elis

这个是因为反应过于激烈，请稀释你的样本或者抗原抗体。如果试剂盒是订购的成品，标准品孔无问题，一般稀释你的待测样品。如果标准孔也没有差别的话，就得怀疑是试剂盒的问题了。如果是你自己包被的试剂盒的话，可能要优化的地方就多了，就是做不同的稀释吧。

在elisa实验中所需要的一个重要显色成分是显色剂A（含过氧化氢）为供氢体（DH2）。elisa试剂盒酶联免疫诊断试剂盒的底物A就是显色剂A（含过氧化氢）为供氢体（DH2）,底物B就是显色剂B（含TMB）,用于显色。另外，常用的底物还有：AP的底物，常用的为对-硝基苯磷酸脂（PNP），其反应物为黄色的对硝基酚，测读波长为405nm2）GOD的底物，为葡萄糖，供氢体为对硝基蓝四氮唑，反应产物为不溶性的蓝色沉淀什么是TMB？TMB即四甲基联苯胺（3，3"，5，5"-Tetramethylbenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。

包被100 ul，你的反应体系应该就是100 ul。除了封闭用150 ul，其余所有包括TMB都用100 ul没有问题。终止液可以只加50 ul，2M的硫酸足够强了。看你OD值下降了，主要原因应该就是抗原和二抗的量都加少了。由于有封闭这一步，你不用担心气泡带着抗原超过了100 ul体系，只要不超过150 ul就可以（当然对于好的移液枪操作，不应该造成气泡）。TMB是HRP的底物，自己不能显色，但随着反应时间延长，显色是会加深，根据自己实际反应来控制反应时间，不用管别人推荐的时间。反应时间主要看阳性对照的OD值，即不能太长，使得阳性对照超出了仪器检测范围，或实验组将底物全部反应完（通常底物是过量的），造成实验组无差别；也不能太短，造成检测灵敏度下降。

因为TMB是显色液啊，变蓝实属于正常现象哈，这点是可以肯定的咯！

TMB无色时为0价蓝色时正1价黄色时正2价

额！培植物不知道！不过效果还不错！

配方一：底物显色A液：醋酸钠13.6g ,柠檬酸1.6g,30%双氧水0.3ml,蒸馏水加至500ml.底物显色B液 :乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油 50ml,取0.15g TMB溶于3mlDMSO中,蒸馏水加至500ml.使用的时候根据需要量取等量AB液混匀后使用配方二：底物缓冲液(pH 5.0磷酸钠柠檬酸)：0.2 mol/L Na2HPO425.7 ml，0.1 mol/L柠檬酸24.3 mL，50mL蒸馏水TMB(四甲基联苯胺)使用液：0.5 ml 2 mg/mL TMB无水乙醇溶液，10 mL底物缓冲液，32μL30% H2O2混合，现用现配。将底物缓冲液与TMB使用液按1：1混匀即可，现用现配。

【答案】：A邻苯二胺、四甲基联苯胺在ELISA中常作为HRP的底物；硝基苯磷脂常常作为AP的底物。

TMB显色液是一种采用了最新单一溶液TMB显色技术，通过辣根过氧化物酶(HRP)催化TMB显色，用于ELISA等的显色液。TMB对人体有刺激性，请注意适当防护，如果发现TMB显色液出现混浊或颜色变成较深的蓝色，应该停止使用。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

HRP底物：TMB--H2O2系统。经多年使用比较如下：国外商品化（双组份与单组份比较）：双组份的灵敏度比较高，保存时间也很长（一般4度放3-5年没有问题），单组份的要差一些。国内的：商品化的双组份灵敏度和保存时间与进口大公司的相当；单组份的：哈哈。

straw是吸管的意思。relish是风味佐料，调味酱的意思。祝学习进步。希望回答对你有帮助。

　　对于简单的酶促反应 　　E＋S＝＝ES → E＋P 双曲线方程可以写成： 　　Vmax[S] 　　V＝——————（3.1） 　　Km＋[S] 　　这个方程称为Michaelis-Menten方程,是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的,其中 Km 值称为米氏常数,Vmax是酶被底物饱和时的反应速度,[S]为底物浓度.由此可见Km值的物理意义为反应达到1/2Vmax的底物浓度,单位一般为mol/L,只由酶的性质决定,而与酶的浓度无关.可用Km的值鉴别不同的酶.当底物浓度非常大时,反应速度接近于一个恒定值.在曲线的这个区域,酶几乎被底物饱和,反应相对于底物S是个零级反应.就是说再增加底物对反应速度没有什么影响.反应速度逐渐趋近的恒定值称为最大反应速度Vmax.对于给定酶量的Vmax可以定义为处于饱和底物浓度的起始反应速度n.对于反应曲线的这个假一级反应区的速度方程可写成一种等价形式： 　　n（饱和时）＝Vmax＝k[E][S]0＝k[E]total＝k cat[ES] （3.2） 　　速度常数k等于催化常数k cat,k cat是ES转化为游离的E和产物的速度常数.饱和时,所有的E都是以ES存在.方程（3.2）中还有另一个简单的关系式：Vmax＝k cat [E]total.从中得出：k cat＝Vmax / [E]total.k cat的单位是s－1.催化常数可以衡量一个酶促反应的快慢. 　　米氏常数Km是酶促反应速度n为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度.这可通过用[S]取代米氏方程（3.1）中的Km证明,通过计算可得n＝Vmax /2. 　　双倒数作图 　　酶促反应中的Km和Vmax值有几种测量方法.固定反应中的酶浓度,然后分析几种不同底物浓度下的起始速度,就可获得Km和Vmax值.但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的,因为曲线接近Vmax时是个渐进过程.所以通常都是利用米氏方程的转换形式求出Km和Vmax值.常用的米氏方程转换形式是Lineweaver-Burk方程,也称为双倒数方程. 　　1 Km 1　1 　　——＝ ———·——＋———（3.9） 　　n Vmax [S] Vmax 　　使1/ v 对1/[S]作图,可以获得一条直线（如左图）.从直线与x轴的截距可以得到1/Km的绝对值；而1/Vmax是直线与y轴的截距.双倒数作图直观、容易理解,为酶抑制研究提供了易于识别的图形.

歌曲名:Jenny歌手:Melissa Manchester专辑:Home To MyselfThe Click Five -- Jennyby: www.ningshell.cnShe calls me baby, then she won"t call me.Says she adores me and then ignores me.Jenny, what"s the problem?She keeps her distance and sits on fences.Puts up resistance and builds defenses.Jenny, what"s the problem?You leave me hanging on the line.Every time you change your mind.First you say you won"t, then you say you will.You keep me hanging on, and we"re not moving on.We"re standing still, Jenny. You got me on my knees.Jenny, It"s killing me.She needs her own space. She"s playing mind games.Ends up at my place saying that she"s changed.Jenny, what"s the problem?I"m trying to read between the lines.You got me going out of my mind.First you say you won"t, then you say you will.You keep me hanging on, and we"re not moving on.We"re standing still, Jenny. You got me on my knees.Jenny, It"s killing me. It"s killing me. It"s killing me.Jenny.First you say you won"t, then you say you will.You keep me hanging on, and we"re not moving on.We"re standing still, Jenny. You got me on my knees.Jenny.First you say you won"t, then you say you will.You keep me hanging on, and we"re not moving on.We"re standing still, Jenny. You got me on my knees.Jenny, It"s killing me It"s killing me. Jenny.Endhttp://music.baidu.com/song/7395655

耐克有尺码对照表的 安踏也有 你看一下长度 就是那个CM的尺码吧 NIKE 一般来说都是正常码 个别鞋型有偏码的 就是包裹太紧了 安踏42的===26CM NIKE 42=26.5CM 42=26CM

”“我写这样的Career Goal会不会太common?”“Career Goal到底要specific到什么程度？” 那么，到底“什么样的Career Goal才是好Goal呢？”我觉得一个好的Career Goal需要满足如下的条件： 1. 一个好的Career Goal首先需要Make Sense虽然这看起来很基本，但是看到的不make sense的career goal实在不在少数。中国的申请者，比较谦虚，不会有不着边际的career goal。但是，例如，有些applicants的work experience里全是某某industry的经验，最后却说想从事NGO相关的工作。可能NGO真是他的goal，可能他申请的学校在NGO上是最出色的。但是，这都将导致一篇Goal Essay的失败。因为这个Goal和你以前的工作经验无关，无法connect dots；你没有任何的工作经验，Adcom的人没有任何证据说明该校MBA的学习可以帮你实现你的梦想。 所以，这条虽然基本，但也真的有必要拿出来单独说一下。大家在忠于自己的理想和说真话的同时，也不要忽略Adcom选人的标准。 2. 请目标高远！前文中也有提到，MBA的seats太过宝贵了，所以不将目标写的高远，写的有深度，是很难拿到有限的位置的。那么紧接着的一个话题就是，什么样的Career Goal算是一个高远的Goal？怎么样才能写出一个高远的Career Goal呢？其实很简单：就是站在行业leader的角度看问题。如果你是马化腾，你将如何改变互联网行业？如果你是巩俐，你将如何改变电影业？MBA说到底是看重的是Leadership，培养的也是Leadership，所以用你所定义的Career Goal来体现你的领导力吧！ 这点尤其要说给work experience较长的朋友。和刚毕业2-3年的申请者相比，你对所在行业的理解和见地，才是你作为年纪“较长”的申请者的可以利用的优势所在。3. Be Specific在描写Career Goal的时候一定要specific，即便是long term goal。要让Adcom的人通过你对Career Goal的描述能够Picture出来你5年10年后的样子。这样Adcom的人才知道你的理想不是梦，你对待你的Career和MBA的这个事情上是非常serious的。举个例子啊。比如这样一句话：My long-term goal is to build and operate the nation"s leading company in professional information services. 看到这样一句话，你明白他想build的公司是什么吗？这个公司怎么leading法吗？他要怎么operate吗？所以，Adcom的人看到这样的Career Goal其实还是完全不知道这个申请者到底要干什么。4. “我们”真的是你要找的Business School最后一点关于Career Goal的是在写的时候要考虑下与Why School的关联。当然如郎咸平所说MBA在美国已经是标准化的教育模式了，但是仍然不可否认的，各个学校有各个学校的特色。到一个financial-oriented的学校非要去做NGO也不是不可以，可是这是图什么呢？所以，在写Career Goal的时候，还是要考虑学校的特色的。不能太以自己为中心了。最后再老调重弹，大家有什么问题或者想法就post出来啊。其实已经有很多人在私下联系过我了，他们的问题和feedback都很好。其实你们的问题，也可能代表了很多人想问还没问，或者正在犹豫要不要“豁出脸去”问的问题呢。

完全翻新比较难了。。穿几天把另外一只也给和谐脏了。。就平衡啦。。。哇哈哈。。

有

I"ve got no one to blame, but you I"m as innocent as the truth I"m as sweet as a pea I"m as noble as a queen So don"t blame it on meI"ve had all I can take of regret I"ve done all I can do to forget you So if my simple plea is beneath you Let it be I"ll forgive you For what you don"t seeI"ve got no one to blame, but you I"m pure hearted So true and blue I"m as sweet as the honey From a honey bee So don"t blame it on meI"ve got no one to blame, but you I"m naive as the seeds of truth I"m as good as gold I"m an angel I"ve been told So don"t blame it Don"t you blame it on me

亲，那个不是Melissa天猫官网，melissa手表旗舰店才是Melissa的天猫官网

读 ：么力洒

挺好的··多数仿品··那个正品的估计动动上千 上万的 准确的说 9成仿品如果你要买表 我可以介绍你个卖家 专业做批发的

卓展和中兴都有

MelissaMorganMelissaMorgan是一名演员、MelissaMorgan，主要作品有《爱情服务生》、《血宴2》等。外文名：MelissaMorgan职业：演员代表作品：《血宴2》合作人物：赫舍尔·戈登·刘易斯

用清洗剂加水，用软毛刷轻轻刷洗。然后用布擦干，晾干看看行不行，具体我也没有什么特别好的建议

凯蒂·洛茨 Caity Lotz性别: 女星座: 摩羯座出生日期: 1986-12-30出生地: 美国,加利福尼亚,圣地亚哥职业: 演员其他作品：《绿箭侠》中Sara

不知道 不过我云盘里有上千G资源

听说没有，这个广州的没听说过，不会是高仿吧

梅丽莎·劳奇（MelissaRauch），1980年6月23日出生于美国新泽西州马尔伯洛市，演员。甜美性感的她，却仅有150cm的身高，不免难免有些觉得可惜，但是身高的缺失却也点也不影响她的性感。

广州有2个专卖店：1.广州白马服装城楼。2.广州海珠广场（地铁）B出口缤缤广场1楼。东莞：虎门镇仁义路151号。深圳：罗湖区嘉宾路南洋大厦鸿星岛广场29号。广东省就只有这3个总代理。

化学纤维的简称吧，这个年代，人们听到化学物品就恐惧，其实不在于他的有害无害，只在于你怎么使用 化学纤维用天然的或人工合成的高分子物质为原料、就

MelissaPadrónMelissaPadrón，演员，主要作品《真实的世界》。外文名：MelissaPadrón职业：演员代表作品：《真实的世界》合作人物：DavidSolomini电视剧作品

MelissaMikelMelissaMikel是一名演员，代表作品有《北京·纽约》《尴尬时刻》等。外文名：MelissaMikel职业：演员代表作品：《尴尬时刻》合作人物：李晓雨

MelissaMascaraMelissaMascara是一名演员，主要作品有《自由万岁》《混乱不堪》《末日浩劫》。外文名：MelissaMascara职业：演员代表作品：《自由万岁》合作人物：AnnaBiller

听说正品都产自巴西，广东的广州不知真假

歌曲名:Melissa歌手:The Allman Brothers Band专辑:Eat A PeachMelissa作词：新藤晴一编曲/作曲：ak.homma钢之炼金术师OP1Kimi no te de kirisaiteTooi hi no kioku woKanashimi no iki no ne wo tometekure yoSaa Ai ni kogareta mune wo tsuranukeAsu ga kuru hazu no sora wo miteMayou bakari no kokoro moteamashiteruKatawara no tori ga habataitaDoko ka hikari wo mitsukerareta no ka naNaa Omae no se ni ore mo nosetekurenai kaSoshite ichiban takai toko deokizari ni shite yasashisa kara toozaketeKimi no te de kirisaiteTooi hi no kioku woKanashimi no iki no ne wo tometekure yoSaa Ai ni kogareta mune wo tsuranukeTori wo yuuyami ni miokuttaChi wo hau bakari no ore wo kaze ga nazeruHane ga hoshii to wa iwanai saSemete chuu ni mau Melissa no ha ni naritaiMou Zuibun to tachitsukushite mita kedoTabun kotae wa nai no darouKono kaze ni mo iku ate nado nai you niKimi no te de kagi wo kaketeTamerai nado nai daroMachigatte moNidoto aku koto no nai you niSaa Jou no ochiru oto de owaraseteSukui no nai tamashii wa nagasarete kieyukuKieteyuku shunkan ni wazuka hikaruIma Tsuki ga michiru yoru wo umidasu no sa!(End)http://music.baidu.com/song/7552353

歌曲名:Melissa歌手:The Allman Brothers Band专辑:The Allman Brothers Band / Rock Legends君の手で切り裂いて 远い日の记忆を悲しみの息の根を止めてくれよさぁ 爱に焦がれた 胸を 贯け明日が来るはずの空を见て迷うばかりの心持て余してる傍らの鸟が羽ばたいたどこか光を见つけられたのかななぁ お前の背に俺も乗せてくれないかそして 一番高い所で置き去りにして优しさから远ざけて君の手で切り裂いて 远い日の记忆を悲しみの息の音を止めてくれよさぁ 爱に焦がれた 胸を 贯け鸟を夕闇に见送った 地をは这うばかりの俺を风がなぜる羽根が欲しいとは言わないさせめて宙に舞うメリッサの叶になりたいもう 随分と立ち尽くしてみたけど多分答えはないのだろうこの风にも行くあてなどないように君の手で键をかけて ためらいなどないだろう间违っても 二度と开くことのないようにさぁ 锭の落ちる音で终わらせて救いのない魂は流らせて消え行く消えていく瞬间にわずか光る今 月が満ちる夜を生み出すのさPorno Graffiti - Melissa钢の錬金术师OP１http://music.baidu.com/song/8318048

我买了五双了 高跟平底儿都有 我觉得味道来说 夹脚的凉鞋味道最小 而且不容易闻出来 其次是高跟鞋 平底鞋包脚的 从冬天放到现在 就放鞋架子上没鞋盒子啊 味道特蹿。。。 我们家哥们特反感这味道尤其是开车的时候 哈哈哈 但我喜欢颜色~

消除melissa香味的方法：通风晾晒、活性炭或者柚子皮吸收异味。一般来说melissa的鞋子为了增加柔软度和透明度，会加入特殊的化学物质，这种物质含有香味，是一种有害人体健康的物质。买来后一定要凉到没味道再穿。快速的方法是给新皮鞋除味要在鞋子里放一些活性碳，但是要切记活性碳一定要用透气的纸包裹好，由于假如将活性碳搞到了鞋子里会很难清洗；还有一种比较便利的方法，就是放一些柚子皮在鞋子里，效果也很不错。扩展资料：Melissa卖的是塑料鞋，却一直走在时尚最尖端，受到像Vivienne Westwood、Kate Moss、Jeremy Scott这样的大牌和一线设计师的青睐。因为材质讲究又环保。所有Melissa果冻鞋都奉行零废物原则，选材以生命周期为要点。Melissa生产厂房99.9%的水和废物均回收再用，过盛存货则再循环制成下个季度的新系列。Melflexu2122是由Melissa研发的可锻铸塑料，顺贴足部线条，透气性能良好，还有低过敏性、无味、中性和天然等特质，即使再循环也可保留这些优点。每双Melissa鞋都是非皮革制品，不会因为天气或沾湿变质，而且完全没有动物成分，最适合素食主义者和动物权益保护者。经过研发的Melflexu2122塑胶不但危害小，而且不易受潮发霉，拥有超越皮革制品的优点。其所有鞋履均散发纯天然香味，是全球少数获IFRA（国际日用香料香精协会）认可的鞋履品牌。

歌曲名:Melissa (Live)歌手:Julien Clerc专辑:Olympia IntéGral 94Melissa作词：新藤晴一编曲/作曲：ak.homma钢之炼金术师OP1Kimi no te de kirisaiteTooi hi no kioku woKanashimi no iki no ne wo tometekure yoSaa Ai ni kogareta mune wo tsuranukeAsu ga kuru hazu no sora wo miteMayou bakari no kokoro moteamashiteruKatawara no tori ga habataitaDoko ka hikari wo mitsukerareta no ka naNaa Omae no se ni ore mo nosetekurenai kaSoshite ichiban takai toko deokizari ni shite yasashisa kara toozaketeKimi no te de kirisaiteTooi hi no kioku woKanashimi no iki no ne wo tometekure yoSaa Ai ni kogareta mune wo tsuranukeTori wo yuuyami ni miokuttaChi wo hau bakari no ore wo kaze ga nazeruHane ga hoshii to wa iwanai saSemete chuu ni mau Melissa no ha ni naritaiMou Zuibun to tachitsukushite mita kedoTabun kotae wa nai no darouKono kaze ni mo iku ate nado nai you niKimi no te de kagi wo kaketeTamerai nado nai daroMachigatte moNidoto aku koto no nai you niSaa Jou no ochiru oto de owaraseteSukui no nai tamashii wa nagasarete kieyukuKieteyuku shunkan ni wazuka hikaruIma Tsuki ga michiru yoru wo umidasu no sa!(End)http://music.baidu.com/song/2767484

梅丽莎Melissa，是 Grendene旗下品牌，创建于1971年，是一家生产、销售女鞋、童鞋的品牌。品牌故事：Grendene成立于1971年里约近郊的Farroupilha，如今是年产一千四百万双，拥有13间国际级先进工厂、3万多名员工，从原料开发、设计研发到品牌经营于一体的世界级企业，并成功的行销于5大洲、85个国家；不论在日本、法国、美国、意大利等都可以看到Grendha巴西果冻鞋的热情倩影！Grendha巴西果冻鞋是以PVC材质为主要原材料，并拥有全球最先进的特殊配方软式橡胶加工技术；专业的实验室、70余种独特原料配方，能将鞋子的舒适性发挥到淋漓尽致，而且99%可回收PVC材质，符合先进国家环保标准。通过如Wal Mart、Payless、Meldisco、Target、Deichmann、Foot Locker等世界级通路的认证，更成为FIFA世界足球联盟、Barbie、Disney 及PPG等授权的生产厂商。行销全世界的Grendha巴西果冻鞋拥有与众不同的时尚设计研发团队，Grendene的设计师团队是由一群建筑师、工程师、市场分析师与时尚设计师等所组成，在风格上跳脱出制鞋的思维，而将Grendha巴西果冻鞋设计的更令人惊艳与激赏。

当爱已成往事——浅析双M情感的过去现在以及将来看到49集，小鸥粗略的把双M的关系归纳为七个阶段：曾经相爱、冷静分手、相互扶携、默契守望、失去平衡、黯然神伤、徒留追忆 75年的红酒频频出场，暗示着75年的那场情事是如何的刻骨铭心。虞苇庭对贺峰的爱，大家有目共睹。贺峰对虞苇庭到底有没有爱？小鸥觉得肯定有。贺峰可以忘记生意惨败是在89年，却从来没有忘记1975年的相遇。小鸥有权怀疑老贺的初恋正是1975年。这个相遇不是贺峰单方面的惊艳，也不是苇庭单方面的喜欢，这个相遇时两个人共同拥有的，两个人都说过：那年我遇到了一个我生命中很重要的人。我们可以用各种桥断去猜想两人的1975年，但不能抹杀的是曾经的爱。两人一起去小岛的游艇上，苇庭起身挽住贺峰的胳膊，贺峰轻揽苇庭的腰，一起远眺海景，那份动作的自然暴露了爱的痕迹。贺峰的亲热戏少之又少，小鸥甚至臆断他们肯定上过床。没有爱，那种微妙的关系不可能维持30年。1975年于两人都是惨淡的白月光，幸福的悲伤的回忆全都无处可逃。那一年的红酒，成了凭吊追忆的祭品。 千金小姐嫁入豪门；贫穷小子娶妻生子。小鸥推断他们是冷静分手，而不是黯然分手。恋爱过的人，如果因为彼此的伤害而黯然分手，有爱就有恨，黯然分手的情侣绝对维持不了30年的微妙感情。想想现在的康雅言，为了长胜，冷静到可以假结婚，正因为这份冷静，所以雅言对长胜的爱火从未熄灭，反而越压抑越旺盛。1975年的贺峰和苇庭，分手是迫于生计还是其他原因，我们可以任意想象，但他们的分手应该没有怨恨在里面。小鸥觉得冷静分手是因为迫于生计，相濡以沫不如相望于江湖。 贺峰能有今日成就，离不开苇庭老公的提携，一个超级富豪为什么提携一个穷小子，除了贺峰的能力，当然也离不开苇庭的枕边风。89年苇庭老公刚死，贺峰苇庭便一起买下小岛，当年贺峰的财力应该还不足以独立投资大的发展计划，而苇庭一个人扛着庞大集团的经营也力不从心，腹黑点说是贺峰利用苇庭扩展自己的生意，善良点说是贺峰想帮苇庭搞好苇庭的生意。30年里，两人的合作绝不止这一次，苇庭的财力贺峰的能力相互扶携，最终胜出，贺峰渐渐成就了目前举足轻重的大人物。 苇庭死了老公，贺峰死了老婆，两人为什么没有顺势结合在一起？原因我们很难猜测。但是婚姻不是简单得你情我愿就可以了。我们可以假想贺峰念在苇庭老公的提携之义；我们也可以假想苇庭老公在世时，关于贺峰和苇庭的暧昧关系已经被人议论，不结婚就是不给别人落口实；我们还可以假想贺峰不愿别人认为他是贪图苇庭老公的遗产，或者贺峰不想孩子有个后妈等等；总之事实就是：贺峰苇庭默契守望了30年。 这段默契守望有个平衡点——两人都失去了法律上的爱人，一个不再娶，一个不再嫁，默默地彼此享受着对方的关怀，大家都清楚对方心里有自己。这样一种平衡如果维持到生命尽头，也不失为一段美谈，偏偏贺峰娶了雅思，打破了这种平衡。爱的底片经过30年时光的冲洗，已经成似爱非爱的图像。贺峰不仅娶了雅思，而且一而再再而三的在苇庭面前展示自己的幸福，以贺峰的缜密心思，他肯定知道这样会伤到苇庭，那他为什么还要这样做？不知道编剧安的什么心？有些网友使劲的往fh处想，可能是贺峰故意刺激苇庭，然后借苇庭出手对付宋十万。如果贺峰要利用苇庭，30年里有的是机会，何必等到现在？（也许有人反驳前面30年里时机不成熟）就算现在时机成熟，难道非要用婚姻刺激苇庭？可以直接告知计划，一起合作阿。（也许有人反驳苇庭已安于现状）如果真的安于现状，你贺峰用婚姻刺激苇庭，难道苇庭的情感宣泄只有恶意收购这个出口？总之，小鸥不愿相信贺峰是利用苇庭。 酒还是那个酒人却不是以前的人了苇庭对着红酒终于感叹：原来味觉神经是和人的心情有关的，好不好喝要看当时的人和地。所有的人都觉得你贺峰该出手了，我虞苇庭也为你打了头阵，你还婆婆妈妈的不肯出手，甚至还牺牲哲男来救宋十万，你贺峰到底是不是男人啊？还是说，为了估计你身边的枕边人，你不肯去搏？哲男不理解我无所谓，雅思不理解我也无所谓，为什么连你虞苇庭也不理解我？30年的风风雨雨，你难道还不明白我贺峰绝对不是怕事的人？我这样做有我的打算，为什么你就不能明白阿？ 不知道贺峰和苇庭会继续着怎样的故事；所有的故事过程都很精彩，但是结尾都很简单。对于双M的最后结果总结：此情可待成追忆，只是当时已惘然！ 看到吧里很多人说到虞苇庭与贺峰的前世今生，其实明眼人谁都看得出来，即便是不用说，也知道一个男人和一个女人能够成为一辈子的知己，其底色必然是人生情感上的相互交融，这种交融，如果在三十年前那可以被叫做爱情，但是在三十年后就应该被叫做情分，这里面，混淆了三十年里彼此的相望，彼此的守候，彼此共有的无奈以及在对方人生影像里才能找到的自己的青春岁月，一起走过，一起苦过，也一起熬过，因为恨不相逢未嫁时，所以只能此情可待成追忆。对于贺峰，他是个男人，他能够懂得岁月对于他们之间这份情感的磨砺和改变，也许是伯牙子期高山流水，但已不能是白首不分相濡以沫。他和她，在人生之初便相濡以沫，而在变幻的红尘中相忘于江湖，这对于虞韦婷来说，对于一个其实爱了三十年的女人来说，是残酷的，是不能去面对和坦然接受的。所以当她发现贺峰对雅思的理解与同情，她用雅思自比，当她发现雅思对贺峰的用心，她嘲讽奚落，当她知道贺峰对雅思用了真情，她失望难过，其实，也许在她的心里，贺峰一直没有离开，就如同三十年前他们彼此站在爱情的对岸相互守望。突然间有人告诉她，你所守望的那个人，要转身离开此岸，要开始一段新的人生新的爱情，留下她独自站彼岸，从此无论风雨，无论悲喜，自己再也不是他心里那个最重要的女人，不是那个可以和他琴瑟和鸣的流水，一个女人，她带着内心里欲罢不能的伤感和面对着泥沙俱下的岁月侵蚀，再多的优雅，再得体的举止，再大方的表情，也难掩她眼中一掠而过的泪光吧？看着她强硬的抢白雅思，我其实真的没看见一个强势的女人是如何教训下属，我看见的是一个内心苍白的女人在寡不敌众的向实力高出自己一大截的对手宣战，雅思诺诺的站着，听她用不知道那里来的怒气尖酸刻薄的嘲讽自己，这场战争里，究竟有谁是赢家呢？雅思也许输掉的，是人生的一场爱情，虞苇庭输掉的，也许是一场爱情的人生。

楼主这是何苦挖

如果是正品的巴西melissa鞋,目前在重庆是没有专卖店的.到目前全中国内地只有杭州大厦和广州友谊商店(国金店)这两家店.

的确，玛丽莎Melissa以她优质的品质，优良的服务，优秀的专业素养逐渐成为内地和香港各大城市潮人们饰品的不二选择。1 xxx的时候，我们体内会分泌出汗液，而汗液是呈弱酸性的，如果接触到水晶，水晶就会变黄，脱落的哦。所以在这个适合，亲们就要把水晶表摘下来，等到xxx完毕后再戴上。相同的道理，玛丽莎水晶饰表也不能接触碱性物质哦。2 亲们每日护肤、上妆，也要等个几个分钟后再戴表哦。因为化妆品中难免有化学物质，可能会对水晶饰表进行腐蚀。轻的腐蚀了水晶，重的可能会影响手表电镀方面的耐久性哦。PS.经常使用香水亲们也要注意：）说完保养工作，再给亲们附带介绍一下玛丽莎Melissa水晶腕表的工艺吧。（让亲们购买时更专业，更自主！！）她的机芯是日本原装进口的，来自CITIZEN的MIYOTA系列机芯，在正常佩戴下，可以免费保修一年的哦。而腕表的表面材料则是日本进口的铜料。表面上的字，用的是A级的天然珍珠母贝(M.O.P)。最引人瞩目的要算镶嵌的仿钻了，就是现在大家都是否欣赏和喜欢的施华洛世奇水晶(SWAROSKI)（高品质的人工仿钻，没有丝毫瑕疵）。还有使用奥地利进口xxx(C.Z)。至于表的内涵则采用的是一咪玫瑰金或白金电镀，正常佩戴下可持续一年以上，在正常佩戴下，玛丽莎表还可以免费保修一年哦。电池也是日本原装进口索尼电池。可以保用3年，在正常佩戴下，也是免费保修一年的哦。现在，亲们对玛丽莎Melissa水晶腕表有了更深的了解。赶快看看真品吧！！！总有你喜欢的：）

　　LZ，你好，根据你的描述，应该是在第七季20集的《瑞秋的同性之吻》的那位了，请看下面信息，希望对你有帮助~谢谢~　　薇诺娜·赖德　　英文名：Winona Ryder　　别名：Winona Laura Horowitz　　更多译名：云露娜维达、维诺娜·赖德、薇诺娜·瑞德　　昵 称：Noni　　生 日：1971年10月29日　　出 生 地：美国明尼苏达州（Minnesota)　　身 高：163cm （IMDB权威资料)　　体重：50kg　　星 座：天蝎座　　家庭状况：一般　　父亲：迈克尔·霍洛维茨 Michael Horowitz （作家，编辑&；；出版者）　　母亲：Cindy Horowitz （教育者&；；影片制作人）　　姊姊：Suntaya Horowitz　　哥哥：Jubal Horowitz　　弟弟：YUri Horowitz　　前男友：约翰尼·德普 (1993-1995)　　个人简历　　1991年获金球奖最佳女配角奖提名（《风情妈咪俏女儿》）　　薇诺娜·赖德　　1994年获奥斯卡最佳女配角奖提名（《纯真年代》）　　1994年获金球奖最佳女配角奖（《纯真年代》）　　1995年获奥斯卡最佳女主角奖提名（《小妇人》）　　1971年10月出生于明尼苏达州，父母是60年代的嬉皮士——热爱自由，反对主流文化。他们以一座明尼苏达州的小镇的名字作为女儿的名字。薇诺娜从小受到家庭的溺爱，生活十分美满幸福。在是作家的父亲的影响下，她从小就酷爱看书，掌握了大量知识。而幼年时对经典电影的迷恋，使她下决心要当一名演员。上高中后，她加入了学校的剧团，活跃在戏剧舞台上。她具有极好的表演天赋，又十分肯虚心钻研学习，高中毕业后，就与经纪人签约拍电影。

君の手で切り裂いて 远い日の记忆を 悲しみの息の根を止めてくれよ さあ 爱に焦がれた胸を贯け 明日が来るはずの空を见て 迷うばかりの心持てあましている 傍らの鸟がはばたいた どこか光を见つけられたのかな なあ お前の背に俺も乗せてくれないか そして一番高い所で置き去りにして优しさから远ざけて 君の手で切り裂いて 远い日の记忆を 悲しみの息の根を止めてくれよ さあ 爱に焦がれた胸を贯け 鸟を夕暗に见送った 地を这うばかりの俺を风がなぜる 羽か欲しいとは言わないさ せめて宙に舞うメリッサの叶になりたい もう ずいぶんと立ち尽くしてみたけど たぶん答えはないのだろう この风にも行くあてなどないように 君の手で键をかけて ためらいなどないだろ 间违っても 二度と开くことのないように さあ 锭の落ちる音で终わらせて 救いのない魂は流されて消えゆく 消えてゆく瞬间にわずか光る 今 月が満ちる夜を生み出すのさ 应该是这个吧~

貌似是得了癌症还是什么的 反正是死了

”“我写这样的Career Goal会不会太common?”“Career Goal到底要specific到什么程度？” 那么，到底“什么样的Career Goal才是好Goal呢？”我觉得一个好的Career Goal需要满足如下的条件： 1. 一个好的Career Goal首先需要Make Sense虽然这看起来很基本，但是看到的不make sense的career goal实在不在少数。中国的申请者，比较谦虚，不会有不着边际的career goal。但是，例如，有些applicants的work experience里全是某某industry的经验，最后却说想从事NGO相关的工作。可能NGO真是他的goal，可能他申请的学校在NGO上是最出色的。但是，这都将导致一篇Goal Essay的失败。因为这个Goal和你以前的工作经验无关，无法connect dots；你没有任何的工作经验，Adcom的人没有任何证据说明该校MBA的学习可以帮你实现你的梦想。 所以，这条虽然基本，但也真的有必要拿出来单独说一下。大家在忠于自己的理想和说真话的同时，也不要忽略Adcom选人的标准。 2. 请目标高远！前文中也有提到，MBA的seats太过宝贵了，所以不将目标写的高远，写的有深度，是很难拿到有限的位置的。那么紧接着的一个话题就是，什么样的Career Goal算是一个高远的Goal？怎么样才能写出一个高远的Career Goal呢？其实很简单：就是站在行业leader的角度看问题。如果你是马化腾，你将如何改变互联网行业？如果你是巩俐，你将如何改变电影业？MBA说到底是看重的是Leadership，培养的也是Leadership，所以用你所定义的Career Goal来体现你的领导力吧！ 这点尤其要说给work experience较长的朋友。和刚毕业2-3年的申请者相比，你对所在行业的理解和见地，才是你作为年纪“较长”的申请者的可以利用的优势所在。3. Be Specific在描写Career Goal的时候一定要specific，即便是long term goal。要让Adcom的人通过你对Career Goal的描述能够Picture出来你5年10年后的样子。这样Adcom的人才知道你的理想不是梦，你对待你的Career和MBA的这个事情上是非常serious的。举个例子啊。比如这样一句话：My long-term goal is to build and operate the nation"s leading company in professional information services. 看到这样一句话，你明白他想build的公司是什么吗？这个公司怎么leading法吗？他要怎么operate吗？所以，Adcom的人看到这样的Career Goal其实还是完全不知道这个申请者到底要干什么。4. “我们”真的是你要找的Business School最后一点关于Career Goal的是在写的时候要考虑下与Why School的关联。当然如郎咸平所说MBA在美国已经是标准化的教育模式了，但是仍然不可否认的，各个学校有各个学校的特色。到一个financial-oriented的学校非要去做NGO也不是不可以，可是这是图什么呢？所以，在写Career Goal的时候，还是要考虑学校的特色的。不能太以自己为中心了。最后再老调重弹，大家有什么问题或者想法就post出来啊。其实已经有很多人在私下联系过我了，他们的问题和feedback都很好。其实你们的问题，也可能代表了很多人想问还没问，或者正在犹豫要不要“豁出脸去”问的问题呢。

没听说过

好像是癌症。

用你的手把遥远的记忆切开了止住悲惨的命运吧那麼 穿透那一心向往著爱的心望著明天将要来临的天空带著剩馀的不断迷惑的心身边的鸟张开翅膀 是在哪里发现了光亮吗喂 我不能乘坐在你的背脊上吗？然后在最高的地方把我丢下而和善地躲到远处用你的手把遥远的记忆切开了止住悲惨的命运吧那麼 穿透那一心向往著爱的心在暮色间送别了那只鸟 在地上行走的我为何引来了风不是需要翅膀的意思期待变成在空中飘舞的Melissa之叶虽然已尽全力地站到最后大概也不会有答案吧这风没有安排地吹去用你的手把钥匙锁住锁 不可能不风平浪静的吧即使是搞错 也不会第二次打开它那麼 钥匙掉落的声音也随之消失了未被拯救的灵魂会被冲走灵魂在消失时的瞬间会放射出光芒现在 悬挂著满月的夜晚出现了

根据十大牌子网显示，儿童果冻鞋热销榜中前六都是visamoris品牌，而Melissa品牌最靠前的也是第八。visamoris主营产品:儿童果冻鞋,果冻鞋,硬纸盒,亲子鞋,宝宝单鞋,皮鞋。MELISSA是属于Grendene旗下一家生产、销售女鞋、童鞋的品牌。另外，MELISSA的产品“巴西果冻鞋”是以PVC材质为主要原材料，不仅商品材质具防水、透气、舒适的特性，还讲究人体工学的楦模开发。

歌曲名:Melissa歌手:Bill Miller专辑:Reservation Road: LiveMelissa作词：新藤晴一编曲/作曲：ak.homma钢之炼金术师OP1Kimi no te de kirisaiteTooi hi no kioku woKanashimi no iki no ne wo tometekure yoSaa Ai ni kogareta mune wo tsuranukeAsu ga kuru hazu no sora wo miteMayou bakari no kokoro moteamashiteruKatawara no tori ga habataitaDoko ka hikari wo mitsukerareta no ka naNaa Omae no se ni ore mo nosetekurenai kaSoshite ichiban takai toko deokizari ni shite yasashisa kara toozaketeKimi no te de kirisaiteTooi hi no kioku woKanashimi no iki no ne wo tometekure yoSaa Ai ni kogareta mune wo tsuranukeTori wo yuuyami ni miokuttaChi wo hau bakari no ore wo kaze ga nazeruHane ga hoshii to wa iwanai saSemete chuu ni mau Melissa no ha ni naritaiMou Zuibun to tachitsukushite mita kedoTabun kotae wa nai no darouKono kaze ni mo iku ate nado nai you niKimi no te de kagi wo kaketeTamerai nado nai daroMachigatte moNidoto aku koto no nai you niSaa Jou no ochiru oto de owaraseteSukui no nai tamashii wa nagasarete kieyukuKieteyuku shunkan ni wazuka hikaruIma Tsuki ga michiru yoru wo umidasu no sa!(End)http://music.baidu.com/song/2647199

加进香料了呗！

melissa是现在很有名的一款鞋子品牌，虽然她家的鞋子都透露着一股浓浓的塑料风，但是绝对不会显得廉价，看上去特别精致。下面我给大家讲讲melissa是什么档次？ melissa是什么档次 melissa属于比较高档次的品牌，一直在时尚界的尖端。 说到Melissa，很多小朋友应该都不陌生吧?无论是糖果色调的果冻鞋还是带有神秘色彩的镂空平底鞋，或者是夺人眼球的夸张设计，Melissa卖的是塑料鞋，却一直走在时尚最尖端，受到像Vivienne Westwood、Kate Moss、Jeremy Scott这样的大牌和一线设计师的青睐，怪不得贝嫂维多利亚会给出门难得带鞋的“小七”配上一双可爱的Melissa猫咪鞋。好啦，接下来就给大家好好介绍介绍Melissa这个品牌。melissa鞋子怎么样 Melissa太有名了吧!各大Mall也都有专柜，价格略贵，一般500元以上吧。我身边更多人是去香港买的，经常打折，所以买起来也算平价。但国内的人怎么办!我们有美亚直邮啊!!!买的是MEL DREAMED BY MELISSA 哈哈哈 忍不住咆哮!刚好参加上次的鞋包额外8折，所以立马囤货2双!一双平底鞋，一双凉鞋。 平底鞋原价33.01刀，运费5.51刀，8折后31.92刀，折合人民币200左右，5月21号下单，月底就收到了，都嘚瑟了一礼拜了!哈哈哈 另外凉鞋原价37.04刀，运费5.61刀，折后35.24刀，折合人民币220左右，5月19号下单，也是月底收到，目前北京还没到凉鞋的时候，我再等等!一周的直邮速度简直跟飞一样好嘛!!! 鞋码方面，我36脚，平底鞋买的6码，稍大一点点，凉鞋买的5码，刚刚好。穿着感受，打开鞋盒就有扑面而来的香气，踩在脚下软软的，跟走在云上面一样(原谅我太浮夸)。做工整体还不错，很平滑柔软，平底鞋的镂空很好看，凉鞋的蝴蝶结也很精致。我娘说平底鞋镂空的特别好看，于是吵着闹着也要给她买一双!于是我颠颠儿的就赶紧去了，虽然额外8折活动已没有，但依旧是好价啦!最后以38.71刀入手一双7码!melissa品牌介绍 Melissa是巴西Grendene旗下品牌，于1979年就创立。虽说只做女鞋和童鞋，年产量却有一千四百万双，还拥有13间国际级先进工厂、3万多名员工。Melissa在全球超过50个国家都有销售，在日本，法国，美国，意大利更是人气相当高。 很多妹子都为它萌萌的颜色以及可爱的设计所折服。虽说Melissa果冻鞋是以PVC材质为主要原料，看上去就和普通塑料鞋没什么区别。 其实他们家拥有全球最先进的特殊配方软式橡胶加工技术，专业的实验室，还有70余种独特原料配方，根本不是随便一双塑料鞋那么简单。为了能将鞋子的舒适性发挥到淋漓尽致，实验室的工作人员可是动足了脑筋!采用的PVC材质好而厚实，使得Melissa穿起来走路也很舒服!买鞋子的小窍门 首先是重量，要挑质量轻的鞋子。再看鞋面和鞋底之间的连接，连接平整当然就粘的结实，要确保没有漏粘的部分。看鞋底，鞋底高最好是二到四厘米，不宜超过七厘米。鞋底材质要好，塑胶底没有漏粘。走路时脚要弯的地方，材质应是相当好的。鞋的内部没有褶皱，断线，鞋钉等。 买鞋时最重要的就是舒适度，不舒服的鞋子千万不要买。鞋子不能一双总穿着不换，当然不同的运动也要穿不同的鞋子，建议有三四双可以轮流替换。脱下来的鞋子要及时清理，内部塞入报纸保持鞋形。 老年人应该穿高帮鞋，鞋底松软有跟，跟高在两厘米左右。孕妇应穿平底的鞋子，保持身体平衡避免摔倒。高跟鞋，跟高不宜超过七厘米。鞋跟最好是二到四厘米。

Melissa是巴西的品牌，属于Grendene旗下的一家用塑料鞋创造时尚的品牌。虽然Melissa卖的是塑料鞋，但却懂得通过设计的力量带来让人惊喜的价值。Melissa风靡全球，是一双带果冻香味的鞋子，其材质有防水、透气、舒适的优点。Melissa多年来一直与来自各领域的著名设计师跨界合作，像老佛爷KarlLagerfeld、英国“朋克教母”VivienneWestwood等。新款系列设计上展现出热情时尚、都会休闲的气息。经典的蝴蝶结装饰，鞋跟优雅流畅的曲线，犹如女性身体的曲线一般，搭配果冻般的PVC材质，露出俏皮的复古魅力。作为果冻鞋的创始者，巴西Melissa拥有专利的特殊配方材料，其鞋款100%可再生循环使用，舒适、防水，通透。每款产品都拥有独特而持久的甜美香味，使其成为唯一一款可以“闻香识鞋”的产品。而Melissa的品牌特点不仅如此，自问世以来，Melissa就以其缤纷色彩受到全球女性消费者的疯狂追逐。它的设计者们更是来自各个艺术领域的大师，跨领域的艺术家们在风格上跳脱出制鞋的思维，将果冻鞋设计的更令人惊艳与激赏，创造出款款时尚经典令人赞叹的鞋款，不仅令消费者疯狂，更被各国的当代艺术馆所珍藏。

MELISSA玛丽莎，以优雅精致为主线的玛丽莎手表，旨在发挥无限的创意，让每位心思细腻的女性，陶醉于恒久的时尚，表达真我个性的闪耀光芒中。

melissa是非常有名的一个鞋子品牌，相信大家都听说过她家的果冻鞋，非常可爱，而且穿着也很舒服。下面我给大家讲讲melissa是什么牌子？ melissa是什么牌子 melissa是一个专门做鞋子的品牌。 梅丽莎 (Melissa) 是 Grendene 旗下品牌。Grendene 成立于1971年里约近郊的Farroupilha，如今是年产一千四百万双，拥有13间国际级先进工厂、3万多名员工，从原料开发、设计研发到品牌经营于一体的世界级企业，并成功的行销于5大洲、85个国家;不论在日本、法国、美国、意大利等都可以看到Grendha 巴西果冻鞋的热情倩影!Grendha 巴西果冻鞋是以PVC材质为主要原料，并拥有全球最先进的特殊配方软式橡胶加工技术;专业的实验室、70余种独特原料配方，能将鞋子的舒适性发挥到淋漓尽致，而且99%可回收PVC 材质，符合先进国家环保标准，通过如 Wal Mart、Payless、Meldisco、Target、Deichmann、Foot Locker 等世界级通路的认证，更成为FIFA (世界足球联盟)、Barbie、Disney 及PPG 等授权的生产厂商。melissa鞋子怎么样 Melissa鞋，大家都俗称为“香香鞋”，为什么会有这样一个甜美的名字呢?那当然是它家鞋独特的橡胶材质，却持久散发着甜甜的香气，持久不散!真心是持久不散哦，我第一双是5年前在巴西买到的，那是国内还不流行，也无人知晓。一进店里，就被甜甜的香味包裹起来了，不要以为就是普通的塑料材质的鞋子，每一双都是那么精致的爱不释手，样式时尚美观，主意是舒适，夏天穿在脚上也不捂脚，而且还有香味。 我一口气买了10双回北京，因为每双都喜欢，都想拥有，我深刻地记得，当时我装满鞋子的行李箱里，一打开满箱飘香呢!那年夏天我穿上它走在大街上，引发了多少“回头率”啊!至今我那第一双还好好的，香味浓郁未散。后来偶然在泰国也发现了Melissa的店面，于是乎就去一次买一双的节奏，现在整个鞋柜里还有它们的余香!这是刚刚从泰国带回来的，现在每次去泰国，都会买回一双melissa的“香香鞋”!melissa为什么火 因为材质讲究又环保!所有Melissa果冻鞋都奉行「零废物」原则，选材以生命周期为要点。Melissa生产厂房99.9%的水和废物均回收再用，过盛存货则再循环制成下个季度的新系列。 听说过Melflexu2122吗?它是由Melissa研发的可锻铸塑料，顺贴足部线条，透气性能良好，还有低过敏性、无味、中性和天然等特质，即使再循环也可保留这些优点。每双Melissa鞋都是非皮革制品，不会因为天气或沾湿变质，而且完全没有动物成分，最适合素食主义者和动物权益保护者。 经过研发的Melflexu2122塑胶不但危害小，而且不易受潮发霉，拥有超越皮革制品的优点。其所有鞋履均散发纯天然香味，是全球少数获IFRA(国际日用香料香精协会)认可的鞋履品牌。鞋子购买注意事项 买鞋的时机 一般人是随便找个空闲的时间就去鞋店买鞋了，但是我要告诉你这其实是错误的。买鞋的最好时机应是傍晚的时候，经过一天的使用，脚在这个时候是最肿胀的，当然在这时候买鞋最合适了。 如何试鞋 不要相信售货员说的‘穿两天就合脚了"，等到合脚的时候你的鞋子其实已经有损伤了。试鞋时应当站起来，站起来时脚是比平常大的。穿上鞋子时脚踝能够留在外面，脚后跟不紧不松，脚趾能够自由活动且有拇指大小的空间毕竟还要放鞋垫。两只脚的大小是不一致的，所以要买合适大脚的鞋子。当然还要穿着鞋子走动走动。

[mi"lisu0259]

predatory：拍乱德特瑞（重音在第一个音节上）。novelist：那、问立死特（第一个字发重音拖一个音节，后四字快速连读）。predator：拍乱德特（重音在第一个音节上）。

直接法需要先把抗原吸附到盘子的表面，然后再加抗体。而间接法盘子表面是事先吸附好了抗体，便于大规模的商业化生产。更重要的是，间接法可以使用统一的标记二抗，这样即使“免疫第二种动物获得的抗体”千变万化，只要都是来源于同一种动物，就可以使用一样的二抗。大大减少标记不同抗体的时间和花费。直接法需要先纯化抗原，再吸附。费时费力

双抗体夹心法：(1) 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。(2) 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。(3) 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。(4) 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。(5) 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。(6) 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

你应该去咨询专家，才能获得正确的答案的。

ELISA的最基本的要求是：抗原或抗体的固相化、抗原或抗体的酶标记和底物系统。既然是双抗体夹心法，就必须把抗体进行包被，加以酶标记的抗体，才能形成夹心，用于检测抗原。

但在包被是要确定包被抗体的最佳浓度，请问怎么确定？ 我对于elisa试剂盒不是很了解，我是做化学发光试剂盒的。只能给你一个参考的数值，具体的还要

代那

你可以扩大包板范围，选用4倍稀释，选择3个浓度来包被，如1ug，4ug，16ug来包被，检抗可以选择4个，1：1000，1：2000，1：4000，1：8000.在根据你滴定的结果确定具体的包被浓度和检抗的稀释范围。

ELISA酶联免疫吸附实验1.原理：免疫分析是一种利用特定抗体与抗原或半抗原发生的高选择性高特异性识别和结合原理，对待测抗体或者抗原进行分析测定的方法，酶联免疫吸附分析（下称ELISA）是免疫分析的一种，分三个部分组成：免疫识别，信号输出和数据处理。2.步骤：免疫识别是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗体，而后利用抗体识别待测的抗原（通常是疾病的蛋白质生物标记物，病毒，细菌等等，从复杂待测液中将抗原吸附到96孔板表面。接着用带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、荧光或放射性标记的抗体通过直接或者间接的方式输出识别信号。最后利用信号强度，标准样品浓度梯度等信息计算得出待测样中目标抗原的浓度。3.分类：根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等等。其中双抗体夹心法在商业应用上最常见。双抗体夹心法：①：抗体包被 在96孔板上包被抗体。由于酶标板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯环与抗体的氨基酸残基具有类似π-π堆积作用的引力，结合静电和疏水作用，可以将抗体吸附于其表面。然后，将未吸附的抗体用缓冲液清洗后，加入含有明胶或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分。加入封闭液的目的，是防止其他蛋白因静电或疏水作用吸附在96孔板上，造成假阳性信号，干扰后续实验的进行。②：免疫识别 在96孔板上包被抗体后，加入待测样，并在37°C环境下孵育一段时间，通常是1-2小时。此时酶标板上的抗体与待测抗原进行特异性识别结合。此处抗体的质量是关键，好的抗体既能特异性高效地结合抗原又不受待测样中其他生物大分子、蛋白质和无机盐等成分的影响。③：洗板 将未结合的抗原洗掉，加入该抗原所对应的识别抗体并在37°C下继续培养1-2小时，接着将未连接上抗原的抗体洗掉。④：酶标信号输出 加入带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的酶标二抗，用于和标准抗体结合。在培养30分钟后洗掉未连接的二抗，并加入显色剂显色。根据显色的结果判断抗原的浓度。一般认为，抗原浓度与显色后的发光强度呈正相关。免疫竞争法以抗原竞争抗体为例，在上述免疫夹心法操作步骤的第二步加入待测抗原后，立刻加入酶标抗原，使之与待测抗原竞争识别酶标板上的抗体。当待测抗原浓度越高，能够连上酶标板上抗体的酶标抗体就越少，输出的信号就越少。这样待测样浓度与酶显色信号就呈逆相关。

【答案】：AELISA双抗体夹心法检测抗原是利用包被在固相载体上的抗体和待测抗原结合，然后待测抗原与酶标记的抗体结合形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物来检测的。

所谓双抗体夹心法就是指，两种抗体包裹待测抗原，通过酶标记标示出来经过显色后读出具体的数据最终计算出浓度的方法，铺板（多抗体）—样本（待测抗原）—结合物（单抗）—显色—终止—读数进行计算。

竞争法一般用于检测无法同时与两种抗体结合的小分子抗原，其原理为： 将针对小分子抗原的抗体包被在酶标板上，检测时加入待测样本，使样本中的待测抗原与酶标板上的抗体结合，然后加入HRP酶标记的抗原，此抗原也可与酶标板上的抗体结合，由于酶标板上固著的抗体数量有限，因此当样本中抗原的量越多，则HRP酶标记抗原可结合的包被抗体就越少，两种抗原竞争结合包被抗体，所以称为竞争法，接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，当样本中抗原量越多，代表酶标板孔内留下的HRP标记抗原越少，显色也就越浅； 夹心法又叫双抗夹心法，用于检测较大分子的抗原或抗体，又分为：双抗体夹心法，用于检抗原；和双抗原夹心法用于检抗体。

将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面。双抗体夹心法，其基本原理是将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待检标本，通过加入检测抗体，酶标记第二抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。ELISA是以体外抗原抗体反应为基础，将抗原抗体特异性反应与酶的高效催化作用相结合的一种检测方法，灵敏度可达皮克(pg/mL)水平。它是目前商业应用最为成熟的免疫分析方法之一，在医学实验、临床诊断、生物制药方面的运用也极为广泛。目前，常见的ELISA类型有四种：双抗夹心法、直接法、间接法和竞争法。

双抗体夹心的意思是包被抗体-检测抗原-酶标抗体形成夹心结构。至于是单抗或者多抗都可以。如果是酶标二抗（二抗就是抗抗体）的话，一般是包被抗原-抗体-酶标二抗，这种是间接法的

正确答案:A解析：ELISA双抗体夹心法检测抗原是利用包被在固相载体上的抗体和待测抗原结合，然后待测抗原与酶标记的抗体结合形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物来检测的。

竞争法一般用于检测无法同时与两种抗体结合的小分子抗原，其原理为：将针对小分子抗原的抗体包被在酶标板上，检测时加入待测样本，使样本中的待测抗原与酶标板上的抗体结合。然后加入HRP酶标记的抗原，此抗原也可与酶标板上的抗体结合，由于酶标板上固著的抗体数量有限，因此当样本中抗原的量越多，则HRP酶标记抗原可结合的包被抗体就越少，两种抗原竞争结合包被抗体，所以称为竞争法。接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，当样本中抗原量越多，代表酶标板孔内留下的HRP标记抗原越少，显色也就越浅。百特纯大分子Meretciel的测激素的ELISA试剂盒有些就是竞争法的。夹心法又叫双抗夹心法，用于检测较大分子的抗原或抗体，又分为：双抗体夹心法，用于检抗原；和双抗原夹心法用于检抗体。以双抗体夹心法为主，下面以双抗体夹心法为例讲解原理（双抗原夹心法类似）：首先将具有专一性之抗体包被（coating）于酶标板上，检测时加入待测样本，样本中若含有待测抗原，则会与酶标板上包被的抗体专一性结合，然后加入另一种针对待检抗原的抗体，通常称为检测抗体，包被抗体和检测抗体将抗原夹在中间所以叫双抗夹心。检测抗体通常带有HRP酶标记，接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，样本中抗原量越多则显色越深。现在很多ELISA试剂盒生产厂家比如：优尔生和百特纯大分子Meretciel将生物素-亲和素放大系统引入双抗夹心法，也就是在检测抗体上标记生物素，然后加入HRP酶标记的亲和素（或链亲和素），利用亲和素可以和生物素分子紧密结合的特性，将HRP酶连接到检抗上，接着加入底物显色。也有引入二抗的，如下图，检测抗体不标记，再加入HRP标记的二抗与检测抗体结合

【答案】：B双抗体夹心法的原理是利用连接于固相载体上的抗体（未标记）和酶标抗体可分别与样品中被检测抗原分子上2个不同抗原表位结合，形成固相抗体和酶标抗体免疫复合物。

不直接标记一抗而标记二抗，这是从生产成本上考虑的。二抗大部分是通用的，标记一次可以大量标记，比如10ml或者更多的浓缩液，可以生产上千上万的试剂盒。一次检测就行了而一抗种类很多，量少，如果标记一抗，比较费事。次次得检测（标记完得检测）。HRP标记不是很简单的事科研用的试剂盒。单品销售量很小的，不值当。但临床上的ELISA试剂盒是直接标记在一抗上的，他们量大。这样也用着简单。还有一个，科研试剂盒也不一定用的酶标二抗，有的是生物素放大系统，这样提离灵敏度。

酶免法(ELISA)和化学发光法(CLIA)是一种免疫测定技术，可用于检测乙肝、艾滋病等传染性疾病，区别如下：1、原理上的区别化学发光法依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量。酶免法原理是在测定时把受检标本和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体起反应加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。

ELISA只能检测溶液中的细胞因子浓度。而流式检测细胞因子有两种机理：固定细胞后，使用荧光抗体检测。检测到的是每个细胞内的细胞因子的量使用表面粘附抗体的微珠，基本原理和ELISA相似。但是可以同时检测数十种细胞因子在溶液中的浓度。