荧光定量PCR技术原理及利用？

qpcr原理是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流。应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。扩展资料实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。参考资料来源：百度百科-QPCR

一、原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：1、 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链；重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。二、应用1、基因表达分析：例如结核分岔杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种生长相当缓慢的细菌，传统培养及鉴定一般需要花数周时间。2015年时Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己发展的real time PCR检测mpt64，直接检测病人痰液中的结核分岔杆菌，分析715个检体657个病人，其检测灵敏度（sensitivity）及特异性（specificity）分别为90.3%及98.6%。整个实验流程可以在5个小时内完成，此方法可以用于没有套装试剂（kit）可以使用的实验室。2、检验生物芯片的结果；3、siRNA与miRNA诊断；4、基因型鉴定；5、饮食分析；6、兽医微生物检测。特点1、荧光实时定量PCR的基本原理有两个要点：首先是对PCR反应中的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来；其次，用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上，并且处于淬灭状态，只有当探针与模板特异性结合以后才有可能释放出荧光信号。2、每一轮循环中PCR的产出量都以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测系统记录下来，在某一循环中荧光信号的强度达到预先设定的阈值时，此时的循环数称为CT(Threshold Cycle)，Ct值与起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，达到阈值的循环数就越少，换句话说CT值会越小。如果要确定量的话，需要做出标准曲线，以Ct值为纵坐标，起始模板数为横坐标作图。在新的MIQE规范中Ct这个惯用的名词被重新定义为Cq值(quantification cycle)。

　　qpcr原理：通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。qpcr应用于大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。　　1、qpcr是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。　　2、Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板透过PCR进行DNA复制。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。　　3、由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接输出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。

一、原理在指数阶段，PCR 产物的量在每个循环中大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应组分被消耗，最终一种或多种组分变得有限。此时，反应减慢并进入平台期。最初，荧光保持在背景水平，即使产物以指数方式累积，也无法检测到荧光的增加。最终，足够的扩增产物积累以产生可检测的荧光信号。发生这种情况的循环数称为量化循环，或 q。由于 q值是在试剂不受限制的指数阶段测量的，因此可以使用实时 qPCR 根据描述反应进程的已知指数函数可靠和准确地计算反应中存在的模板的初始量。反应的 Cq主要由扩增反应开始时存在的模板量决定。如果在反应开始时存在大量模板，则需要相对较少的扩增循环来积累足够的产物以产生高于背景的荧光信号。因此，反应将具有低的或早期的 Cq。二、应用实时荧光定量 PCR/qPCR 检测已成为快速、灵敏地测定和定量各种生物样品中核酸的首选工具，具有多种应用，例如基因表达分析、食品中转基因生物的检测和癌症表型分析.在研究实验室中，qPCR 测定广泛用于定量测量转化细胞系中的基因拷贝数（基因剂量）或突变基因的存在。与逆转录 PCR (RT-PCR) 相结合，qPCR 分析可用于精确定量基因表达的变化，例如，通过测量细胞的变化，响应不同环境条件或药物治疗的表达增加或减少mRNA水平。qPCR/实时 PCR 仪器实时 PCR 检测系统由配备光学检测模块的热循环仪组成，用于测量每个扩增循环期间荧光团与目标序列结合时产生的荧光信号。Bio-Rad 实时 PCR 检测系统具有热循环仪和可互换的模块，用于荧光团的单重和多重检测以及固定的实时 PCR 单元。所有 qPCR 系统都具有热梯度功能。

目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。实时荧光定量PCR 技术的主要应用：DNA或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

一、QPCR原理“qpcr原理是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法；应用于对PCR进程进行实时检测。检测方法：加尾法和颈环法miRNA很短，用mRNA的反转录方法无法得到足以定量的cDNA。所以，miRNA的反转要求将miRNA序列进行延长，目前常用的序列延长反转录法包括茎环法和加尾法。特色：①RNA加尾和引物延伸法，样本用量少（1μg）且不需分离miRNA。②采用通用反转录引物，一次反转录产物可用于上百个miRNA检测。③检测通量高，可同时检测数十个miRNAs。④不同末端成熟miRNA都能被加尾和反转录，保证定量准确性。⑤配合QIAGEN试剂盒，保证实验可靠性；⑥扩增产物特异性高，通过产物热解离曲线（融解曲线）判断。

内容目录： RT-qPCR简介 RT-qPCR逆转录过程 RT-qPCR 的 qPCR 过程 定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。 RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成（图1、表1）。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。 在设计RT-qPCR实验过程中，决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度，但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先，其过程需要较少的纯化步骤，这确保了更好的定量回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。其次，其避免了mRNA富集步骤，这能够避免由于不同mRNA的回收率不同而带来的结果偏移的可能性。总的来说，由于在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要，因此在大多数情况下，总RNA更适用1。 在两步法中，有三种不同的方法可用于引发cDNA反应：oligo(dT) 引物、随机引物、或序列特异性引物（图2，表2）。通常情况下，是将 oligo(dT) 引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板 mRNA 链，并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。 逆转录酶是利用 RNA 合成 DNA 的一种酶。一部分逆转录酶具有 RNA 酶活性，能够在转录后降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以获得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶（AMV）。对于 RT-qPCR 来说，理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶，这样 cDNA 的合成能够在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的 RNA，同时保持其在整个反应过程中的全部活性，从而得到更高的 cDNA 产量。 RNase H 能够从 RNA-DNA 双链中降解 RNA 链，从而允许双链 DNA 的有效合成。然而，当使用长 mRNA 作为模板，RNA 可能被过早的降解，从而导致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆过程中，如果需要合成长的转录物时，尽量减小 RNase H 的活性通常是有益的。与此相反，拥有 RNase H 活性的逆转录酶通常有利于 qPCR 的应用，因为它们能够在 PCR 的第一个循环中提高 RNA-DNA 双链的熔解（图3）。 用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界（图4）。由于含内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增，因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的风险。 如果引物不能被设计成能够分离外显子或外显子-外显子边界，则有必要利用无 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶处理 RNA 样品以除去基因组 DNA 污染。 一个逆转录阴性对照（-RT对照）应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中，以检测 DNA 污染（如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物）。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录，因此如果观察到 PCR 扩增，则极有可能来自 DNA 的污染。

实时荧光定量PCR（qPCR）即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Cq值和标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。根据Real-time qPCR的化学发光原理可以分为2大类：一类为探针类，包括TaqMan@探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，其中包括如SYBR Green或者特殊设计的引物(如LUX Primers) 通过荧光染料来指示产物的增加。荧光监测上世纪八十年代Cetus Corporation公司的化学家Kary Mullis发明了PCR，如今DNA扩增技术俨然已经成为了生物学研究的基础。三十多年以来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，PCR技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。如今PCR技术早已走出实验室，在遗传学鉴定和疾病诊断中发挥着巨大的作用，在越来越广阔的领域里焕发着新的活力。技术用于实践

实时定量PCR(qPCR)和数字PCR(dPCR) qPCR主要使用插入染料或荧光探针(例如TaqMan)。通过监测PCR期间的荧光强度，可以比较多个样品的DNA水平。数字PCR(dPCR)的基本工作原理很简单。先将样品分为多个PCR反应，每个反应多包含一个模板。然后通过对阳性和阴性反应进行计数来确定初始样品中模板分子的数量。

qPCR数据处理方法为△△Ct法原理【△△Ct法原理】其特点是只依靠Ct值来计算结果，因此跑完qPCR之后的结果中除了Ct值外，其他数据几乎在后续分析和计算中是用不到的。但前提是目的基因和内参基因的扩增效率应基本一致。1、先来了解一下什么是Ct值？阈值循环数Thresholdcycle(Ct)也写作Cq值，荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline）。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。

RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）和qPCR（定量聚合酶链反应）是两种常用的分子生物学技术，用于检测和量化特定DNA或RNA序列。RT-PCR主要用于检测和扩增RNA序列。首先，RNA通过逆转录酶转录成cDNA（互补DNA），然后使用聚合酶链反应扩增目标序列。RT-PCR在基因表达研究、病毒检测等领域广泛应用。qPCR是一种定量分析技术，可用于准确测量DNA或RNA的初始数量。它通过荧光探针或DNA染料监测PCR反应过程中的DNA合成量。qPCR可以提供准确的基因表达水平、病原体数量等信息。

数字PCR是新型起来的一种核酸分子绝对定量技术。该技术可直接获得DNA分子的拷贝数，实现其实样品中核酸分子的绝对定量，且无需标准品或内标。数字PCR已经被广泛应用到医学、生物学等各个领域，如拷贝数变异、突变检测、复杂来源样品中低丰度核酸分子的检测、NGS数据验证、miRNA等微小差异表达研究、单细胞基因表达分析等方面，在已知突变的癌症分子标志物检测、传染病病原体检测、基因组三倍体分析和基因表达分析等领域展现了强大的优势。德国Qioptiq iFLEX系列超稳定低噪声激光器模块，是流式细胞仪、dPCR、共聚焦显微等仪器理想的激光器模块。此外，还可选择光束组合器组合多波长激光器，可以按照客户定制要求提供圆光斑或整形光斑，并且功率可调。payne@rayscience.com

荧光标记收集PCR反应产物。qpcr下游实验原理是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，实验内容是荧光定量PCR在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应荧光染料收集PCR反应产物。

那么进入正题吧！ 今天我们讲讲假设检验这个东西，并且会以 qPCR数据处理 为例子，应用假设检验，获得传说中小于0.05就很了不起就P值。 文末还有大大的彩蛋哦！！！ 假设检验这个东西，我们顾名思义，就是 检验 某一个 假设 ，所以，这就很自然地引出两个重点，欸对，两个重点就是： 我们可以这么理解student t检验这个东西： 一般来说，我们的假设是， A，B两组没有差异 ，然后计算在A，B没有差异的情况下，出现我们观察到的数据的概率。 如果该概率<0.05 ,那么我们就说，这事发生的概率太低了，这个假设不靠谱，我们就 否定原有的假设 ，进而相信A组数据和B组数据在统计上有显著性差异。 这里有两个统计学的术语： 除了T检验，还有别的检验，不同的检验都有对应的 假设 和 检验 方法，比如F-检验，卡方检验，秩和检验等，适用于不同的情况，有不同的目的，使用前要搞清楚。 最常用的就是T检验，我们已经知道了他的整体逻辑了，但是我们还不清楚，他如何计算的，理解了计算过程，可以让我们更好地理解和解读p值，不去错误地使用p值，不迷信p值。 在理解计算原理之前，我们举个栗子，思考一下别人的人生： 老张闭上眼睛，认真思考着以上问题（读者可以跟着他一起思考，助他一臂之力） 没想到老张是个被苹果耽误了的数学家。他花了一周画了两张图。 老张点了根烟，叹息道， 这一切都是抽样造成的 ，如果我能收集世上所有A苹果和B苹果，就可以求出准确的均值，我就知道哪个苹果大了。但是我做不到，做不到就只能抽样。 抽样只能近似真实的均值，但总存在误差。 比如上面的两张图，蓝色是抽样的A苹果不同重量的频数，红色是B苹果。左右两张图，同样是均值差10g（均值以竖直直线表示），但是左图中， 红色曲线下面积与蓝色曲线下面积很少重叠 ，也就是说，红色整体上 确实大于 蓝色。而右边的图，虽然红色的均值大于蓝色10g，但是 这两条曲线基本重合 ，这次抽样B比A大10g，很有可能是 误差 。下次再试一次，可能A就比B大了。 老张猛吸一口烟，转念又想，即使是右图的情况，如果我是统计了咱们镇 所有的AB苹果 ，得出这样的结果，是不是还是可以说B比A平均大10g呢，这总比我统计100个苹果来的准吧！ 老张熄灭了手头的烟，缓缓的说： 面对浩瀚无垠的数学宇宙，张三开始了他的统计之旅： 他提出了以下思路： 于是乎，老张不知道怎么回事（我也不知道怎么回事，请知道这个公式怎么来的同学私戳我），推导出了第一个公式 表示苹果的重量， 表示苹果的均值， 表示苹果的真实均值， n为样本数 为x的真实标准差， 为x的样本标准差 表示 与 之间的误差的标准差，学名叫标准误，standard error （se） 该公式是说，如果我对一颗苹果树抽样，取n个苹果，那么我们可以认为苹果的样本均值概率应该服从 以 为中心,标准差为 的正态分布 注意： 这里描述的是采样均值的分布，不是采样个体的分布，即你采样很多次，每次计算出的均值放在一起，是这样一个正态分布 这里可能难以理解，于是老张又画图说明 这张图这么理解，这里很重要 ， 我是上帝，我知道苹果树的苹果真实均重300g，标准差10g，我从一种树上摘了30个苹果，对苹果的取样应该，其均值应该是 以300为中心，标准差为 = 1.8 的正态分布。 张三不是上帝，张三只能根据采样，他发现样本均值为298，标准差为7.78，（图中蓝色部分）。 但是他对真实的均值和标准差一无所知 ，所以聪明的张三，反其道而行，他说， 既然能用真实的均值和方差推测样本的均值，是不是可以用样本的均值和方差推测真实均值 ，套用上面的公式，推测苹果的真实均重概率应该是图中红线那样，以298为中心，标准差为 = 1.42， 这就是对真实均值力所能及最好的判断 这时候，张三转念又想，怎么比较A和B的差异呢，眼珠子那么一转，有了！ 我们既然比较AB之间的差距，为什么不去计算 A均值-B均值呢， 张三说要有X，我们就有了X 这是，我们只要检验 X = 0 是否成立就行了，我们的零假设是AB无差异，即X=0， 如果零假设成立，那么X的分布应该是一个以0为中心的分布，该分布的方差，应该是 方差 + 方差 ，即： 有了这样的分布，我们就可以描述每次抽样X在某个范围的概率 张三画了第三张图 该曲线下面积占比其实就是零假设下的事件发生的概率。 P值计算的是零假设下的发生某事件或者更为极端事件的概率 如我取样后计算得到X=2， 按照正态分布可以计算得，从2到正无穷，曲线下面积占比为约0.025（右边红色部分），那么A比B大2或者大更多的概率是2.5%，这就是P值。2.5%这个概率够小，我们觉得零假设应该是在扯淡，于是拒绝零假设，选择备选假设，即认为AB有显著差异 上面其实是算单尾的情况，即比较A比B大，或者A比B小的情况，会先假定一个方向。而日常常用的是双尾t-检验，他不假设AB哪个大哪个小，所以如果算出X=2， 他会计算两边， 的曲线下面积，故数值上P值=0.05，是单尾的2倍 一般我们以5%作为阈值，只有在P<0.05时，我们才认为，零假设下，出现这么大的X的概率太小了，才会舍弃零假设，选择AB确实有差异这个备选假设。 因为双尾不假设AB哪个大哪个小，p值是单尾的两倍，所以更为严格。 我们一般都选双尾 说了这么多，我们来应用一下，比如我有基因A，我一顿操作处理了细胞，想通过qPCR看看A的表达变了没。 比如 我来编个数据， 那你说这个A的表达是变了还是没变？ 我也不知道，但我们可以假设A没变，看看我们获得这样的数据的概率，如果概率<0.05, 我们就舍弃这个假设。 在Excel中，可以直接算t-test,如图： 尽管上下两次计算的时候，他们的均值差大小相近，但由于第二次样本多，所以我们对真实均值的估计分布会精确一些，即正态分布更加修长苗条，他们同样的均值差情况下，第二种情况就落在正态分布更外侧的地方，曲线下面积更小。 很感谢，大家看到这里，还记得之前我出过一个qPCR处理的软件吗，这次推出了进化版，可以计算p值，程序会自动计算每个基因处理组与对照组的双尾t检验，还是一键全自动，熟悉的味道，更强的功能。同名公号后台回复 qPCR 领取。 2020-03-28

qPCR这项技术，被广泛用于生物学的研究，只有有以下用途： qPCR作为一种DNA定量手段，一般情况下， 还可以分为 绝对定量 和 相对定量 。 好的， 那么一般情况下， 我见过比较多的qPCR，都是以RNA相对定量为目的的，也是本文讨论的焦点。 qPCR和PCR一看名字就知道很像， q 就是quantitative的意思，quantitative就是定量的意思。。。（为我的废话鼓掌） 其实，说到底，qPCR就是通过荧光染料或者荧光探针来表征PCR产物的量，进而推断出PCR前，样本的初始核酸量。 具体原理是，对于不同的样本和基因，比较到达一定荧光强度所需要的循环数， 如果你的样本中DNA1的量 大于 DNA2的量，那么理论上， DNA1比DNA2需要更少次数的PCR扩增就可以达到某一个阈值. 如果对于详细原理有什么执念的同学可以自行百度，必应，谷歌。。。 在实际实验过程中， 我们的实验没那么简单 一个仿真例子： 那么我们一般这样做，我会有处理和未处理的细胞，我们想比较这两种细胞geneA表达量的差异，我们在提取细胞的RNA并定量后反转成cDNA后，进行qPCR， 获得geneA和某一个内参基因（如GAPDH）的CT值。内参基因GAPDH在这里起到一个矫正的效果来去除不同的样品间 RNA产量 ， RNA质量 以及 逆转录效率 上的差别。 最最最常用的qPCR相对定量的方法是 ΔΔCT 法 （读作：delta delta CT） 公式如下 即 先用内参基因校准，再算样品与对照组间的差异 ，而我们的表达量的差异就可以表征为 虽然大多数qPCR设备都配有很完备的分析软件， 但是 。。。。。 这些软件的图可能不适合直接放文章，或者， 咳咳，很丑,你想自己修改之类的 而他们一般都不太提供最终计算结果，只提供CT值，那么这个就很让人头大了。 于是乎 秉承着 自己动手丰衣足食 一直折腾一直爽 的传统美德，我写了一个小小的工具，方便大家计算最终的相对表达量 该工具基于微软爸爸的EXCEL和VBA，不限样本数量，基因数量及每组实验的平行个数（如果你有三个复孔，其中一个如果CT和其他两个差别很大，你可以删除该孔，有些组3个复孔，有些2个，不影响程序运行） 在同学（zi）的（ji）强（xian）烈（de）要（mei）求（shi）下，我的qPCR数据处理小程序迎来了V2.0版本，主要增加了自动添加误差线的功能。 大家感受一下， 一键出图 的魅力，喜欢的同学记得点赞，转发哦, 获取链接在文末 获得相对表达量值之后呢，你可以使用origin或者graphpad等工具作图，读者可以查看我往期关于origin的文章哦 文章直通车>>> origin科研作图 此工具如有任何问题或者你们有什么建议或者链接失效等情况，请于公众号“肖恩札记”留言

荧光定量PCR原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针（BIOGHC Elitefast SYBR Kit）和荧光染料（BIOGHSC Super Probe Kit）

你好啊，他们之间的区别基本上不大没有什么区别。

做完转录组分析之后，一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法，他的计算方法有很多，常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法，ΔCt法，2 -ΔΔCt法(Livak法)，用参照基因的2 -ΔΔCt法(Livak法): 该部分引用自下方参考链接1 qRT-PCR原理 以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。 Ct值 计算 -ΔΔCt ：内参基因分为对照组和处理组内参基因 单个样本三个技术重复，检验不同的目的基因扩增效率 结果 ： IL-1B 和INOS基因相比NC组而言，其含量越多

PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：PCR的技术的主要步骤：1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。2、引物设计的基本原则1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。3、引物内部不应出现互补序列。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。扩展资料PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR、竞争PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。第一代PCR就是常见的定性PCR技术，它采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析。第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR，qPCR），它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。第三代PCR技术--数字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。PCR芯片技术PCR仪器发展的趋势之一变得更加微型化，PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片就是在微型的载体上进行PCR反应，是微型化的PCR仪。芯片PCR不仅节省了大量反应试剂因此降低了实验成本，还有助于提高反应速度。参考资料：百度百科-PCR技术

rt-qpcr全称为实时荧光定量（Real Time Quantitative）RT-qPCR属于第二代PCR技术，与常规的PCR技术相比，RT-qPCR技术可对DNA起始模板进行定量，同时可以对整个扩增反应进行实时监控。该方法中，总RNA或者信使RNA首先通过逆转录酶转录互补DNA，随后cDNA为模板进行qPCR反应，RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、病原体检测和疾病研究。以上就是对于rt-qpcr的一些基本情况，希望能够帮助到你！加油！

一楼的~real-time PCR不就是RT-PCR吗？！实时定量PCR

溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解.这个一般是用SYBY Green作为荧光染料的时候需要做的工作！我们实验室用BIOGHC Elitefast SYBR Kit检测DNA,熔解曲线是为了验证扩增产物特异性的，要是熔解曲线是单峰说明产物只有一条，结果较好；要是双峰说明产物不特异，可能存在引物二聚体或非特异性扩增，有可能你的引物设计有问题。

二者系统组成不同 荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行“定量分析”的方法。记住，实时荧光定量是定量分析。二者系统组成不同，荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。二者原理不同，荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光，普通OCR通过检测插入DNA中核算染料的量来测定PCR最终产物量。二者反应要求不同，荧光定量PCR对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp，普通PCR可以扩增长点的片段。二者应用不同，荧光定量PCR主要是用来定量分析和确定基因转录水平的，普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段，定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作，反之不行。二者测量成本不同，定量PCR仪价格较为昂贵，普通的基因扩增仪（PCR仪）只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多，而且运行成本也要低很多。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

上世纪八十年代的化学家发明了PCR，如今DNA扩增俨然已经成为了生物学研究的基础。三十多年以来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR。qPCR和dPCR，它们之间都有什么区别呢？ 目前的PCR方法主要可以分为三类： PCR、qPCR和dPCR 。 PCR是最原始、最简单的PCR方法，如今仍在被我们广泛使用。使用者只能在PCR反应结束之后，通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。PCR本身是无法定量的，因为我们只能获得反应结束的样品。通过凝胶电泳只能看出扩增质量、不同样品目的片段分子量的相对大小（通过电泳移动的距离，产生不同距离的原因可能是不同片段的扩增速度有别使得单一片段有长短，也可能与碱基含量有关）。无法根据条带颜色深浅得到量值。 qPCR主要是利用插入性染料或荧光探针（比如TaqMan），人们可以通过监控PCR过程中的荧光强度比较多个样品的DNA水平。该方法主要通过样品的Ct值（Cycle Threshold，即扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数）与该样品起始拷贝数的对数存在线性关系配合标准曲线来计算样品反应前目标序列的含量的。 dPCR的原理并不复杂。首先，dPCR把反应体系均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，目的核酸序列的数量符合泊松分布。然后在每个反应单元中独立地进行PCR扩增。扩增结束后，检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。 主要参考文献： [1] 詹成,燕丽,王琳,金玉麟,陈力,时雨,王群.数字PCR技术的发展和应用[J].复旦学报(医学版),2015,42(06):786-789.

ATAC-seq ,英文全称Assay for Targeting Accessible-Chromatin with high-throughout sequencing。用于研究染色质可及性/开放性的方法。 一、什么是染色质可接近性/开放性？ DNA与组蛋白结合后形成核小体，核小体再进一步折叠压缩后最终形成染色质。DNA的复制和转录都需要 将染色质紧密结构打开 ，从而 允许调控因子结合DNA 。这部分被打开的染色质，就叫开放染色质区域（Open Chromation region, OCR ）。开放染色质允许调控因子结合的特性称为染色质的可接近性（Chromatin Accessibility）。 二、原理 转座子：一段可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用的DNA序列。 转座酶：能把转座子从相邻序列中脱离出来。 极活跃的Tn5转座酶 能 将测序接头插入到染色质可接近区域 。而染色质其他区域和组蛋白紧密结合，以核小体的形式存在，转座酶不能作用于非开放区域。之后再通过 测序分析 ，可得到开放染色质信息。 注：开放与否由激活子 promoters、增强子enhancers和其他调控元件regulatory elements以及是否能与转录机器accessible to transcription machinery 接触决定。染色质的压缩与动态的表观遗传密码有关：DNA甲基化、核小体位置、组蛋白结合以及修饰、转录因子、染色质重塑复合物和非编码RNA。 测序结果 可以用于判断区域的可接近性是否增加，也可以看转录因子结合区域和核小体的位置。 三、步骤1、准备细胞（计数、裂解） 2、转座反应与纯化 3、PCR扩增 4、qPCR(构建体系、运行、计算CT值) 5、文库质量控制：凝胶电泳（凝胶电泳的替代方法:生物分析仪） 四、与ChIP-Seq的不同 ChIP-Seq原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP） 特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段 ，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。 ATAC-seq是 全基因组范围 内，找出所有的OCR。

qpcr原理：通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。qpcr应用于大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。1、qpcr是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。2、Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。逆转录PCR，或者称反转录PCR，是聚合酶链式反应的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板透过PCR进行DNA复制。由一条RNA单链转录为互补DNA称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶来完成。3、由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。数字PCR即DigitalPCR，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接输出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。

qpcr原理介绍如下：qPCR原理是将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光。随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。qPCR技术广泛应用于生物医药食品等行业，运用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等。具体的应用环境：1、动物疾病检测禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。2、食品安全食原微生物、食品过敏原、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。3、科学研究医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

RT-qPCR简介 定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。 RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成（图1、表1）。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。 RT-qPCR逆转录过程 在设计RT-qPCR实验过程中，决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度，但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先，其过程需要较少的纯化步骤，这确保了更好的定量回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。其次，其避免了mRNA富集步骤，这能够避免由于不同mRNA的回收率不同而带来的结果偏移的可能性。总的来说，由于在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要，因此在大多数情况下，总RNA更适用 1 。 在两步法中，有三种不同的方法可用于引发cDNA反应：oligo(dT) 引物、随机引物、或序列特异性引物（图2，表2）。通常情况下，是将 oligo(dT) 引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板 mRNA 链，并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。 逆转录酶是利用 RNA 合成 DNA 的一种酶。一部分逆转录酶具有 RNA 酶活性，能够在转录后降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以获得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶。对于 RT-qPCR 来说，理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶，这样 cDNA 的合成能够在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的 RNA，同时保持其在整个反应过程中的全部活性，从而得到更高的 cDNA 产量。 RNase H 能够从 RNA-DNA 双链中降解 RNA 链，从而允许双链 DNA 的有效合成。然而，当使用长 mRNA 作为模板，RNA 可能被过早的降解，从而导致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆过程中，如果需要合成长的转录物时，尽量减小 RNase H 的活性通常是有益的。与此相反，拥有 RNase H 活性的逆转录酶通常有利于 qPCR 的应用，因为它们能够在 PCR 的第一个循环中提高 RNA-DNA 双链的熔解（图3）。 step1：如果 RNA 模板具有较高的二级结构建议操作该步骤。 step2：该步骤建议用于引物的延伸。 step3：逆转录酶以 mRNA 为模板合成 cDNA 链。 step4：该步骤可阻止活性逆转录酶带来的 qPCR 抑制。 用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界（图4）。由于含内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增，因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的风险。 如果引物不能被设计成能够分离外显子或外显子-外显子边界，则有必要利用无 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶处理 RNA 样品以除去基因组 DNA 污染。 一个逆转录阴性对照（-RT对照）应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中，以检测 DNA 污染（如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物）。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录，因此如果观察到 PCR 扩增，则极有可能来自 DNA 的污染。 图 4.RT-qPCR 中 qPCR 步骤的引物设计。1）如果一个引物被设计为跨越外显子-内含子边界，则可能造成污染的基因组 DNA 将不会被扩增，其原因是引物不能退火至该基因组 DNA 模板。相反，cDNA 不含任何内含子，能够有效被引物识别并扩增。2）当引物侧接一个长的内含子（例如1 kb），扩增反应将不会发生，因为短的延伸时间仅够用于扩增短的 cDNA，却不足以扩增基因组靶基因

qPCR数据处理方法为△△Ct法原理【△△Ct法原理】其特点是只依靠Ct值来计算结果，因此跑完qPCR之后的结果中除了Ct值外，其他数据几乎在后续分析和计算中是用不到的。但前提是目的基因和内参基因的扩增效率应基本一致。1、先来了解一下什么是Ct值？阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline）。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。

q PCR内参做3个。QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction简称PCR)原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿。

一般来讲，进行real-timeqPCRMasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-timeqPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1.MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。2.的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。3.每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4.所有成分加完后，离心去除气泡。5.每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料（referencedye，passivedye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-timeqPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。3.仪器设置所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（platesetup）和程序设置（programsetup）。我们以ABIStepOne为例，详细看一下反应设置：A.首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。B.实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBRGreen方法，Fast程序，以cDNA为模板进行。C.目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。D.样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。E.对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备F.反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。G.反应体系的设置：A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”。设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！五、Real-timeqPCR数据分析1.Real-timeqPCR常见参数基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线阈值（threshold）自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。Rn（Normalizedreporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。2.影响Ct值的关键因素模板浓度模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。反应液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。PCR反应的效率PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。3.如何评估实时定量PCR反应的效果PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。常见问题1.无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2.Ct值出现过晚（Ct>38）扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。3.标准曲线线性关系不佳加样存在误差:使得标准品不呈梯度。标准品出现降解:应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高4.负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5.溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。6.扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8.扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解荧光定量PCR问题汇总1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？　　按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。　　开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。　　关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。2.哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？　　　　定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2ml光学八联反应管配合光学膜，0.2ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？　　当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。碎片整理的方法如下：　　·在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(Mycomputer)。　　·在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。　　·在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragmentnow)。　　·单击碎片整理(Defragment)。　　·当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。　　·在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。　　·为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。4.何时执行windowsservicepack更新？　　不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR仪的计算机的操作系统。新版本的MicrosoftWindows操作系统有可能与SDS软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行。如果您希望安装servicepack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS软件提供的版本说明，避免兼容性问题。5.应该备份哪些数据？　　应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDSDocument。下图是校正文件的样本。6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行？　　良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：　　电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。　　通风：仪器的通风应该没有阻挡。　　温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。　　湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。　　空间：易于操作，安全。7.怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？　　一个法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。　　另外一种法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。清除样本加热块污染的步骤如下：　　用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。　　吹打数次。　　将废液吸入废液杯中。　　重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。　　确认反应孔中的残留液体蒸发完。8.什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？　　背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收集的温度为60°C。随后，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数据中扣除背景信号。　　因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。9.什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？　纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样品中的荧光染料种类和信号强度。　　推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎样封膜？　　当使用96孔板做实验的时候，推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。正确的封膜方法是：先沿着96孔板的纵向压膜，然后横向，最后沿着板的边缘按压使之密封。11.使用单管或8连管做实验时，在样品加热块上应该怎样安排放置？　　使用单管或8连管做实验，并且样本数量不多的时候，建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品，最好是纵向放置，并且优先放在第6列或第7列，然后逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各个反应管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性.12.绝对定量与相对定量有什么区别？　　绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。　　举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。　　绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。　　相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。　　CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是。　　绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。　　相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。13.定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理？　　总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。　　首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。　　其次，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18SRNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。　　第三，计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。14.标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理？　　假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用的内对照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的测定结果都是总RNA的pg数，数据的处理方法见下表：15.什么是CT值比较法？数据怎么处理？　　CT值与起始DNA浓度的对数成反比：　　如果(1)不同管之间的PCR反应效率相同；(2)这些PCR的反应效率接近100%，可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02)=2-ΔΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。　　　　　16.每个反应管中可以加入多少种探针？　每个反应管中可以加入的探针数目，取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。　　首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下，全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量实际上是没有限制的。如果信号的采集要通过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，增加探针需要增加或改变滤色片。改动仪器的结构通常很困难。以AB公司的仪器为例，7900和7700是激光-全波长检测的，7000、7300是4色滤色片的，7500是5色滤色片的。　　其次是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起，在同一反应管内使用，必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近，既保证信号激发的效率又保证信号不重叠干扰，能够区分清楚。现已发现的荧光基团种类有限，满足这样条件的分子组合更少。目前的最佳组合只能达到每组4到5种荧光的水平。　　第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光；TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用TaqManMGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高，不做ROX校正（AB公司不推荐这样做），还可以再多一种荧光用于标记探针。　　第四是研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。　　最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高数据精确度，二是节省反应成本。同时测定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5种探针，就要同时加入8-10条引物。在引物设计的时候要考虑到尽量减少这些引物之间的竞争和抑制等多种干扰，平衡各对引物之间的PCR效率。虽然这是可以做到的，但是要花费大量时间、人力和物力来筛选最佳引物组合、优化反应条件。如果实验规模不大，在总体上可能反而不合算。　　在实际应用中，不是单纯追求加入的探针越多越好，而是追求总体效益的最优化。比较切合实际的是2到3重反应，引物和探针的设计不太困难，反应条件的优化也不太麻烦，同时降低了成本。17.等位基因鉴定实验（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不进行ROX荧光校正？不，等位基因鉴定实验也要进行ROX荧光归一，以保证实验结果的精密可靠。　　由于试剂加样操作的误差、离心管热量传递的误差、离心管盖透光性能的误差等偶然因素是不可避免的，必然导致荧光激发效率的差异，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，相互之间才可以比较并保证重现性。　　这种校正是通过在反应缓冲液中添加ROX校正荧光来实现的。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的高低变化只与上述物理方面变化的总体效应有关。将报告荧光的信号除以ROX荧光的信号，就能够消除所有这些物理因素所引起的数据波动。18.内标法和外标法哪种数据更精密？是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

1、百度搜索下载免费的Bio-Rad CFX Manger3.1软件，下载完毕后安装到你电脑上。2、在电脑上点开Bio-rad-2软件，会出现一系列的文件夹和应用程序扩展以及应用程序之类的，专门找到应用程序里面的BioRadCFXManager。3、点击步骤二中的应用程序。程序开启的速度有点慢，请耐心等待。关掉弹出来的无关窗口，点击File，下拉选择Open，选择横向的Data File，点击Data File，弹出你要选择加进去的QPCR数据文件。4、完成步骤三后会弹出你的QPCR曲线结果图。开始对结果图进行分析。首先点击Quantification那栏，看看QPCR的特征曲线跑得怎么样。用鼠标随意点击上面的一条绿色曲线，就出现相对应的哪个孔的Cq值。5、开始对曲线进行分析。这里的曲线多数分为两大类，分别代表了两种不同的引物的扩增曲线。曲线中另外出现了两条水平的线，一条在0刻度线处，代表该孔未加染料（QPCRmix）；而另一个孔在0-100之间，代表该孔未加模板cDNA，导致无法起峰进入平台期。这两条曲线去掉，不做数据分析。另外跟这两大群主峰的曲线分散比较大的杂曲线，也作为误差较大曲线，数据分析的时候弃掉不用。6、点击MeltCurve，一般有几个引物便会出现几个特征性的主峰。并且大部分曲线都会簇拥在它们的主峰里面。将数据导出来分析要返回到Quantification，在Cq值下面右击，出现Exportto excel，点击，即可保存为Excel表格，分为07和03版本。

核酸检测真的军事化管理的。根据查询相关公开信息显示，核酸检测实行军事化，交由军队全面接管，取消了私企承包商资格。新冠核酸检测的实验原理很简单，是通过qpcr仪器扩展新冠的核酸序列（也就是dna序列）来定量分析，判断受检的管子含不含病毒。

中医中的肾阳虚是指肾脏功能减退，特征为体内的阳气不足。SOD1是超氧化物歧化酶1（Superoxide Dismutase 1）的简称，它是人体内一种重要的抗氧化酶。SOD1实验原理是指通过检测SOD1活性或其基因表达水平来评估肾阳虚证的程度和肾脏抗氧化能力的变化。在中医中，肾阳虚通常与肾脏功能减退、内分泌失调、抗氧化能力下降等病理过程相关。肾脏是人体内重要的器官之一，具有调节水液代谢、维持电解质平衡、产生激素等功能。肾阳虚证的出现意味着肾脏功能受损，导致体内阳气不足，进而引发一系列症状和代谢异常。SOD1实验可以通过以下步骤进行：1、组织采集：从动物模型或临床患者中采集肾脏组织样本。2、SOD1活性检测：通过测定肾脏组织中SOD1酶活性来评估抗氧化能力的变化。SOD1酶能够将细胞内超氧阴离子（一种有害的自由基）转化为较为稳定的氧和过氧化氢，从而减轻氧化应激引起的细胞损伤。SOD1活性的下降可能表明肾脏抗氧化能力的降低，与肾阳虚证相关。3、基因表达分析：利用分子生物学技术，如实时定量聚合酶链反应（qPCR）或免疫组织化学方法，测定肾脏组织中SOD1基因的表达水平。SOD1基因的表达水平下降可能意味着肾脏抗氧化能力受损，与肾阳虚证的发生有关。通过SOD1实验原理，可以辅助评估肾阳虚证的程度和肾脏抗氧化能力的变化。然而，需要注意的是，该实验仅为一种辅助诊断手段，综合考虑临床症状、体征以及其他相关检查结果才能综合判断肾阳虚证的存在与程度。此外，SOD1实验在临床应用中仍需进一步研究和验证，以确定其在肾阳虚证诊断和治疗监测中的准确性和可靠性。

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。5. 每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量 反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特 异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。 3. 仪器设置所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为逗BioTeke地，进行逗定量地实验。B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。G. 反应体系的设置：A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。 需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不 同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择逗none地。设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！五、Real-time qPCR数据分析1. Real-time qPCR常见参数基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线 阈值（threshold）自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。 同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。 Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。 2.影响Ct值的关键因素模板浓度模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。反应液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。 PCR反应的效率PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。 3. 如何评估实时定量PCR反应的效果PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。常见问题1. 无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2. Ct值出现过晚（Ct>38）扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。 3. 标准曲线线性关系不佳 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。6. 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断看判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性 如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8. 扩增曲线的异常看比如逗S地型曲线看 参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解 荧光定量PCR问题汇总1. 定量PCR仪的开关机顺序是怎样的看　　按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。　　开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。　　关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。2. 哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用看有何需要注意的地方看 　　　　定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3. 为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理看怎样整理看　 　当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以 分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一 起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。碎片整理的方法如下：　　· 在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(My computer)。　　· 在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。　　· 在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。　　· 单击碎片整理(Defragment)。　　· 当显示逗碎片整理完毕地对话框时，单击（确定）。　　· 在逗本地磁盘属性地对话框中，单击（确定）。　　· 为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。4. 何时执行windows service pack更新看　 　不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。新版本的Microsoft Windows操作系统有可能与SDS 软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行。如果您希望安装service pack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS 软件提供的版本说明，避免兼容性问题。5. 应该备份哪些数据看　　应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下图是校正文件的样本。6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行看　　良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：　　电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。　　通风：仪器的通风应该没有阻挡。　　温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。　　湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。　　空间：易于操作，安全。7. 怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染看怎样清除污染看　　一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。　　另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。清除样本加热块污染的步骤如下：　　用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。　　吹打数次。　　将废液吸入废液杯中。　　重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。 　　确认反应孔中的残留液体蒸发完。8. 什么是背景校正看多长时间执行一次背景校正看 　 　背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收 集的温度为60°C。随后，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数 据中扣除背景信号。 　　因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。9. 什么是纯荧光校正看多长时间校正一次看　纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器逗认识地各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后 每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样 品中的荧光染料种类和信号强度。　　推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎样封膜看　　当使用96孔板做实验的时候，推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。正确的封膜方法是：先沿着96孔板的纵向压膜，然后横向，最后沿着板的边缘按压使之密封。11.使用单管或8连管做实验时，在样品加热块上应该怎样安排放置看　 　使用单管或8连管做实验，并且样本数量不多的时候，建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品，最好是纵向放置，并且优先放在第6列或第7列，然后 逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各个反应管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性.12. 绝对定量与相对定量有什么区别看　　绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。　　举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。 　　绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。 　 　相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为 简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。 　　 CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是。 　　绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。　　相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。13. 定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理看 　　总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。 　 　首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的 荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。 　 　其次，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。 　　第三，计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。14. 标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理看 　　假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用的内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是总RNA的pg数，数据的处理方法见下表：15.什么是CT值比较法看数据怎么处理看　　CT值与起始DNA浓度的对数成反比：　 　如果(1)不同管之间的PCR反应效率相同；(2)这些PCR的反应效率接近100%，可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。　　　　　16. 每个反应管中可以加入多少种探针看 　 每个反应管中可以加入的探针数目，取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。　 　首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下，全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量实际上是没有限制 的。如果信号的采集要通过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，增加探针需要增加或改变滤色片。改动仪器的结构通常很困难。以AB公司的仪器为 例，7900和7700是激光-全波长检测的，7000、7300是4色滤色片的，7500是5色滤色片的。　 　其次是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起，在同一反应管内使用，必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近，既保证信号激发的效率又保证信号不 重叠干扰，能够区分清楚。现已发现的荧光基团种类有限，满足这样条件的分子组合更少。目前的最佳组合只能达到每组4到5种荧光的水平。　 　第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光；TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种 荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用TaqMan MGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高，不做ROX校正（AB公司不推荐这样 做），还可以再多一种荧光用于标记探针。　　第四是研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。　 　最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高数据精确度，二是节省反应成本。同时测定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5种探针，就要同时加 入8-10条引物。在引物设计的时候要考虑到尽量减少这些引物之间的竞争和抑制等多种干扰，平衡各对引物之间的PCR效率。虽然这是可以做到的，但是要花 费大量时间、人力和物力来筛选最佳引物组合、优化反应条件。如果实验规模不大，在总体上可能反而不合算。 　　在实际应用中，不是单纯追求加入的探针越多越好，而是追求总体效益的最优化。比较切合实际的是2到3重反应，引物和探针的设计不太困难，反应条件的优化也不太麻烦，同时降低了成本。17. 等位基因鉴定实验（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不进行ROX荧光校正看不，等位基因鉴定实验也要进行ROX荧光归一，以保证实验结果的精密可靠。　　由于试剂加样操作的误差、离心管热量传递的误差、离心管盖透光性能的误差等偶然因素是不可避免的，必然导致荧光激发效率的差异，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，相互之间才可以比较并保证重现性。 　　这种校正是通过在反应缓冲液中添加ROX校正荧光来实现的。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的高低变化只与上述物理方面变化的总体效应有关。将报告荧光的信号除以ROX荧光的信号，就能够消除所有这些物理因素所引起的数据波动。18. 内标法和外标法哪种数据更精密看是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的 PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它 们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

溶解曲线的意思是：当温度高于扩增产物的TM值时，双链产物变单链，荧光值因为这样的变化而产生变化，根据这一原理，你推算你的体系是是否会在温度变化时产生荧光值的变化，比如你用的是TAQMAN探针，taqman探针产生荧光变化的原理是探针被外切酶活性的TAQ酶剪切断而产生的，那么在只有温度变化的情况下，是没有荧光值变化的，自然就没有溶解曲线了。但是假如你用的分子信标探针或者sybgreen燃料，情况就不同了。

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在很多情况下，我们更需要知道病毒载量，以判断猪群的发病阶段或感染压力。

溶解曲线的意思是：当温度高于扩增产物的TM值时，双链产物变单链，荧光值因为这样的变化而产生变化，根据这一原理，你推算你的体系是是否会在温度变化时产生荧光值的变化，比如你用的是TAQMAN探针，taqman探针产生荧光变化的原理是探针被外

1、百度搜索下载的Bio-Rad CFX Manger3.1软件，下载完毕后安装到你电脑上。2、在电脑上点开Bio-rad-2软件，会出现一系列的文件夹和应用程序扩展以及应用程序之类的，专门找到应用程序里面的BioRadCFXManager。3、点击步骤二中的应用程序。程序开启的速度有点慢，请耐心等待。关掉弹出来的无关窗口，点击File，下拉选择Open，选择横向的Data File，点击Data File，弹出你要选择加进去的QPCR数据文件。4、完成步骤三后会弹出你的QPCR曲线结果图。开始对结果图进行分析。首先点击Quantification那栏，看看QPCR的特征曲线跑得怎么样。用鼠标随意点击上面的一条绿色曲线，就出现相对应的哪个孔的Cq值。5、开始对曲线进行分析。这里的曲线多数分为两大类，分别代表了两种不同的引物的扩增曲线。曲线中另外出现了两条水平的线，一条在0刻度线处，代表该孔未加染料（QPCRmix）；而另一个孔在0-100之间，代表该孔未加模板cDNA，导致无法起峰进入平台期。这两条曲线去掉，不做数据分析。另外跟这两大群主峰的曲线分散比较大的杂曲线，也作为误差较大曲线，数据分析的时候弃掉不用。6、点击MeltCurve，一般有几个引物便会出现几个特征性的主峰。并且大部分曲线都会簇拥在它们的主峰里面。将数据导出来分析要返回到Quantification，在Cq值下面右击，出现Export to excel，点击，即可保存为Excel表格，分为07和03版本。

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。5. 每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量 反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特 异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。 3. 仪器设置所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。G. 反应体系的设置：A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。 需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不 同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”。设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！五、Real-time qPCR数据分析1. Real-time qPCR常见参数基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线 阈值（threshold）自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。 同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。 Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。 2.影响Ct值的关键因素模板浓度模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。反应液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。 PCR反应的效率PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。 3. 如何评估实时定量PCR反应的效果PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。常见问题1. 无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2. Ct值出现过晚（Ct>38）扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。 3. 标准曲线线性关系不佳 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。6. 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性 如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？ 参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解 荧光定量PCR问题汇总1. 定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？　　按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。　　开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。　　关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。2. 哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？ 　　　　定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3. 为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？　 　当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以 分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一 起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。碎片整理的方法如下：　　· 在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(My computer)。　　· 在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。　　· 在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。　　· 单击碎片整理(Defragment)。　　· 当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。　　· 在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。　　· 为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。4. 何时执行windows service pack更新？　 　不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。新版本的Microsoft Windows操作系统有可能与SDS 软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行。如果您希望安装service pack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS 软件提供的版本说明，避免兼容性问题。5. 应该备份哪些数据？　　应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下图是校正文件的样本。6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行？　　良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：　　电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。　　通风：仪器的通风应该没有阻挡。　　温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。　　湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。　　空间：易于操作，安全。7. 怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？　　一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。　　另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。清除样本加热块污染的步骤如下：　　用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。　　吹打数次。　　将废液吸入废液杯中。　　重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。 　　确认反应孔中的残留液体蒸发完。8. 什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？ 　 　背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收 集的温度为60°C。随后，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数 据中扣除背景信号。 　　因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。9. 什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？　纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后 每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样 品中的荧光染料种类和信号强度。　　推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎样封膜？　　当使用96孔板做实验的时候，推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。正确的封膜方法是：先沿着96孔板的纵向压膜，然后横向，最后沿着板的边缘按压使之密封。11.使用单管或8连管做实验时，在样品加热块上应该怎样安排放置？　 　使用单管或8连管做实验，并且样本数量不多的时候，建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品，最好是纵向放置，并且优先放在第6列或第7列，然后 逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各个反应管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性.12. 绝对定量与相对定量有什么区别？　　绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。　　举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。 　　绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。 　 　相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为 简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。 　　 CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是。 　　绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。　　相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。13. 定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理？ 　　总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。 　 　首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的 荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。 　 　其次，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。 　　第三，计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。14. 标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理？ 　　假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用的内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是总RNA的pg数，数据的处理方法见下表：15.什么是CT值比较法？数据怎么处理？　　CT值与起始DNA浓度的对数成反比：　 　如果(1)不同管之间的PCR反应效率相同；(2)这些PCR的反应效率接近100%，可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。　　　　　16. 每个反应管中可以加入多少种探针？ 　 每个反应管中可以加入的探针数目，取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。　 　首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下，全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量实际上是没有限制 的。如果信号的采集要通过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，增加探针需要增加或改变滤色片。改动仪器的结构通常很困难。以AB公司的仪器为 例，7900和7700是激光-全波长检测的，7000、7300是4色滤色片的，7500是5色滤色片的。　 　其次是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起，在同一反应管内使用，必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近，既保证信号激发的效率又保证信号不 重叠干扰，能够区分清楚。现已发现的荧光基团种类有限，满足这样条件的分子组合更少。目前的最佳组合只能达到每组4到5种荧光的水平。　 　第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光；TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种 荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用TaqMan MGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高，不做ROX校正（AB公司不推荐这样 做），还可以再多一种荧光用于标记探针。　　第四是研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。　 　最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高数据精确度，二是节省反应成本。同时测定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5种探针，就要同时加 入8-10条引物。在引物设计的时候要考虑到尽量减少这些引物之间的竞争和抑制等多种干扰，平衡各对引物之间的PCR效率。虽然这是可以做到的，但是要花 费大量时间、人力和物力来筛选最佳引物组合、优化反应条件。如果实验规模不大，在总体上可能反而不合算。 　　在实际应用中，不是单纯追求加入的探针越多越好，而是追求总体效益的最优化。比较切合实际的是2到3重反应，引物和探针的设计不太困难，反应条件的优化也不太麻烦，同时降低了成本。17. 等位基因鉴定实验（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不进行ROX荧光校正？不，等位基因鉴定实验也要进行ROX荧光归一，以保证实验结果的精密可靠。　　由于试剂加样操作的误差、离心管热量传递的误差、离心管盖透光性能的误差等偶然因素是不可避免的，必然导致荧光激发效率的差异，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，相互之间才可以比较并保证重现性。 　　这种校正是通过在反应缓冲液中添加ROX校正荧光来实现的。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的高低变化只与上述物理方面变化的总体效应有关。将报告荧光的信号除以ROX荧光的信号，就能够消除所有这些物理因素所引起的数据波动。18. 内标法和外标法哪种数据更精密？是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的 PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它 们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

方法/步骤11、百度搜索下载免费的Bio-Rad CFX Manger3.1软件，下载完毕后安装到你电脑上。22、在电脑上点开Bio-rad-2软件，会出现一系列的文件夹和应用程序扩展以及应用程序之类的，专门找到应用程序里面的BioRadCFXManager。33、点击步骤二中的应用程序。程序开启的速度有点慢，请耐心等待。关掉弹出来的无关窗口，点击File，下拉选择Open，选择横向的Data File，点击Data File，弹出你要选择加进去的QPCR数据文件。44、完成步骤三后会弹出你的QPCR曲线结果图。开始对结果图进行分析。首先点击Quantification那栏，看看QPCR的特征曲线跑得怎么样。用鼠标随意点击上面的一条绿色曲线，就出现相对应的哪个孔的Cq值。55、开始对曲线进行分析。这里的曲线多数分为两大类，分别代表了两种不同的引物的扩增曲线。曲线中另外出现了两条水平的线，一条在0刻度线处，代表该孔未加染料（QPCR mix）；而另一个孔在0-100之间，代表该孔未加模板cDNA，导致无法起峰进入平台期。这两条曲线去掉，不做数据分析。另外跟这两大群主峰的曲线分散比较大的杂曲线，也作为误差较大曲线，数据分析的时候弃掉不用。66、点击Melt Curve，一般有几个引物便会出现几个特征性的主峰。并且大部分曲线都会簇拥在它们的主峰里面。将数据导出来分析要返回到Quantification，在Cq值下面右击，出现Export to excel，点击，即可保存为Excel表格，分为07和03版本。

1、百度搜索下载免费的Bio-Rad CFX Manger3.1软件，下载完毕后安装到你电脑上。2、在电脑上点开Bio-rad-2软件，会出现一系列的文件夹和应用程序扩展以及应用程序之类的，专门找到应用程序里面的BioRadCFXManager。3、点击步骤二中的应用程序。程序开启的速度有点慢，请耐心等待。关掉弹出来的无关窗口，点击File，下拉选择Open，选择横向的Data File，点击Data File，弹出你要选择加进去的QPCR数据文件。4、完成步骤三后会弹出你的QPCR曲线结果图。开始对结果图进行分析。首先点击Quantification那栏，看看QPCR的特征曲线跑得怎么样。用鼠标随意点击上面的一条绿色曲线，就出现相对应的哪个孔的Cq值。5、开始对曲线进行分析。这里的曲线多数分为两大类，分别代表了两种不同的引物的扩增曲线。曲线中另外出现了两条水平的线，一条在0刻度线处，代表该孔未加染料（QPCRmix）；而另一个孔在0-100之间，代表该孔未加模板cDNA，导致无法起峰进入平台期。这两条曲线去掉，不做数据分析。另外跟这两大群主峰的曲线分散比较大的杂曲线，也作为误差较大曲线，数据分析的时候弃掉不用。6、点击MeltCurve，一般有几个引物便会出现几个特征性的主峰。并且大部分曲线都会簇拥在它们的主峰里面。将数据导出来分析要返回到Quantification，在Cq值下面右击，出现Export to excel，点击，即可保存为Excel表格，分为07和03版本。

原理都不一样，一代测序是双脱氧末端测序，qpcr是荧光探针或染料检测的，两者都会进行扩增但是前者是扩增出不同片段进行电泳的，同时两者都可以检测出突变，缺失

提取三次，那个是生物学重复，甚至应该全程做三遍。提取一次检测三次那个叫技术重复 样本的采集可能是实验变异的第一个来源，特别是RNA实验，因为mRNA的特性易被样本的采集和处理而不稳定。建议新鲜组织可以保存在冰块中，这对RNA的质量和浓度没有多大的影响，但是虽然这种保存方法对一些mRNA和组织是有效的，它也不可能普遍应用。因此在样本采集时应当谨慎。由此应详细记录组织样本的采集以及是否及时处理等信息。如果样本没有及时处理，必须记录是如何保存的，以及在什么情况下保存了多长时间。样本的简要说明也是必不可少的。例如一个肿瘤样本的显微镜镜检可以发现样本由肿瘤细胞组成的比例，这些信息也需要报道。核酸的提取是第二个关键步骤。提取效率取决于足够的同质化，样本的类型(如原位组织和培养组织)，样本密度，生理状态(如健康、癌症或者坏死)，基因复杂性，以及处理量。因此必须记录核酸取方法的细节，以及检测核酸浓度和评估质量的方法。这些细节对从新鲜冰冻显微切割标本中提取RNA特别重要，因为组织提取过程对RNA的数量和质量影响很大。

显然用荧光定量PCR（qPCR）。mRNA荧光差异显示技术是在qPCR技术广泛应用之前，比较mRNA水平上基因表达差异的一种方法，可以说已经过时了，尤其是在你有条件做qPCR的情况下。mRNA荧光差异显示技术的前几步就是用Oligo dT做总mRNA逆转录，转成cDNA后，用特异性带荧光标记的引物扩增目标DNA，测定表达水平。其实qPCR的原理与之基本一致，只是在测量荧光表达时用机器定量测定，更加准确。

1-2天。定量逆转录PCR是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法，所需要的时间会长一些能达到1~2天，确保实验效果更加准确。

数字PCR因为灵敏度高、绝对定量、适合医院操作等优点，在肿瘤液体活检、无创产前筛查、感染性疾病早期诊断等临床应用方面具有显著优势。而qPCR适用于较常规的临床分子诊断项目。瞬渺光电为您的PCR仪器光路部分提供更低噪声稳定型激光，为仪器带来更好的表现，详询payne@rayscience.com

qpcr仪关闭之前数据找回，方法如下：1、要想恢复未保存的qpcr仪器的文档，首先要做的事情就是开启qpcr仪器的文件自动保存文档功能，且将保存文档时间间隔设置小一些，这样就可以最大化避免文档内容的丢失。具体操作方法：点击“Office按钮”，从其扩展菜单中选择“qpcr仪器的文件选项”。2、在打开的“qpcr仪器的文件选项”窗口中，切换到“保存”选项卡，勾选“保存自动恢复信息时间间隔”项，同时设置时间间隔，在此小编设置为“3分钟”，可以根据实际情况来进行设置。3、设置“自动恢复文档位置”，建议使用自定义位置，这样方便因非法操作或断电时及时恢复文件。点击“浏览”按钮就可以定位到自定义位置。点击“确定”完成设置。4、以后当编辑文档时，必须确保至少保存一次，原因在于通过首次保存可以确定文档名称，这样就为qpcr仪器的文件的恢复操作坚定了基础。5、最后来测试一下：创建一个新的qpcr仪器的文件，输入部分内容，点击“保存”或“另存为”将该文档进行保存。6、接下来再输入一些内容，并等待“时间间隔”所设置的最小时间，即等待3分钟以上。7、然后模拟断电或程序非法操作而退出：右击任务栏，选择“启用任务管理器”。8、在打开的“Windows任务管理器”窗口中，切换至“应用程序”选项卡，选中当前正常编辑的qpcr仪器的文件，点击“任务结束”按钮。9、然后再次打开之前保存的文档，则会自动弹出“文档恢复”窗口，点击要恢复的文档，就会发现丢失的内容被找回来啦。10、当然，也可以通过之前所设置的“Excel文件自动恢复”目录中恢复未保存的文档。找到要恢复的文档，直接使用qpcr仪器程序打开即可。

一般1-2天出结果。定量逆转录PCR是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。