牛云-
在T.reesei纤维素酶中，O-甘露糖基化频繁发生，Kruszewska等（1989）详细研究了其生物合成过程。真菌的O-甘露糖基化是一种独特现象，因为需要长醇磷酸盐（Dolichol Phosphate，DP）的参与，并且在内质网上启动（Herscovics et al.，1993；Tanner et al.，1987）。反应发生的顺序及参与的酶类列表于11.3。DPM合成酶是糖基化途径中的一个关键酶，还是肌醇锚定物生物合成所需要的一种重要酶，在T.reesei中过表达该酶编码基因dpm1，能够刺激酶活性并提高T.reesei蛋白分泌水平（Kruszewska et al.，1999），它催化甘露糖从GDP-Man转移到脂类受体（DP）的反应，此时即合成甘露糖磷酸长醇（manno-sylphosphodolichol，DPM）。
在体外，第一个转移到丝氨酸或蛋氨酸残基的甘露糖，其供体为DPM，此时其构象发生反转（Tanner et al.，1987）。Pmt1基因是编码DPM：：蛋白质O-甘露糖基转移酶的一个基因，Strahl-Bolsinger等（1993）已经克隆到该基因。基因敲除能够使体外甘露糖基转移酶活性全部丧失，用DPM作为供体，用一种肽作为受体，检测不到转移酶活性。在进行敲除菌株的活体检测时发现，蛋白质的O-甘露糖基化只下降了大约40%～50%。研究人员推测其中还有另外的转移酶参与，而这种转移酶在体外活性分析时不能被检测到。Lussier等（1995）曾经报道了一个pmt2基因，编码的蛋白质与DPM：：蛋白质O-甘露糖基转移酶高度相似。
图11.2 A.oryzae的β-半乳糖苷酶中N-连接碳水化合物的结构（左，Nakao et al.，1987）及A.niger葡萄糖氧化酶中N-连接碳水化合物的结构（中、右，Takegawa et al.，1991）
带有破坏的pmt2基因的酵母，其O-甘露糖基化活性在体内和体外检测时都下降，与带有丧失功能的pmt1基因的突变体相似。pmt1/pmt2 基因都被破坏的菌株，生长严重受阻，但残存一部分O-甘露糖基化活性。研究人员由此推断还应该存在另外一种PMT蛋白质。第二个及随后的甘露糖直接从GDPMan转移（Tanner et al.，1987）。在S.cerevisiae SEC18突变体中，从内质网向高尔基体的转移被阻断，经过对该突变体O-甘露糖基化活性的测定结果，认为第一个和第二个甘露糖残基是在内质网中被添加上的（Kuranda et al.，1991；Tanner et al.，1987）。后一种情况需要重新确认，因为还没有证据能够证明GDPMan能够转移到内质网腔中。O-连接的聚糖链的延长过程发生在高尔基体中（Hersco-vics et al.，1993）。
在T.reesei中，蛋白质的O-甘露糖基化能够在体外试验中检测到（图11.3）（Krusze-wska et al.，1989）：T.reesei QM9414的一个40000×g离心沉降的细胞膜组分能够将甘露糖残基从［14C］-GDP-Man转移到内源脂类和蛋白质分子上，两种反应都依赖于外源长醇磷酸酯的加入。这种结果与其他人的结论相符合，即T.reesei QM9414的细胞膜组分负责内源蛋白质受体的O-甘露糖基化。蛋白质糖基化的体外动力学研究表明，甘露糖基-脂类的形成在前，糖基团向蛋白质的转移发生在后。这与甘露糖向蛋白质转移时需要脂类中间体作为媒介的看法一致，目前认为这种媒介是甘露糖基磷酸长醇酯（DPM）。利用冷冻GDP-Man进行脉冲跟踪试验，以及利用津枝霉素（Tsushimycin，一种特异性DPM-合成酶抑制剂）进行的研究进一步证实了以上结论（Elbein，1981），津枝霉素阻断了［U-14C］-甘露糖加入脂类分子和蛋白质分子的过程。以上研究结果都表明，脂类媒介为DPM，通过该媒介物质，蛋白质的O-甘露糖基化反应才能启动。
图11.3 Trichoderma reesei中O-连接寡糖的体外生物合成
注：第一个甘露糖残基由DolPMan提供，后续的甘露糖残基转移自GDPMan
在体外，［U-14C］甘露糖自DPM转移到内源性膜蛋白。大约90%的转移到蛋白质的［U-14C］甘露糖，能够通过微碱性处理（β-消除）释放。TLC分析表明，释放的寡糖中含有O-型甘露单糖、甘露三糖和甘露四糖。Kruszewska等（1989）在利用乳糖生长的木霉中，发现DPM合成酶的活性提高了2.5倍。以上结果表明，在碳源代谢物解阻遏条件下（乳糖作为碳源），菌丝中的内源性糖基团转移速率高，而在阻遏条件下（葡萄糖作为碳源），菌丝中的内源性糖基团转移速率低。在测定体系中加入过量的冷冻GDP-Man，观察不到以上这种差异，说明碳源代谢物阻遏的菌丝中含有低浓度的DPM或者GDP-Man（Kruszewska，1991）。
在T.reesei突变体中DPM合成酶的糖基化水平与母本菌株相似，但是蛋白的分泌水平能提高7倍。O-糖基化在蛋白分泌过程中有至关重要的作用（Kubicek et al.，1987 b；Messner et al.，1988），在T.reesei中O-糖基化需要长醇磷酸作为甘露糖残基的载体。甘露糖转移酶将长醇磷酸甘露糖（DPM）产生的第一个甘露糖残基转运到丝氨酸或苏氨酸的OH基团上。缺失GDP-甘露糖或长醇磷酸能降低DPM的产量，限制N-糖基化和O-糖基化和肌醇锚定物合成。目前已经发现在T.reesei中有少量长醇（约6mg/kg）（Jung et al.，1973），但远远低于人类活体组织中长醇量（452mg/kg）（Chojnacki et al.，1988）。
长醇是在甲羟戊酸途径中合成，具有一个饱和异戊二烯单位的长链聚戊烯醇。Cis-异戊烯转移酶（脱氢长醇二磷酸合成酶）（Cis-PT）是长醇合成中的一个关键酶，是肌醇合成途径的多萜醇分支的第一个酶。它能催化异戊烯二磷酸（IPP）结合到法尼西基二磷酸（FPP）上，使多萜醇链不断延伸（Adair et al.，1987；Daleo et al.，1977；Szkopijska et al.，1996）。酵母中Cis-PT的编码基因是rer2和srt1（Sato et al.，2001；Shenk et al.，2001）。
Perlińska-Lenart等（2006b）将酵母中编码Cis-PT的基因rer2与来自曲霉的启动子gpdA相连，转化到 T.reesei QM9414中，经筛选培养基筛选，再经 Southern 验证，获得100余个突变体。在以乳糖为碳源的培养条件下，经检测发现其中两个稳定的突变体（ULJK09/04和ULJK21/04）中rer2的转录水平很高。与母本菌株相比，HPLC分析结果显示，突变体ULJK21/04和ULJK09/04的多萜醇含量分别提高了50%，260%。令人吃惊的是在突变体中rer2p缺失了14～17个异戊二烯单元。这一发现说明T.reesei中存在相关调控机制，在长醇链达到一定长度后延伸终止，Cis-PT蛋白不具备此重要功能（Sato et al.，2001）。同时发现突变体中dpm1 基因的表达水平在菌丝生长的早期阶段达到最高，提高了约220%，而在生长240h后明显下降。突变体ULJK09/04和ULJK21/04细胞膜中DPMS活性则分别提高了50%，55%。这说明：在T.reesei中过表达编码核苷酸转移酶基因mpg1会影响dpm1转录与DPMS活性。
一方面，由于糖基化发生在蛋白分泌之前，提高糖基化效率有助于加速蛋白折叠，从而加快蛋白的分泌。酵母dpm1基因在T.reesei中过表达加快了糖基化，从而加剧了蛋白分泌（Kruszewska et al.，1999）。另一方面，尽管在T.reesei中过表达mpg1，导致核苷酸转移酶活性提高，分泌蛋白被过度糖基化，但是并未减少分泌蛋白的产量（Zakrzewska et al.，2003），而且还提高了dpm1基因的表达水平，DPMS活性提高了30%。
在菌株培养过程中检测蛋白数量，发现突变体和母本菌株均在培养至216h时蛋白数量达到最大，随后开始下降。但在蛋白糖基化水平上突变体和母本菌株之间差别十分明显，突变体分泌的蛋白O-聚糖上的碳水化合物丰度是母本菌株的两倍。糖类在供试菌株培养过程中不断下降。N-聚糖上的碳水化合物浓度最高峰出现时间晚于O-聚糖上的碳水化合物，培养144h后突变体中N-聚糖上的碳水化合物浓度达到高峰，与突变体相比，母本菌株中的N-聚糖上的碳水化合物浓度较低，随后所有菌株中的N-聚糖上的碳水化合物含量均开始下降。这与前人的研究一致（Ecker et al.，2003）。说明O-糖基化阻挡了N-糖基化，O-糖基化比N-糖基化发生早。
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