和无 RNA 酶的超纯水。提取的 RNA 溶液 可适当加入 RNA 保护因子（货号：51090，一般 50μLRNA 溶液加入 2μL）。 2. 2.裂解液含有刺激性化学物质，操作过程请做好防护措施，避免直接接触皮肤，防止吸入口鼻，洗涤液在使用前应加入乙醇后充分混匀。

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理:在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。扩展资料与DNA不同，RNA一般为单链长分子，不形成双螺旋结构，但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能。RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。参考资料来源：百度百科-RNA

1.trizol法提取rna原理：在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。 2.加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。 3.RNA存在于水相中。 4.水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。 5.移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。 6.Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。 7.目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。 8.RNA的碱基配对规则基本和DNA相同，不过除了A-U、G-C配对外，G-U也可以配对。 9.在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类，即tRNA（转运RNA），rRNA（核糖体RNA），mRNA（信使RNA）。 10.mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录。 11.tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者。 12.rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。

这篇文章主要讲的是几种常用的RNA提取方法。 1、异硫氰酸胍氯化铯超速离心法 原理：使用蛋白质变性剂异硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，经过起始密度为1.78g/ml的氯化铯介质，进行密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清中。使用这种方法，不但能得到高质量的RNA，而且能同时分离出细胞染色体DNA. 本法对于冷冻时间长、细胞质和细胞核不易分离的组织标本以及富含RNA酶的组织细胞（如胰腺）的RNA提取尤其适合。此法提取的RNA的质量好和成功率高，已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。其缺点是操作复杂、流程长，一次提取的样品数量有限。 2、盐酸胍-有机溶剂法 本法有MacDonald 1987年在Strohman报道的方法基础上改进而成的，适用于没有超速离心及设备的情况下提取细胞总RNA。它利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA，提取的RNA质量较好，但整个操作过程繁杂费时。 3、氯化锂-尿素法 本法首先由Auffray报道，利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，3mol/L LiCl选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染，LiCl沉淀RNA会丢失一些小分子量的RNA，如5S RNA等。优点是快速简捷，尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取，其质量可以满足Northern分析，Oligo（dT）提取mRNA，SI核酸酶或RNase保护实验等。本法每提取107个细胞能提取总RNA约10?g。 4、热酚法 本法主要用于少量细胞样品RNA提取，其产量不高，但简单易行。 5、快速提取法 本法主要用于培养细胞，通过0.5%SDS裂解细胞，酚抽提去除蛋白质和DNA沉淀，快速纯化RNA。 6、细胞质RNA提取法 本法主要适用于培养细胞，首先去除细胞核，然后用蛋白酶K消化蛋白质，酚/氯仿抽提去除蛋白质。操作简单，同时能进行多个样品操作，多数步骤在室温下进行，提取的RNA质量较高，可满足体外无细胞翻译系统、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保护实验。本法提取的RNA产量一般为30～500?g/107个细胞。 7、酚-氯化锂法同时提取细胞RNA和DNA 本法是在Elion和Warner报道的方法基础上，有Sandeep等人于1990年改进而成。它通过酚和SDS裂解细胞，变性，解聚蛋白，抑制RNase，并用EDTA保护DNA，最后根据RNA和DNA在Li+中的不同沉淀速度，而分离DNA和RNA。整个过程在2小时内完成。RNA可用于Northern分析，DNA可用于内切酶消化以及Southern杂交实验。 8、一步快速热酚抽提法 基于Shomczynki和Sacchi两人于1987年报道的RNA快速提取法，美国Promega公司有机地将这些试剂组合成总RNA试剂盒，使操作更为简单方便，并突出体现以下几个优点：1）将已知最强的RNase抑制剂异硫氰酸胍、b-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，增强了对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离进入溶液，提高了RNA的提取产量；2）RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩，对大量或少量组织的细胞RNA提取，均甚合适；3）可在3小时以内处理大量样品，省略了氯化铯密度梯度超速离心步骤及其它方法使用的长时间选择性乙醇沉淀或LiCl沉淀。LiCl沉淀不但会导致小RNA（<5.8S）的丢失，而且Li+盐的残留还会抑制DNA的合成反应。

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理:在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

DNA不是单独存在于细胞中的，是染色体蛋白质是有机物没错，但是它是复杂的有机物，有亲水基，疏水基，所以不是只要是有机物就溶于有机溶剂的分层看的是密度，不是分子量的大小

DNA，RNA不就是核酸？前者也叫脱氧核酸

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理:在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。扩展资料:抽提RNA的使用目的RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。因此，明确实验目的是进行后续实验的首要条件。参考资料来源:百度百科-RNA

小麦总RNA的提取实验目的 从黄化小麦苗中提取总RNA，可以为cDNA文库的构建做好准备。我们重点是要保证RNA的完整性、产率、防止修饰和纯度，尤其是完整性、防止修饰和纯度。RNA是单链，2"OH是它的化学性质远比DNA活泼。所以，提取RNA颇为不易。加之RNA的不均一性，要将所有的RNA（rRNA、tRNA、mRNA）完全提出，更加有挑战性。而Rnase是无处不在的（这种酶遇高温后也不会丧失活性，复性容易，在胞内外都有分布，不需激活，不需要二价金属离子的配合）； RNA还最怕DNA污染，因为若做RT-PCR，DNA的存在会降低产物的纯度和效率所有以上的因素都构成了我们成功提取RNA的障碍。但是我们可以不用考虑RNA的机械剪切，因为RNA通常较小，一般不会受到机械剪切的影响。实验原理及过程 实验步骤 实验原理 1 所有容器高温灭菌两次，DEPC高温灭菌，所有的试剂用DEPC配制，高温灭菌。 去除RNA酶（外源）的影响。 高温灭菌两次可以破坏RNA酶的复性过程.虽然RNA酶极易复性，但两次连续的高温会打乱它的复性历程，从而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非竞争性抑制剂。DEPC可以与RNA酶的活性中心的组氨酸咪脞环上的N结合，从而使RNA酶失活。 因为DEPC能与RNA的N结合，从而修饰RNA，所以，必须将DEPC最终除去。在高温灭菌时，DEPC因高温分解而挥发。（UV也能修饰RNA，实验时应避免。） DEPC灭菌后称为DEPC水，它是不含DEPC的。 实验过程中要勤换手套，必要时要在超净工作台中进行。 2 在一灭菌2mL管中加入: 5mol/L异硫氰酸胍 0.7mL 苯酚 0.4mL 2mol/L NaAc(pH4.0) 0.1mL 必须提前准备好变性剂。 异硫氰酸胍可以变性RNA酶，也可以破细胞。本试验不可以用酶法破细胞。因为蛋白酶K的适合的条件也可以是RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有机相（酚相）中，而在碱性条件下，DNA和RNA都在水相中，无法分离，所以，Ph在本是严重很关键。 苯酚用于抽提DNA和蛋白质。 3 称取0.2g小麦黄化苗的叶片，迅速在液氮中研磨成粉末,转入已准备好的离心管中。 剧烈震荡。 低温防止内源性RNA酶降解RNA。 剧烈震荡是使所有的细胞散开，浸在变性剂中。低温的细胞在相对来说高温的液体中是会形成一团，这样就会使内部的RNA没有水解RNA的机会。 小麦的黄化苗因为没有光合作用，所以含糖少，易于抽提。 4 混匀,冰浴30min。 5 4℃,12000rpm,10min。 6 上清至另一离心管中 加0.4Ml氯仿，剧烈震荡。冰浴放置5min。 去脂类。 7 40C,12000rpm,10min。 8 弃有机相（下层） 加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室温放置5min。 去脂类和蛋白质。 9 40C,12000rpm,10min 弃有机相，加入等体积异丙醇。-200C放置1h。 去糖，脱水。因为体系高盐（2mol/L NaAc），所以可以使RNA沉淀。 10 40C,12000rpm,10min 沉淀用70%乙醇洗两次。 因为提出的量很少，可能不可见，所以离心是要有方向标记。 11 室温稍干燥。 RNA是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因为有太多的糖的残余。 12 沉淀加20uLDEPC水溶解(-200C保存) DEPC水中不含RNA酶。 13 RNA电泳： 1％琼脂糖胶20 mL 8μL样品 1μL样品缓冲液 1μLSYBR 100V恒压电泳 测OD260和OD260／OD280

小麦总RNA的提取实验目的 从黄化小麦苗中提取总RNA，可以为cDNA文库的构建做好准备。我们重点是要保证RNA的完整性、产率、防止修饰和纯度，尤其是完整性、防止修饰和纯度。RNA是单链，2"OH是它的化学性质远比DNA活泼。所以，提取RNA颇为不易。加之RNA的不均一性，要将所有的RNA（rRNA、tRNA、mRNA）完全提出，更加有挑战性。而Rnase是无处不在的（这种酶遇高温后也不会丧失活性，复性容易，在胞内外都有分布，不需激活，不需要二价金属离子的配合）； RNA还最怕DNA污染，因为若做RT-PCR，DNA的存在会降低产物的纯度和效率所有以上的因素都构成了我们成功提取RNA的障碍。但是我们可以不用考虑RNA的机械剪切，因为RNA通常较小，一般不会受到机械剪切的影响。实验原理及过程 实验步骤 实验原理 1 所有容器高温灭菌两次，DEPC高温灭菌，所有的试剂用DEPC配制，高温灭菌。 去除RNA酶（外源）的影响。 高温灭菌两次可以破坏RNA酶的复性过程.虽然RNA酶极易复性，但两次连续的高温会打乱它的复性历程，从而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非竞争性抑制剂。DEPC可以与RNA酶的活性中心的组氨酸咪脞环上的N结合，从而使RNA酶失活。 因为DEPC能与RNA的N结合，从而修饰RNA，所以，必须将DEPC最终除去。在高温灭菌时，DEPC因高温分解而挥发。（UV也能修饰RNA，实验时应避免。） DEPC灭菌后称为DEPC水，它是不含DEPC的。 实验过程中要勤换手套，必要时要在超净工作台中进行。 2 在一灭菌2mL管中加入: 5mol/L异硫氰酸胍 0.7mL 苯酚 0.4mL 2mol/L NaAc(pH4.0) 0.1mL 必须提前准备好变性剂。 异硫氰酸胍可以变性RNA酶，也可以破细胞。本试验不可以用酶法破细胞。因为蛋白酶K的适合的条件也可以是RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有机相（酚相）中，而在碱性条件下，DNA和RNA都在水相中，无法分离，所以，Ph在本是严重很关键。 苯酚用于抽提DNA和蛋白质。 3 称取0.2g小麦黄化苗的叶片，迅速在液氮中研磨成粉末,转入已准备好的离心管中。 剧烈震荡。 低温防止内源性RNA酶降解RNA。 剧烈震荡是使所有的细胞散开，浸在变性剂中。低温的细胞在相对来说高温的液体中是会形成一团，这样就会使内部的RNA没有水解RNA的机会。 小麦的黄化苗因为没有光合作用，所以含糖少，易于抽提。 4 混匀,冰浴30min。 5 4℃,12000rpm,10min。 6 上清至另一离心管中 加0.4Ml氯仿，剧烈震荡。冰浴放置5min。 去脂类。 7 40C,12000rpm,10min。 8 弃有机相（下层） 加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室温放置5min。 去脂类和蛋白质。 9 40C,12000rpm,10min 弃有机相，加入等体积异丙醇。-200C放置1h。 去糖，脱水。因为体系高盐（2mol/L NaAc），所以可以使RNA沉淀。 10 40C,12000rpm,10min 沉淀用70%乙醇洗两次。 因为提出的量很少，可能不可见，所以离心是要有方向标记。 11 室温稍干燥。 RNA是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因为有太多的糖的残余。 12 沉淀加20uLDEPC水溶解(-200C保存) DEPC水中不含RNA酶。 13 RNA电泳： 1％琼脂糖胶20 mL 8μL样品 1μL样品缓冲液 1μLSYBR 100V恒压电泳 测OD260和OD260／OD280

Trizol,CTAB,SDS,异硫氰酸胍法等等Tizol在一般的物种都挺好用！当然要看你的材料是什么了。植物的次代谢产物多，目前常用的是CTAB法。具体方法就太多了，针对不同试验材料的各自特点，将几种大的方法略加改动。

在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

怎样提取细胞核内的RNA如何分别从细胞浆和细胞核中抽提RNA操作步骤：样品处理：a. 植物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀。b. 动物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。c. 贴壁细胞：直接在培养板中加入裂解液裂解细胞，每106细胞加1ml 裂解液。用取样器吹打混匀。d. 细胞悬液：离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。e. 血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。 将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟。2-8℃ 12000 rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀。

RNA抽取一般使用Trizol法抽提。Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。Trizol作用原理:在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

细胞中的RNA主要有三类：rRNA约占80％－85％,tRNA和核内小分子RNA约占10%-15%,mRNA约占1%-5%,由于rRNA占绝大多数,因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rRNA,它也有三种类型：28S,18S,5S.所以我们看到的也应该是三条带,而且28S的亮度为18S的两倍.这样的RNA才可以用来建库. 在RNA的提取时,一定要注意RNase的污染,因RNA极易被RNase的降解,操作时应尽量少说话,并在洁净的环境中操作,主要防止手、唾液和空气中Rnase的污染；另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase,可以不经处理直接用于提取RNA,实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有Rnase污染,使用前必须180度干烤8小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）,另外,由于材料不同,机体内含有的糖、酚类物质不一样,因此材料不同用的方法也应该不一样. 下面是两种提取方法,第一种适用于嫩组织或动物组织的总RNA的提取,第二种适用于老组织的提取. 试剂：提取缓冲液,KAc(5M),异丙醇,无水乙醇,DEPC水 仪器：离心机,恒温水浴锅,研钵 方法一 动物、植物（嫩叶）的总RNA分离 大约2克植物组织或动物组织用液氮研磨 ↓ 加5mlTrizol裂解液 ↓ 12000rpm ,4度,10分钟 ↓ 加入1ml氯仿 ↓ 剧烈振荡15秒,室温温育2-3分钟 ↓ 室温离心10分钟,8000rpm ↓ 取上清,加入等体积的异丙醇,15-30度放置10分钟. ↓ 12000g离心10分钟 ↓ 弃上清,加入10ml75%洒精洗沉淀. ↓ 2-8度下,不超过7500g离心5分钟 ↓ 弃上清,干燥沉淀10分钟 ↓ 用DEPC水溶. 方法二 、植物老叶、老根或多糖含量高的材料的总RNA分离 1g组织液氮研磨,加入6ML提取缓冲液 ↓ 2min振荡 ↓ 65℃,20min ↓ 加入1.5MLKAc ↓ 混匀,冰浴20min ↓ 8000rpm,4℃,15min 取上清,加入0.6倍异丙醇,-20℃,1小时（或室温15-20min） ↓ 12000rpm,4℃,15min ↓ 75%乙醇,12000rpm,20℃,5min ↓ 晾干,溶60ulDEPC水,15min ↓ 12000rpm,4℃,5min,上清即为RNA.,10,需要防止RNA降解，用华越洋的外源RNA酶清除剂，处理耗材，器具，台面等。,0,RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些 稀碱法提取实验

楼上说的是错的，逆转录出来的dna是唯一的，不可能有多种可能，因为一种基因的mrna是唯一的！这位同学应该多看看密码子的知识，扯了半天都是与题目无关的。提取mrna、反转录的操作都是基因工程，但是问题在于：这句话本身就是错的！一言以蔽之，肝脏细胞不表达胰岛素基因！胰岛素基因在肝脏细胞内不转录，没有mrna生成，所以无从提取，也无从反转录！这个实验设计就是失败的。基因工程首先必须得在合适的标本下进行合适的操作。

Trizol可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，同时使RNA酶变性失活，保护RNA的完整性。Trizol的主要成分为异硫氰酸胍、酚和B-巯基乙醇，异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 提取中加入氯仿，主要用处是用来分相，加速有机相和水相的分层，上层为水相，PH 5.1左右，只有RNA分子留在水相，DNA分子沉淀在酚与溶液的界面。加入异丙醇，主要沉淀大分子rRNA和mRNA。最后加入乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，去除杂质。 判断RNA 的质量主要有两个标准，一是完整性（是否被降解），二是纯度。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现28S、18S和5S rRNA对应的条带，如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带。 完整性的图片大致如下图所示： RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。蛋白中trp、tyr、phe的吸光度为280nm，所以 280nm常用来表示蛋白质吸光度；而260nm为DNA的吸光度。 理论上， 纯的RNA情况下：OD260/OD280的值为2，纯的DNA情况下：OD260/OD280的值为1.8. OD260反映的是溶液中核酸的浓度，OD280反映的是溶液中蛋白质或者氨基酸的浓度。 样品中如果含有蛋白质及苯酚，A 260 /A 280 比值会明显下降。对于纯的样品只要读出260 nm 的A值即可以算出含量。通常以A值为1相当于50微克/ml 双螺旋DNA，或者40微克/ml 单链DNA（RNA），或者20微克/ml 寡核苷酸计算。 OD260/OD280=1.9~2.0 RNA居多，纯度已经很高了。 纯DNA：OD 260 /OD 280 ≈1.8(>1.9，表明有RNA污染；<1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.9 <OD 260 /OD 280 <2.0（2.0时表明可能有异硫氰酸残存） 提取前需要准备： 75%的乙醇（提前于-20冰箱保存）、氯仿、RNAase-free water、1.5ml Eppendorf离心管、Tips（RNAase-free）。 需要特别注意的是 一定要带好手套和口罩，做好个人防护工作！！！并且也可以防止RNA降解 步骤： （1） 培养细胞： 收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。 （2） 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入0.8~1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。 （3）按200ul氯仿/ ml Trizol的量加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。注：剧烈震荡使基因组DNA断裂。 （4）4℃离心，12000rpm，15min。注：离心后分为三层，下层为红色的苯酚—氯仿层，中间层和上层的水样层，RNA存在于水样层中。若只提RNA，千万不要吸取中间层和下层酚—酚相，可保存于4℃冰箱。 （5）将上层水相转移至另一个EP管中，加入等体积的异丙醇并混匀(约500ul)，室温放置10min或者-20冰箱沉淀2h，也可以-20冰箱沉淀过夜。 （6）4℃离心，12000 rpm，10min，用枪头小心吸走液体，RNA沉于管底。 （7）用0.5ml 75%冰乙醇洗涤RNA沉淀，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 （8）4℃离心，8,000rpm，5min。重复两次。弃去乙醇后，室温干燥RNA沉淀5-10min。 （9）可用50ul H2O溶解RNA样品，55-60℃ 溶解5-10min，保存于-80℃。 所得RNA可以继续用于下游实验。

1．提取称取鲜酵母 159或干酵母粉 2.5g，倒入 100ml三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取lh。2．分离将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r／min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。3．沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内，并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却．待冷至10℃以下时，用6mol／L HCI 小心地调节pH值至2.0～2.5（注意严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。 4．洗涤和抽滤 上述悬浮液以 4000r／min离心 10min，得到 RNA沉淀。将沉淀物放在 10ml小烧杯内，用95％的乙醇 5～10ml充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95％乙醇5～10ml淋洗 3次。5．干燥从布氏漏斗上取下沉淀物，放在6cm表面皿上，铺成薄层，置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重，存放于干燥器内。

可以用试剂盒或者用Trizol LS

1. 防止样本降解。液氮速冻或者RNALater保存液保存2。防止RNA酶污染，可以加抑制剂3。迅速操作4。提取后尽快进行下一步实验，mRNA不宜存放于水溶液冻存。