ELISA 双抗体夹心法为什么加2次抗体

需要温育2次。双抗体夹心法原理：①将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗涤一次；②加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，然后把多余抗体洗除；③加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体，使形成“夹心”；④加入该酶的底物，若看到有色的酶解产物产生，说明在孔壁上存在相应的抗原。如图所示

摘要：免疫诊断作为体外诊断的一大类，它的平台和方法有多种多样，不过一般基于相同或相似的原理，主要有五种原理。免疫诊断五大原理分别是双抗体夹心、双抗原夹心、间接检测抗体、竞争检测和捕获包被。免疫诊断具有特异性强、灵敏度高、简便、快速、安全等特点，因此应用广泛。下面一起来了解一下免疫诊断原理有哪几种吧。一、免疫诊断原理有哪几种免疫诊断是应用免疫学的理论、技术和方法诊断各种疾病和测定免疫状态的诊断方法，目前免疫诊断的平台和方法有多种多样，但是都基于相同或相似的原理，主要有五大基本原理：1、双抗体夹心（1）原理：双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，双抗体夹心法适用于测定拥有至少两个表位的大分子抗原。不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，不能形成两位点夹心。（2）应用场景：绝大多数检测蛋白都可以使用双抗体夹心法。有些抗体检测项目，如总IgE检测。（3）注意事宜：在一步法，待测抗原与标记抗体一起加入反应中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原会分别和固相包被抗体及标记抗体结合，不会形成“夹心复合物”就出现钩状效应，导致结果偏低或者甚至可出现假阴性结果。2、双抗原夹心（1）原理：双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和标记。有研究表明，双抗原夹心法检测抗体的灵敏度和准确性要抗体检测使用的间接法（检测抗体更为常用的一种方法）。（2）应用场景：理论上，检测抗体的项目均可使用，如乙肝表面蛋白抗体检测。待检抗体IgG的两个Fab需要分别同固相包被抗原和标记抗原同时结合。（3）注意事宜：抗原标记过程可能导致蛋白构象变化，需要寻找最适合的标记物和标记方法。3、间接法（1）原理：间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用标记的抗抗体，俗称二抗，来检测与固相包被抗原结合的受检抗体。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。（2）应用场景：所有的IgG抗体检测都可以使用。如新冠血清IgG检测。（3）注意事宜：本方法的优点是只要变换包被抗原的种类就可利用同一标记抗抗体（二抗）建立检测相应抗体的方法。4、竞争法（1）原理：当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个表位供包被和检测抗体同时识别结合，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。由于物质的相互作用或者结合是相对动态平衡的过程，一旦样本中存在待检测物，样品中的待检测物会同试剂中的标记物去竞争结合包被物。这样就会导致原来结合在一起的包被物和标记物分离，使原本饱满的信号值进行降低。信号降低的程度同待检测物的浓度成正相关。（2）应用场景：小分子抗原或半抗原，如激素检测，雌二醇，睾酮；甲状腺功能检测，T4，T3等。（3）注意事宜：竞争法中，有些待检测物分子特别小，很难制备或找到适合使用的抗体，而且生理条件下可以同其他蛋白结合，那么可以使用该分子的结合蛋白来代替抗体实现。如，25OH-Vd检测，可使用25OH-Vd特异性抗体，也可使用Vd结合蛋白。5、捕获法（反向间接法）（1）原理：捕获包被法，又称为反向间接法，采用抗抗体（二抗）包被，抗原进行标记的检测方法。以目前常用的IgM测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，则后者可干扰IgM的测定。因此先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。（2）应用场景：IgM测定最为常见，特定过敏原IgE检测。（3）注意事宜：IgM型类风湿因子（RF）的干扰，IgE型类风湿因子相对较少。二、免疫诊断有什么特点1、特异性强，不出现交叉反应，不出现假阳性，可保证诊断的准确性。2、灵敏度高，能测出微量反应物质和轻微的异常变化，有利于早期诊断和排除可疑病例。3、简便、快速、安全。

不直接标记一抗而标记二抗，这是从生产成本上考虑的。二抗大部分是通用的，标记一次可以大量标记，比如10ml或者更多的浓缩液，可以生产上千上万的试剂盒。一次检测就行了而一抗种类很多，量少，如果标记一抗，比较费事。次次得检测（标记完得检测）。HRP标记不是很简单的事科研用的试剂盒。单品销售量很小的，不值当。但临床上的ELISA试剂盒是直接标记在一抗上的，他们量大。这样也用着简单。还有一个，科研试剂盒也不一定用的酶标二抗，有的是生物素放大系统，这样提离灵敏度。

【答案】：B双抗体夹心法的原理是利用连接于固相载体上的抗体（未标记）和酶标抗体可分别与样品中被检测抗原分子上2个不同抗原表位结合，形成固相抗体和酶标抗体免疫复合物。

简单地说一下：固相抗原吸附载体+血清（抗体）+酶结合物（抗原）= 抗原*抗体*抗原复合物；抗原*抗体*抗原复合物+辣根过物氧化酶《过氧化氢催化》=蓝色络合物。因为抗体多数是2价（Igm是5价），具有两个结合部位，所以可以结合2个抗原

竞争法一般用于检测无法同时与两种抗体结合的小分子抗原，其原理为：将针对小分子抗原的抗体包被在酶标板上，检测时加入待测样本，使样本中的待测抗原与酶标板上的抗体结合。然后加入HRP酶标记的抗原，此抗原也可与酶标板上的抗体结合，由于酶标板上固著的抗体数量有限，因此当样本中抗原的量越多，则HRP酶标记抗原可结合的包被抗体就越少，两种抗原竞争结合包被抗体，所以称为竞争法。接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，当样本中抗原量越多，代表酶标板孔内留下的HRP标记抗原越少，显色也就越浅。百特纯大分子Meretciel的测激素的ELISA试剂盒有些就是竞争法的。夹心法又叫双抗夹心法，用于检测较大分子的抗原或抗体，又分为：双抗体夹心法，用于检抗原；和双抗原夹心法用于检抗体。以双抗体夹心法为主，下面以双抗体夹心法为例讲解原理（双抗原夹心法类似）：首先将具有专一性之抗体包被（coating）于酶标板上，检测时加入待测样本，样本中若含有待测抗原，则会与酶标板上包被的抗体专一性结合，然后加入另一种针对待检抗原的抗体，通常称为检测抗体，包被抗体和检测抗体将抗原夹在中间所以叫双抗夹心。检测抗体通常带有HRP酶标记，接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，样本中抗原量越多则显色越深。现在很多ELISA试剂盒生产厂家比如：优尔生和百特纯大分子Meretciel将生物素-亲和素放大系统引入双抗夹心法，也就是在检测抗体上标记生物素，然后加入HRP酶标记的亲和素（或链亲和素），利用亲和素可以和生物素分子紧密结合的特性，将HRP酶连接到检抗上，接着加入底物显色。也有引入二抗的，如下图，检测抗体不标记，再加入HRP标记的二抗与检测抗体结合

正确答案:A解析：ELISA双抗体夹心法检测抗原是利用包被在固相载体上的抗体和待测抗原结合，然后待测抗原与酶标记的抗体结合形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物来检测的。

双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。那么，为什么双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法?1、将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2、加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。 洗涤除去其他未结合物质。3、加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合 的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4、 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。

　　ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。　　(一) 原理　　ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。　　(二) 操作步骤　　方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:　　1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。　　2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。　　3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。　　4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。　　5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。　　6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。　　方法二 用于检测未知抗体的间接法：　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，　　每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。　　↓　　加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔　　中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)　　↓　　于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，　　37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。　　↓　　其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。　　(三) 试剂器材　　1. 试剂　　(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):　　NaCO3 1.59克　　NaHCO3 2.93克　　加蒸馏水至1000ml　　(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M　　KH2PO4 0.2克　　Na2HPO4·12H2O 2.9克　　NaCl 8.0克　　KCl 0.2克　　Tween-20 0.05％ 0.5ml　　加蒸馏水至1000ml　　(3) 稀释液：　　牛血清白蛋白(BSA) 0.1克　　加洗涤缓冲液至100ml　　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。　　(4) 终止液(2M H2SO4）：　　蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。　　(5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):　　0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml　　0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml　　加蒸馏水50ml。　　(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:　　TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml　　底物缓冲液(PH5.5) 10ml　　0.75％H2O2 32μl　　(7) ABTS使用液:　　ABTS 0.5mg　　底物缓冲液(PH5.5) 1ml　　3％H2O2 2μl　　(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。　　(9) 正常人血清和阳性对照血清。　　2. 器材:　　(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。　　(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。　　(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。　　(四) 注意事项　　1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。　　2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:　　(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。　　（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。　　(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。　　(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

双抗体夹心的意思是包被抗体-检测抗原-酶标抗体形成夹心结构。至于是单抗或者多抗都可以。如果是酶标二抗（二抗就是抗抗体）的话，一般是包被抗原-抗体-酶标二抗，这种是间接法的

将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面。双抗体夹心法，其基本原理是将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待检标本，通过加入检测抗体，酶标记第二抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。ELISA是以体外抗原抗体反应为基础，将抗原抗体特异性反应与酶的高效催化作用相结合的一种检测方法，灵敏度可达皮克(pg/mL)水平。它是目前商业应用最为成熟的免疫分析方法之一，在医学实验、临床诊断、生物制药方面的运用也极为广泛。目前，常见的ELISA类型有四种：双抗夹心法、直接法、间接法和竞争法。

免疫传感器中竞争法和夹心法的响应原理不同。根据查询相关公开信息显示，竞争法是一种免疫传感技术，它通过将受体和抗体在一起竞争来检测特定的抗原分子。而夹心法是一种免疫检测技术，它将受体和抗体分别融入夹心状的膜里形成双重夹心系统。

竞争法一般用于检测无法同时与两种抗体结合的小分子抗原，其原理为： 将针对小分子抗原的抗体包被在酶标板上，检测时加入待测样本，使样本中的待测抗原与酶标板上的抗体结合，然后加入HRP酶标记的抗原，此抗原也可与酶标板上的抗体结合，由于酶标板上固著的抗体数量有限，因此当样本中抗原的量越多，则HRP酶标记抗原可结合的包被抗体就越少，两种抗原竞争结合包被抗体，所以称为竞争法，接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，当样本中抗原量越多，代表酶标板孔内留下的HRP标记抗原越少，显色也就越浅； 夹心法又叫双抗夹心法，用于检测较大分子的抗原或抗体，又分为：双抗体夹心法，用于检抗原；和双抗原夹心法用于检抗体。

1、间接法是检测抗体最常用的方法 。将已知抗原吸附于固相载体上，形成固相抗原，用酶标记抗抗体（酶标抗人球蛋白），检测标本中的抗体。2、ELISA双抗体夹心法将已知抗体包被于固相载体，加入待检标本和酶标抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体的夹心式复合物，加入底物显色，颜色深浅与待测抗原成正比。间接法测抗体基本原理：将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗(针对案检抗体的抗体，如羊抗人ICG抗体)。与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相杭原-受检抗体-酶栝二抗复合物，测定加底物后的显色程度，测定待测抗体含量。使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

所谓双抗体夹心法就是指，两种抗体包裹待测抗原，通过酶标记标示出来经过显色后读出具体的数据最终计算出浓度的方法，铺板（多抗体）—样本（待测抗原）—结合物（单抗）—显色—终止—读数进行计算。

1.双抗体夹心法属于非竞争结合试验。2.固相载体和酶标记物均与被检测物的两个以上抗原表位结合，形成抗体抗原酶标抗体复合物，特异性强。3.适用于多加抗原检测。4.OD值可反应抗原含量。

简单地说一下：固相抗原吸附载体 + 血清（抗体）+ 酶结合物（抗原） = 抗原*抗体*抗原复合物；抗原*抗体*抗原复合物 + 辣根过物氧化酶 《过氧化氢催化》 = 蓝色络合物.因为抗体多数是2价（Igm是5价）,具有两个结合部位,所以可以结合2个抗原

【答案】：AELISA双抗体夹心法检测抗原是利用包被在固相载体上的抗体和待测抗原结合，然后待测抗原与酶标记的抗体结合形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物来检测的。

简单地说一下：固相抗原吸附载体+血清（抗体）+酶结合物（抗原）= 抗原*抗体*抗原复合物；抗原*抗体*抗原复合物+辣根过物氧化酶《过氧化氢催化》=蓝色络合物。因为抗体多数是2价（Igm是5价），具有两个结合部位，所以可以结合2个抗原

摘要：免疫诊断作为体外诊断的一大类，它的平台和方法有多种多样，不过一般基于相同或相似的原理，主要有五种原理。免疫诊断五大原理分别是双抗体夹心、双抗原夹心、间接检测抗体、竞争检测和捕获包被。免疫诊断具有特异性强、灵敏度高、简便、快速、安全等特点，因此应用广泛。下面一起来了解一下免疫诊断原理有哪几种吧。一、免疫诊断原理有哪几种免疫诊断是应用免疫学的理论、技术和方法诊断各种疾病和测定免疫状态的诊断方法，目前免疫诊断的平台和方法有多种多样，但是都基于相同或相似的原理，主要有五大基本原理：1、双抗体夹心（1）原理：双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，双抗体夹心法适用于测定拥有至少两个表位的大分子抗原。不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，不能形成两位点夹心。（2）应用场景：绝大多数检测蛋白都可以使用双抗体夹心法。有些抗体检测项目，如总IgE检测。（3）注意事宜：在一步法，待测抗原与标记抗体一起加入反应中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原会分别和固相包被抗体及标记抗体结合，不会形成“夹心复合物”就出现钩状效应，导致结果偏低或者甚至可出现假阴性结果。2、双抗原夹心（1）原理：双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和标记。有研究表明，双抗原夹心法检测抗体的灵敏度和准确性要抗体检测使用的间接法（检测抗体更为常用的一种方法）。（2）应用场景：理论上，检测抗体的项目均可使用，如乙肝表面蛋白抗体检测。待检抗体IgG的两个Fab需要分别同固相包被抗原和标记抗原同时结合。（3）注意事宜：抗原标记过程可能导致蛋白构象变化，需要寻找最适合的标记物和标记方法。3、间接法（1）原理：间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用标记的抗抗体，俗称二抗，来检测与固相包被抗原结合的受检抗体。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。（2）应用场景：所有的IgG抗体检测都可以使用。如新冠血清IgG检测。（3）注意事宜：本方法的优点是只要变换包被抗原的种类就可利用同一标记抗抗体（二抗）建立检测相应抗体的方法。4、竞争法（1）原理：当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个表位供包被和检测抗体同时识别结合，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。由于物质的相互作用或者结合是相对动态平衡的过程，一旦样本中存在待检测物，样品中的待检测物会同试剂中的标记物去竞争结合包被物。这样就会导致原来结合在一起的包被物和标记物分离，使原本饱满的信号值进行降低。信号降低的程度同待检测物的浓度成正相关。（2）应用场景：小分子抗原或半抗原，如激素检测，雌二醇，睾酮；甲状腺功能检测，T4，T3等。（3）注意事宜：竞争法中，有些待检测物分子特别小，很难制备或找到适合使用的抗体，而且生理条件下可以同其他蛋白结合，那么可以使用该分子的结合蛋白来代替抗体实现。如，25OH-Vd检测，可使用25OH-Vd特异性抗体，也可使用Vd结合蛋白。5、捕获法（反向间接法）（1）原理：捕获包被法，又称为反向间接法，采用抗抗体（二抗）包被，抗原进行标记的检测方法。以目前常用的IgM测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，则后者可干扰IgM的测定。因此先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。（2）应用场景：IgM测定最为常见，特定过敏原IgE检测。（3）注意事宜：IgM型类风湿因子（RF）的干扰，IgE型类风湿因子相对较少。二、免疫诊断有什么特点1、特异性强，不出现交叉反应，不出现假阳性，可保证诊断的准确性。2、灵敏度高，能测出微量反应物质和轻微的异常变化，有利于早期诊断和排除可疑病例。3、简便、快速、安全。

（1）酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）：是将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。（2）夹心法（sandwichassay）:将已知的特异抗体包装在固相载体（塑料板凹孔或纸片上），加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。　　间接法（indirecrELISA）常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本（可能含有相应抗体），再加入酶标抗Ig的抗全（即第二抗体），经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。（3）BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素（avidin）分子可以结合4个生物素分子（biotin）。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统（biotinavidinsystem-ELISA,BAS-ELISA），它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。

（1）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）：是将抗原或抗体吸附在固相载体表面。使抗原抗体反应在固相载体表面进行。可用间接法、双抗体夹心法或竞争法测定抗原或抗体。（2）夹心法（sandwich assay）:将已知的特异抗体包装在固相载体（塑料板凹孔或纸片上），加入待检标本，标本中的抗原即可与载体上的抗原结合，洗去未结合的材料后加入该抗原的酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加底物显色，用酶免疫检测仪测量颜色的光密度，可定量测定抗原。　　间接法（indirecr ELISA）常用于检查特异抗体。先将已知特异抗原包被固相载体，加入待检标本（可能含有相应抗体），再加入酶标抗Ig的抗全（即第二抗体），经加底物显色后，根据颜色的光密度计算出标本中抗体的含量。（3）BAS-ELISA：近年来对酶免设分析法的改进是使用生物素-亲合素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一新的生物放大系统进一步提高检测的敏感度。可用来检测多种抗原抗体系统如细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。一个亲合素（avidin）分子可以结合4个生物素分子（biotin）。结合非常稳定。亲合素和生物素都可与抗全、酶、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲合素。因此大提高检测的敏感度。目前应用生物-酶标亲合素系统（biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA），它是通过生物素标记抗体连接免疫反应系统，同时借助生物素化酶或酶标亲合素引入酶与底物反应系统。

1）将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2） 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物. 洗涤除去其他未结合物质. 3） 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合 的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4） 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量. 在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、 AFP、hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合 物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动 物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相 载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标 抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标 抗体结合,而不再形成夹心复合物.类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应 后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的 吸光值相同（参见1.3.2,图1-4）,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现 象被称为钩状效应（hook effect）,因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重 时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常 增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时,应注意可测范围的最高值.用 高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可 用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型 问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应 性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F（ab"）或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰. 双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标. 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心.

ELISA酶联免疫吸附实验1.原理：免疫分析是一种利用特定抗体与抗原或半抗原发生的高选择性高特异性识别和结合原理，对待测抗体或者抗原进行分析测定的方法，酶联免疫吸附分析（下称ELISA）是免疫分析的一种，分三个部分组成：免疫识别，信号输出和数据处理。2.步骤：免疫识别是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗体，而后利用抗体识别待测的抗原（通常是疾病的蛋白质生物标记物，病毒，细菌等等，从复杂待测液中将抗原吸附到96孔板表面。接着用带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、荧光或放射性标记的抗体通过直接或者间接的方式输出识别信号。最后利用信号强度，标准样品浓度梯度等信息计算得出待测样中目标抗原的浓度。3.分类：根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等等。其中双抗体夹心法在商业应用上最常见。双抗体夹心法：①：抗体包被 在96孔板上包被抗体。由于酶标板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯环与抗体的氨基酸残基具有类似π-π堆积作用的引力，结合静电和疏水作用，可以将抗体吸附于其表面。然后，将未吸附的抗体用缓冲液清洗后，加入含有明胶或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分。加入封闭液的目的，是防止其他蛋白因静电或疏水作用吸附在96孔板上，造成假阳性信号，干扰后续实验的进行。②：免疫识别 在96孔板上包被抗体后，加入待测样，并在37°C环境下孵育一段时间，通常是1-2小时。此时酶标板上的抗体与待测抗原进行特异性识别结合。此处抗体的质量是关键，好的抗体既能特异性高效地结合抗原又不受待测样中其他生物大分子、蛋白质和无机盐等成分的影响。③：洗板 将未结合的抗原洗掉，加入该抗原所对应的识别抗体并在37°C下继续培养1-2小时，接着将未连接上抗原的抗体洗掉。④：酶标信号输出 加入带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的酶标二抗，用于和标准抗体结合。在培养30分钟后洗掉未连接的二抗，并加入显色剂显色。根据显色的结果判断抗原的浓度。一般认为，抗原浓度与显色后的发光强度呈正相关。免疫竞争法以抗原竞争抗体为例，在上述免疫夹心法操作步骤的第二步加入待测抗原后，立刻加入酶标抗原，使之与待测抗原竞争识别酶标板上的抗体。当待测抗原浓度越高，能够连上酶标板上抗体的酶标抗体就越少，输出的信号就越少。这样待测样浓度与酶显色信号就呈逆相关。

你可以扩大包板范围，选用4倍稀释，选择3个浓度来包被，如1ug，4ug，16ug来包被，检抗可以选择4个，1：1000，1：2000，1：4000，1：8000.在根据你滴定的结果确定具体的包被浓度和检抗的稀释范围。

代那

（一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 （五）捕获法测IgM抗体 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 （六）应用亲和素和生物素的ELISA 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。 亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号

但在包被是要确定包被抗体的最佳浓度，请问怎么确定？ 我对于elisa试剂盒不是很了解，我是做化学发光试剂盒的。只能给你一个参考的数值，具体的还要

微孔板嘉兴驾照发工作的原理就是在那种他一种这种vv孔板吧，如果孟佳欣的这种

ELISA的最基本的要求是：抗原或抗体的固相化、抗原或抗体的酶标记和底物系统。既然是双抗体夹心法，就必须把抗体进行包被，加以酶标记的抗体，才能形成夹心，用于检测抗原。

1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。 洗涤除去其他未结合物质。 3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合 的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、 AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合 物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动 物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相 载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标 抗体一起保温反应，作一步检测。 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标 抗体结合，而不再形成夹心复合物。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应 后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的 吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现 象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重 时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常 增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用 高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可 用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型 问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应 性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab"）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。 双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

洗涤主要作用是想去掉多余的未结合的物质，以免对后续的反应产生不良影响。抗原和二抗是一起加到溶液体系中去的，当抗原抗体的比例不是刚好合适的时候，就会出现钩状效应，抗体过量为前钩，抗原过量为后钩，两者均会导致检测结果不准确。两步法，每次只加入一种成分，每次都只加入一种，当孵育完成过后用洗液洗去未结合的物质，以保证不会对下一步的反应产生干扰。抗体：抗体（antibody）是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它（免疫球蛋白不仅仅只是抗体）是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。

双抗体夹心法：(1) 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。(2) 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。(3) 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。(4) 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。(5) 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。(6) 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

　　随着社会的发展，很多的年轻人会在没有结婚的时候就发生性行为，如果防护措施没有做好，女性就有可能怀孕。这个时候早孕试纸就发挥作用了，但是很多人对于早孕试纸测试的结果是看不懂的。就比如说，早孕试纸秒红和慢慢变红的区别是什么呢? 早孕试纸秒红和慢慢变红的区别是什么 　　如果把早孕试纸放到尿液中，看到它出现了两条红杠，代表着你怀孕了，但是并不能通过早孕试纸来推测出HCG是多少，如果想知道自己的HCG值，可以过两天去医院检测一个血HCG，另外还要做一个b超，看看自己是宫内孕还是宫外孕，如果是宫外孕需要及时治疗。 　　现在人们大多都是通过早孕试纸测试怀孕的，这种方法比较简单，而且不用去医院，出结果也是比较快的。但是使用试纸好很容易出现一些人们不明白的情况，所以准确性也不是好把握的。有时候试纸会秒红， 　　考虑怀孕的可能性较大，建议多测试几次比较好。如果没有什么不适，观察几天后应该去正规医院做b超检查和血hcg检查，如果有什么不适，随时去医院就诊。试纸只是参考是否怀孕的，有一定的准确性，建议测试的时候使用晨尿验孕比较好，结果是比较准确的。 　　用试纸测的方法一般说明书上都有写的，建议在月经推迟后的十天进行测试，在尿液中大概10秒的时间之后拿出，如果是只有一条手持端的红线说明还是阴性，如果两条红线而且下面的一条红线比对比线颜色还要深说明是在24小时左右排卵了。建议测试的时候不要喝太多的水，尿液浓度不够结果就不是那么准了。 　　对于试纸的使用，检测结果可能会出现不同的状况，有的时候一深一浅，有的时候两条都特别深，有的时候还会渐变。这个可能跟试纸有关，也有可能和尿液有关。但是一半来说是两条杠怀孕的可能性是比较大的，建议去医院进行确诊，检查胎儿是否健康，可以及时的采取应对方法。 　　检测试剂应用免疫层析双抗体夹心法原理，制成HCG检测试纸，可在3分钟内测定尿液标本中的HCG。检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗体时，形成抗原抗体胶体金复合物，复合物继续爬行，通过包被的抗-HCGα亚基Mcab时，形成双抗体夹心胶体金复合物，在包被线处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，和羊抗鼠对照线形成胶体金免疫复合物，呈现色带。HCG胶体金法检测试剂盒采用双抗体夹心一步法技术，以胶体金为指示标记，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否怀孕。试纸是协助临床判定妊娠的可靠指标。人绒毛膜促性腺激素(HCG)是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，早早孕检测试纸采用双抗体夹心一步法技术，以胶体金为指示标记，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否受孕。 早孕试纸几分钟看结果 　　使用早孕试纸检测怀孕，建议在五至十分钟内观察检测结果，超过该时间段检测结果不准确。早孕试纸是一种方便女性检测自己是否怀孕的产品，只能作为一种初筛检查，是不能作为诊断依据的。在使用早孕试纸进行检测怀孕时，最早要在同房后十四至二十天左右进行检测，而对于月经周期长或者是排卵异常的女，建议在停经40至44天左右进行检测。 　　检测时，将试纸带有箭头标志的一端浸入装有待检尿样的容器中，约三秒后取出平放，五至十分钟内观察检测结果，四十秒内显色为强阳性。当试纸出现阳性，就是试纸条上端和下端均有色带出现表示怀孕。试纸阴性指的是试纸条上端出现一条色带而下端无色带出现，表示未怀孕，当试纸条无色带出现说明试纸条已失效，建议可以通过血hcg的检查以及超声检查以明确宫内怀孕。 　　将验孕试纸插入尿液平放5分钟左右。验孕试纸的主要原理是检测HCG值，即人体绒毛怀孕一个月膜促性腺激素的值。是怀孕女性体内分泌的一种激素，存在于尿液及血液中，一般在怀孕几天后它就会出现在尿液里，但由于怎样才能怀孕量少，开始不易测验出来，直到10天至14天才日益明显。一般在3分钟左右时查看结果最好看。

ZZY就是早孕试纸，用于测试是否怀孕的。早孕试纸是一种方便女性检测自己是否怀孕的产品，只能作为一种初筛检查。早孕试纸“上、下端线颜色基本相同，或下线比上线深，表示你将24-48小时内排卵。只出现一条紫红色线，表示无排卵”这是使用说明，在试纸的外包装上有详细的使用说明。早孕试纸测试早孕程度弱或强是大家根据说明自己判断的，一般两条线一样深为强，根据浅的程度称为弱阳或弱弱阳等。原理：检测试剂应用免疫层析双抗体夹心法原理，制成HCG检测试纸，可在3分钟内测定尿液标本中的HCG。检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗体时，形成抗原抗体胶体金复合物，复合物继续爬行，通过包被的抗-HCGα亚基Mcab时，形成双抗体夹心胶体金复合物，在包被线处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，和羊抗鼠对照线形成胶体金免疫复合物，呈现色带。HCG胶体金法检测试剂盒采用双抗体夹心一步法技术，以胶体金为指示标记，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否怀孕。试纸是协助临床判定妊娠的可靠指标。人绒毛膜促性腺激素（HCG）是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，早早孕检测试纸采用双抗体夹心一步法技术，以胶体金为指示标记，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否受孕。

将你的两株抗体一个用来包被，另一个抗体标记好后做双抗体夹心检测相关抗原或弱阳性标准品，如果能检出阳性不就证明不是一个表位了么？

洗涤主要作用是想去掉多余的未结合的物质，以免对后续的反应产生不良影响。抗原和二抗是一起加到溶液体系中去的，当抗原抗体的比例不是刚好合适的时候，就会出现钩状效应，抗体过量为前钩，抗原过量为后钩，两者均会导致检测结果不准确。两步法，每次只加入一种成分，每次都只加入一种，当孵育完成过后用洗液洗去未结合的物质，以保证不会对下一步的反应产生干扰。抗体：抗体（antibody）是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它（免疫球蛋白不仅仅只是抗体）是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。

怀孕几天能测出来受孕几天能测出来？一般来说，在同房后的7—10天即可自行进行检测，可以通过早孕试纸或验孕棒检测晨尿来验孕，房事后时间越长越准确。总之在同房之后，最早的一个星期，最晚的大约3个星期，便能测出来是否怀孕。一般来说，在怀孕初期，女性会出现头晕、恶心、嗜睡、乳房胀大等一系列早孕反应，一般到了怀孕之后的10—14天才开始比较明显，过了三个月后会自行消失。所以，如果女性出现以上症状可以采用早孕试纸和验孕棒来验孕。早孕试纸怎么用用早孕试纸测早孕，一定要采用晨尿，因为晨尿浓缩，激素水平较高。在受孕后10天左右就可以从尿中检验出来，为了提高试验的阳性率，在前一夜还应尽量减少饮水量。女性若出现某些疑似早孕反应，又不敢肯定自己是否怀孕的话，女性可以通过验孕试纸检测尿液，看自己是否怀孕，但最好还是到医院进行检查，验孕结果更准确。早孕试纸的原理检测试剂应用免疫层析双抗体夹心法原理，制成HCG检测试纸，可在3分钟内测定尿液标本中的HCG。检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗体时，形成抗原抗体胶体金复合物，复合物继续爬行，通过包被的抗-HCGα亚基Mcab时，形成双抗体夹心胶体金复合物，在包被线处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，和羊抗鼠对照线形成胶体金免疫复合物，呈现色带。HCG胶体金法检测试剂盒采用双抗体夹心一步法技术，以胶体金为指示标记，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否怀孕。试纸是协助临床判定妊娠的可靠指标。人绒毛膜促性腺激素（HCG）是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，早早孕检测试纸采用双抗体夹心一步法技术，以胶体金为指示标记，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否受孕。使用试纸的注意事项1、液面不可超过MAX线。2、最好及时检测尿液可在室温放置8小时，冰箱放置24小时，检测时需恢复至室温。3、遵守测试时间，5分钟内读取结果，5分钟后结果无效。4、请在产品有效期内使用。超确认，最佳时间是等45天过后。

直接法需要先把抗原吸附到盘子的表面，然后再加抗体。而间接法盘子表面是事先吸附好了抗体，便于大规模的商业化生产。更重要的是，间接法可以使用统一的标记二抗，这样即使“免疫第二种动物获得的抗体”千变万化，只要都是来源于同一种动物，就可以使用一样的二抗。大大减少标记不同抗体的时间和花费。直接法需要先纯化抗原，再吸附。费时费力

　　众所周知，女性怀孕后可以通过一定手段进行验孕，来看看是否怀孕了，这是很正常的，验孕纸就是一种验孕手段，也是很方便的，那么， 验孕试纸越来越深怎么回事 ？一起来学习一下吧。 验孕试纸越来越深怎么回事 　　如果是两条线的话就证明怀孕了，如果是一条就证明是没有怀孕的。早孕试纸不会越来颜色越深的。 　　早孕试纸是人们设计出来的一种方便女性检测自己是否怀孕的产品。早孕试纸检测：将尿液滴在试纸上的检测孔中，如在试纸的对照区出现一条有色带(有的试纸显红色，有的试纸显蓝色)，表示阴性，说明未怀孕。反之，如在检测区出现明显的色带，则表示阳性，说明已经妊娠。早孕试纸只能作为一种初筛检查，会出现假阳性或假阴性。 　　检测试剂应用免疫层析双抗体夹心法原理，制成HCG检测试纸，可在3分钟内测定尿液标本中的HCG。检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗体时，形成抗原抗体胶体金复合物，复合物继续爬行，通过包被的抗-HCGu03b1亚基Mcab时，形成双抗体夹心胶体金复合物，在包被线处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，和羊抗鼠对照线形成胶体金免疫复合物，呈现色带。HCG胶体金法检测试剂盒采用双抗体夹心一步法技术，以胶体金为指示标记，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否怀孕。试纸是协助临床判定妊娠的可靠指标。 验孕纸的常见误测现象 　　1、检测的时间。HCG一般在受精卵着床几天后才出现在尿液中，而且要达到一定量才能被检出。因此，对于平时月经正常的妇女需在月经推迟后才可能在尿中检测出HCG。而月经周期长或排卵异常的妇女需在停经40 — 44天的时候才可能检测出。 　　2、一些疾病和药物可能造成假阳性结果。有些肿瘤细胞如葡萄胎、绒癌、支气管癌和肾癌等，也可分泌HCG。 　　3、不要使用过期的试纸。因为化学试剂时间长了会失去效用，所以在购买时要注意生产日期。 　　4、不要使用已经受潮了的试纸。如果自测结果呈阴性，1周之后月经仍未来潮，你应该再做一次自测。如果不是阳性，最好去看医生。相信自己的身体。如果你身上出现种种怀孕的症状，那么不管自测结果如何，应该想想到早孕试纸原理只是初步检测，使用早孕试纸是会存在误差的。 　　5、育龄女性在出现停经等早孕反应的时候，不能仅凭一次早孕试纸就测定是否为妊娠，最可靠的还是及进行全面检查，尤其是弱阳性者，进行HCG血检、HCG尿检以及B超检查。以便尽早采取措施。 精彩推荐： 孕囊 孕酮 胎动 葡萄胎 怀孕周期 静脉曲张 双顶径多长是男孩 如何进行内骨盆测量 怀孕多久算足月

有些女性一直没来月经，就去检查促黄体生成素，其中没来月经，促黄体生成素16.3高吗？ 促黄体生成素16.3是比较高的。正常情况下，女性在来月经第二天，空腹抽血化验激素六项，促黄体生成素的水平在10以下，并且和促卵泡生成素水平比值不超过2比1，如果超出这个范围，常常提示女性有内分泌紊乱，存在排卵障碍，可能会引起女性出现月经周期紊乱，比如说阴道不规则出血，受孕困难。 促黄体生成素检测可以利用胶体金技术，其以双抗体夹心法原理来定性检测女性尿液中的促黄体生成素存在水平，人们大多可以自行在药店购买到促黄体生成素检测试纸，比如上海凯创生物生产的促黄体生成素检测试剂，就是能够在家庭进行自我检测，从而达到帮助女性把握受孕时机，或者用于实施安全期避孕。

第三代，准确率为99.9%

1.双抗体夹心法属于非竞争结合试验。2.固相载体和酶标记物均与被检测物的两个以上抗原表位结合，形成抗体抗原酶标抗体复合物，特异性强。3.适用于多加抗原检测。4.od值可反应抗原含量。

抽血检测，一般用三代酶联合免疫法 酶联免疫法，简称ELISA。 它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。 步骤：ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清（这是有些网友不理解为什么医院抽完了血对血置之不理的原因，其实是误会）。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。严格的讲，如果第一次检测为阳性的话，无论是哪个实验室，必须按照CDC的HIV操作规程来进行第二次检测，第二次的方法必须与第一次的不同，如还是阳性，将送确认实验室确认。有的医院很不负责，将初筛阳性的报告发出后就不管了，这是不对的。必须经过确认实验室确认后才可出阳性诊断。祝大家。PS，第一次检测为阳性的话，一定要去确认实验室再做一次，勇敢的去面对，也许结果就不一样了。 基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 具体方法有： （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 （五）捕获法测IgM抗体 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 （六）应用亲和素和生物素的ELISA 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。 亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。

　　女性朋友往往对于早孕现象的判断，是自己通过早孕纸来判断的，但不同的女性朋友的尿液对于早孕纸的反应情况不同，这对于女性朋友的早孕现象的判断，带来了很多方面的压力，那么 早孕试纸会越来越深吗 ？ 早孕试纸会越来越深吗 　　如果是两条线的话就证明怀孕了，如果是一条就证明是没有怀孕的。早孕试纸不会越来颜色越深的。 　　早孕试纸是人们设计出来的一种方便女性检测自己是否怀孕的产品。早孕试纸检测：将尿液滴在试纸上的检测孔中，如在试纸的对照区出现一条有色带(有的试纸显红色，有的试纸显蓝色)，表示阴性，说明未怀孕。反之，如在检测区出现明显的色带，则表示阳性，说明已经妊娠。早孕试纸只能作为一种初筛检查，会出现假阳性或假阴性。 　　检测试剂应用免疫层析双抗体夹心法原理，制成HCG检测试纸，可在3分钟内测定尿液标本中的HCG。检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗体时，形成抗原抗体胶体金复合物，复合物继续爬行，通过包被的抗-HCGu03b1亚基Mcab时，形成双抗体夹心胶体金复合物，在包被线处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，和羊抗鼠对照线形成胶体金免疫复合物，呈现色带。HCG胶体金法检测试剂盒采用双抗体夹心一步法技术，以胶体金为指示标记，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否怀孕。试纸是协助临床判定妊娠的可靠指标。 早孕试纸的误测现象 　　1、检测的时间。HCG一般在受精卵着床几天后才出现在尿液中，而且要达到一定量才能被检出。因此，对于平时月经正常的妇女需在月经推迟后才可能在尿中检测出HCG。而月经周期长或排卵异常的妇女需在停经40 — 44天的时候才可能检测出。 　　2、一些疾病和药物可能造成假阳性结果。有些肿瘤细胞如葡萄胎、绒癌、支气管癌和肾癌等，也可分泌HCG。 　　3、不要使用过期的试纸。因为化学试剂时间长了会失去效用，所以在购买时要注意生产日期。 　　4、不要使用已经受潮了的试纸。如果自测结果呈阴性，1周之后月经仍未来潮，你应该再做一次自测。如果不是阳性，最好去看医生。相信自己的身体。如果你身上出现种种怀孕的症状，那么不管自测结果如何，应该想想到早孕试纸原理只是初步检测，使用早孕试纸是会存在误差的。 　　5、育龄女性在出现停经等早孕反应的时候，不能仅凭一次早孕试纸就测定是否为妊娠，最可靠的还是及进行全面检查，尤其是弱阳性者，进行HCG血检、HCG尿检以及B超检查。以便尽早采取措施。 精彩推荐： 宫外孕 羊水穿刺 四维彩超 唐氏筛查 静脉曲张 假性宫缩会引起呼吸困难吗 宫缩的时候宝宝会动吗 怀孕生男孩的症状 B超检查胎儿性别百分百准确吗

根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：2.2.1　双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。　洗涤除去其他未结合物质。3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合　的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。　在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab"）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。2.2.2 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。2.2.3 间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。操作步骤如下：1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗　体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗　体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。2.2.4 竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc 　ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。2.2.5 竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。2.2.6 捕获包被法测抗体IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式见图2-7。类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。2.2.7 ABS-ELISA法ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。

双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：双抗体夹心法一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab"）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。间接法测抗体间接法间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。⑷加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果。间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：⑴将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。一般情况，是通过方波伏安法，检测培养体系的峰电流，通过峰电流与抗原抗体的线性关系来最终确定体系的最终检测目标的浓度。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。捕获法血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：⑴将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。⑵加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。⑶加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。⑷加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。⑸加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

此句是正确的。He always goes shopping on Sundays.？译:他总在星期天去购物。时态:此句是一般现在时。句子成分:主语+谓语+状语

无菌室是制药生产中最重要的环节之一，它的洁净标准对产品质量和患者安全至关重要。本文将介绍无菌室消毒服务的关键步骤，以确保其洁净标准。1. 关键步骤1.1 准备工作在进行无菌室消毒服务之前，需要进行一些准备工作，包括：确认无菌室的类型和级别，以确定适用的消毒方法。清理无菌室内的物品和设备，确保表面干净、无尘和无杂质。确保无菌室内的空气质量符合要求，例如温度、湿度、洁净度等。1.2 消毒方法根据无菌室的级别和类型，选择适当的消毒方法。常见的消毒方法包括：紫外线消毒：适用于空气和表面消毒，操作简便，但对于不透明和有遮挡的物品效果较差。热气灭菌：适用于固体、液体、粉末等物品的灭菌，但不适用于热敏感物品。需要专门的设备和场所，成本较高。过氧化氢气态灭菌：适用于空气、表面和设备等物品的灭菌，但需要专门的设备和场所。诺福杀孢子剂乙醛消毒：适用于表面、设备和空气消毒，但对人体有一定危害性。1.3 消毒程序消毒程序是无菌室消毒服务的关键步骤之一，它包括以下几个方面：在进行消毒之前，需要对消毒剂进行质量检查，确保其浓度和有效期符合要求。在进行消毒之前，需要对无菌室进行预清洁，清除表面的污垢和杂质。在进行消毒之前，需要对无菌室内的物品进行分类，根据其材质和形状选择适当的消毒方法。消毒过程中需要注意安全，避免消毒剂溅到眼睛、皮肤和衣服上。消毒时间应根据消毒剂的浓度和无菌室的级别确定，确保消毒效果达标。消毒结束后，需要对无菌室内的物品进行清洁和干燥处理，避免残留消毒剂。1.4 检测和验证在完成无菌室消毒服务后，需要对无菌室进行检测和验证，以确保其洁净标准符合要求。常见的检测方法包括：空气采样法：通过采集空气中的微生物样品来检测无菌室内的微生物水平。表面采样法：通过采集无菌室内表面的样品来检测无菌室内的微生物水平。生物指示剂法：通过使用生物指示剂来验证消毒过程的有效性。综上所述，无菌室消毒服务是制药生产中至关重要的环节之一，其洁净标准对产品质量和患者安全具有重要影响。在进行无菌室消毒服务时，需要注意选择适当的消毒方法和程序，并对消毒效果进行检测和验证，以确保其洁净标准符合要求。同时，需要注意消毒过程中的安全问题，避免消毒剂对人体和环境造成危害。

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