elisa

这个是因为反应过于激烈，请稀释你的样本或者抗原抗体。如果试剂盒是订购的成品，标准品孔无问题，一般稀释你的待测样品。如果标准孔也没有差别的话，就得怀疑是试剂盒的问题了。如果是你自己包被的试剂盒的话，可能要优化的地方就多了，就是做不同的稀释吧。

在elisa实验中所需要的一个重要显色成分是显色剂A（含过氧化氢）为供氢体（DH2）。elisa试剂盒酶联免疫诊断试剂盒的底物A就是显色剂A（含过氧化氢）为供氢体（DH2）,底物B就是显色剂B（含TMB）,用于显色。另外，常用的底物还有：AP的底物，常用的为对-硝基苯磷酸脂（PNP），其反应物为黄色的对硝基酚，测读波长为405nm2）GOD的底物，为葡萄糖，供氢体为对硝基蓝四氮唑，反应产物为不溶性的蓝色沉淀什么是TMB？TMB即四甲基联苯胺（3，3"，5，5"-Tetramethylbenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。

包被100 ul，你的反应体系应该就是100 ul。除了封闭用150 ul，其余所有包括TMB都用100 ul没有问题。终止液可以只加50 ul，2M的硫酸足够强了。看你OD值下降了，主要原因应该就是抗原和二抗的量都加少了。由于有封闭这一步，你不用担心气泡带着抗原超过了100 ul体系，只要不超过150 ul就可以（当然对于好的移液枪操作，不应该造成气泡）。TMB是HRP的底物，自己不能显色，但随着反应时间延长，显色是会加深，根据自己实际反应来控制反应时间，不用管别人推荐的时间。反应时间主要看阳性对照的OD值，即不能太长，使得阳性对照超出了仪器检测范围，或实验组将底物全部反应完（通常底物是过量的），造成实验组无差别；也不能太短，造成检测灵敏度下降。

因为TMB是显色液啊，变蓝实属于正常现象哈，这点是可以肯定的咯！

TMB无色时为0价蓝色时正1价黄色时正2价

额！培植物不知道！不过效果还不错！

配方一：底物显色A液：醋酸钠13.6g ,柠檬酸1.6g,30%双氧水0.3ml,蒸馏水加至500ml.底物显色B液 :乙二胺四乙酸二钠0.2g,柠檬酸0.95g,甘油 50ml,取0.15g TMB溶于3mlDMSO中,蒸馏水加至500ml.使用的时候根据需要量取等量AB液混匀后使用配方二：底物缓冲液(pH 5.0磷酸钠柠檬酸)：0.2 mol/L Na2HPO425.7 ml，0.1 mol/L柠檬酸24.3 mL，50mL蒸馏水TMB(四甲基联苯胺)使用液：0.5 ml 2 mg/mL TMB无水乙醇溶液，10 mL底物缓冲液，32μL30% H2O2混合，现用现配。将底物缓冲液与TMB使用液按1：1混匀即可，现用现配。

【答案】：A邻苯二胺、四甲基联苯胺在ELISA中常作为HRP的底物；硝基苯磷脂常常作为AP的底物。

TMB显色液是一种采用了最新单一溶液TMB显色技术，通过辣根过氧化物酶(HRP)催化TMB显色，用于ELISA等的显色液。TMB对人体有刺激性，请注意适当防护，如果发现TMB显色液出现混浊或颜色变成较深的蓝色，应该停止使用。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

HRP底物：TMB--H2O2系统。经多年使用比较如下：国外商品化（双组份与单组份比较）：双组份的灵敏度比较高，保存时间也很长（一般4度放3-5年没有问题），单组份的要差一些。国内的：商品化的双组份灵敏度和保存时间与进口大公司的相当；单组份的：哈哈。

读 ：么力洒

直接法需要先把抗原吸附到盘子的表面，然后再加抗体。而间接法盘子表面是事先吸附好了抗体，便于大规模的商业化生产。更重要的是，间接法可以使用统一的标记二抗，这样即使“免疫第二种动物获得的抗体”千变万化，只要都是来源于同一种动物，就可以使用一样的二抗。大大减少标记不同抗体的时间和花费。直接法需要先纯化抗原，再吸附。费时费力

双抗体夹心法：(1) 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。(2) 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。(3) 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。(4) 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。(5) 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。(6) 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

你应该去咨询专家，才能获得正确的答案的。

ELISA的最基本的要求是：抗原或抗体的固相化、抗原或抗体的酶标记和底物系统。既然是双抗体夹心法，就必须把抗体进行包被，加以酶标记的抗体，才能形成夹心，用于检测抗原。

但在包被是要确定包被抗体的最佳浓度，请问怎么确定？ 我对于elisa试剂盒不是很了解，我是做化学发光试剂盒的。只能给你一个参考的数值，具体的还要

代那

你可以扩大包板范围，选用4倍稀释，选择3个浓度来包被，如1ug，4ug，16ug来包被，检抗可以选择4个，1：1000，1：2000，1：4000，1：8000.在根据你滴定的结果确定具体的包被浓度和检抗的稀释范围。

ELISA酶联免疫吸附实验1.原理：免疫分析是一种利用特定抗体与抗原或半抗原发生的高选择性高特异性识别和结合原理，对待测抗体或者抗原进行分析测定的方法，酶联免疫吸附分析（下称ELISA）是免疫分析的一种，分三个部分组成：免疫识别，信号输出和数据处理。2.步骤：免疫识别是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗体，而后利用抗体识别待测的抗原（通常是疾病的蛋白质生物标记物，病毒，细菌等等，从复杂待测液中将抗原吸附到96孔板表面。接着用带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、荧光或放射性标记的抗体通过直接或者间接的方式输出识别信号。最后利用信号强度，标准样品浓度梯度等信息计算得出待测样中目标抗原的浓度。3.分类：根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等等。其中双抗体夹心法在商业应用上最常见。双抗体夹心法：①：抗体包被 在96孔板上包被抗体。由于酶标板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯环与抗体的氨基酸残基具有类似π-π堆积作用的引力，结合静电和疏水作用，可以将抗体吸附于其表面。然后，将未吸附的抗体用缓冲液清洗后，加入含有明胶或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封闭液以封闭酶标板上未结合抗体的部分。加入封闭液的目的，是防止其他蛋白因静电或疏水作用吸附在96孔板上，造成假阳性信号，干扰后续实验的进行。②：免疫识别 在96孔板上包被抗体后，加入待测样，并在37°C环境下孵育一段时间，通常是1-2小时。此时酶标板上的抗体与待测抗原进行特异性识别结合。此处抗体的质量是关键，好的抗体既能特异性高效地结合抗原又不受待测样中其他生物大分子、蛋白质和无机盐等成分的影响。③：洗板 将未结合的抗原洗掉，加入该抗原所对应的识别抗体并在37°C下继续培养1-2小时，接着将未连接上抗原的抗体洗掉。④：酶标信号输出 加入带有辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的酶标二抗，用于和标准抗体结合。在培养30分钟后洗掉未连接的二抗，并加入显色剂显色。根据显色的结果判断抗原的浓度。一般认为，抗原浓度与显色后的发光强度呈正相关。免疫竞争法以抗原竞争抗体为例，在上述免疫夹心法操作步骤的第二步加入待测抗原后，立刻加入酶标抗原，使之与待测抗原竞争识别酶标板上的抗体。当待测抗原浓度越高，能够连上酶标板上抗体的酶标抗体就越少，输出的信号就越少。这样待测样浓度与酶显色信号就呈逆相关。

【答案】：AELISA双抗体夹心法检测抗原是利用包被在固相载体上的抗体和待测抗原结合，然后待测抗原与酶标记的抗体结合形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物来检测的。

所谓双抗体夹心法就是指，两种抗体包裹待测抗原，通过酶标记标示出来经过显色后读出具体的数据最终计算出浓度的方法，铺板（多抗体）—样本（待测抗原）—结合物（单抗）—显色—终止—读数进行计算。

竞争法一般用于检测无法同时与两种抗体结合的小分子抗原，其原理为： 将针对小分子抗原的抗体包被在酶标板上，检测时加入待测样本，使样本中的待测抗原与酶标板上的抗体结合，然后加入HRP酶标记的抗原，此抗原也可与酶标板上的抗体结合，由于酶标板上固著的抗体数量有限，因此当样本中抗原的量越多，则HRP酶标记抗原可结合的包被抗体就越少，两种抗原竞争结合包被抗体，所以称为竞争法，接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，当样本中抗原量越多，代表酶标板孔内留下的HRP标记抗原越少，显色也就越浅； 夹心法又叫双抗夹心法，用于检测较大分子的抗原或抗体，又分为：双抗体夹心法，用于检抗原；和双抗原夹心法用于检抗体。

将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面。双抗体夹心法，其基本原理是将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待检标本，通过加入检测抗体，酶标记第二抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。ELISA是以体外抗原抗体反应为基础，将抗原抗体特异性反应与酶的高效催化作用相结合的一种检测方法，灵敏度可达皮克(pg/mL)水平。它是目前商业应用最为成熟的免疫分析方法之一，在医学实验、临床诊断、生物制药方面的运用也极为广泛。目前，常见的ELISA类型有四种：双抗夹心法、直接法、间接法和竞争法。

双抗体夹心的意思是包被抗体-检测抗原-酶标抗体形成夹心结构。至于是单抗或者多抗都可以。如果是酶标二抗（二抗就是抗抗体）的话，一般是包被抗原-抗体-酶标二抗，这种是间接法的

正确答案:A解析：ELISA双抗体夹心法检测抗原是利用包被在固相载体上的抗体和待测抗原结合，然后待测抗原与酶标记的抗体结合形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物来检测的。

竞争法一般用于检测无法同时与两种抗体结合的小分子抗原，其原理为：将针对小分子抗原的抗体包被在酶标板上，检测时加入待测样本，使样本中的待测抗原与酶标板上的抗体结合。然后加入HRP酶标记的抗原，此抗原也可与酶标板上的抗体结合，由于酶标板上固著的抗体数量有限，因此当样本中抗原的量越多，则HRP酶标记抗原可结合的包被抗体就越少，两种抗原竞争结合包被抗体，所以称为竞争法。接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，当样本中抗原量越多，代表酶标板孔内留下的HRP标记抗原越少，显色也就越浅。百特纯大分子Meretciel的测激素的ELISA试剂盒有些就是竞争法的。夹心法又叫双抗夹心法，用于检测较大分子的抗原或抗体，又分为：双抗体夹心法，用于检抗原；和双抗原夹心法用于检抗体。以双抗体夹心法为主，下面以双抗体夹心法为例讲解原理（双抗原夹心法类似）：首先将具有专一性之抗体包被（coating）于酶标板上，检测时加入待测样本，样本中若含有待测抗原，则会与酶标板上包被的抗体专一性结合，然后加入另一种针对待检抗原的抗体，通常称为检测抗体，包被抗体和检测抗体将抗原夹在中间所以叫双抗夹心。检测抗体通常带有HRP酶标记，接着加入HRP酶的底物TMB，TMB被酶催化发生颜色反应，样本中抗原量越多则显色越深。现在很多ELISA试剂盒生产厂家比如：优尔生和百特纯大分子Meretciel将生物素-亲和素放大系统引入双抗夹心法，也就是在检测抗体上标记生物素，然后加入HRP酶标记的亲和素（或链亲和素），利用亲和素可以和生物素分子紧密结合的特性，将HRP酶连接到检抗上，接着加入底物显色。也有引入二抗的，如下图，检测抗体不标记，再加入HRP标记的二抗与检测抗体结合

【答案】：B双抗体夹心法的原理是利用连接于固相载体上的抗体（未标记）和酶标抗体可分别与样品中被检测抗原分子上2个不同抗原表位结合，形成固相抗体和酶标抗体免疫复合物。

不直接标记一抗而标记二抗，这是从生产成本上考虑的。二抗大部分是通用的，标记一次可以大量标记，比如10ml或者更多的浓缩液，可以生产上千上万的试剂盒。一次检测就行了而一抗种类很多，量少，如果标记一抗，比较费事。次次得检测（标记完得检测）。HRP标记不是很简单的事科研用的试剂盒。单品销售量很小的，不值当。但临床上的ELISA试剂盒是直接标记在一抗上的，他们量大。这样也用着简单。还有一个，科研试剂盒也不一定用的酶标二抗，有的是生物素放大系统，这样提离灵敏度。

酶免法(ELISA)和化学发光法(CLIA)是一种免疫测定技术，可用于检测乙肝、艾滋病等传染性疾病，区别如下：1、原理上的区别化学发光法依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量。酶免法原理是在测定时把受检标本和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体起反应加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。

ELISA只能检测溶液中的细胞因子浓度。而流式检测细胞因子有两种机理：固定细胞后，使用荧光抗体检测。检测到的是每个细胞内的细胞因子的量使用表面粘附抗体的微珠，基本原理和ELISA相似。但是可以同时检测数十种细胞因子在溶液中的浓度。

elisa法的基本原理：它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强。

同楼上的

RIA 的要高一些，

还是没有活的希望

ELISA实验的原理似乎很简单，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，间中夹杂着洗涤和封闭。然而，即使是平淡无奇的洗涤和封闭，如果做得不太好，也有可能毁了整个实验。在实验结束时，我们是否能获得有意义的信息，ELISA试剂盒这在很大程度上取决于结果的信噪比。ELISA试剂盒背景噪音会影响您对结果的判断。如何降低ELISA的背景，下面有一些tips。洗涤很重要洗涤步骤看似很无聊，其实很重要，因为如果未结合的材料（如非特异结合的抗体或检测试剂）残留在微孔板中，那么它会增加背景噪音。如有必要，可增加洗涤液中的盐浓度，这会阻止非特异结合反应。如果背景过高，而您怀疑洗涤不够时，可以尝试增加洗涤次数。封闭更关键封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高，怀疑封闭不充分，那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液，或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰，那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间，但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液：蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素，包括微孔板的表面试剂、ELISA试剂盒吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合，但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。ELISA实验最常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定，在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用，ELISA试剂盒因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度（正常浓度为0.01-0.1%），它会降低特异结合，产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液，后者可协助洗涤过程中的封闭。蛋白封闭液则有所不同，是永久的。它们与开放位点结合并封闭，同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。不过，它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。抗体浓度须优化ELISA实验我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤，ELISA试剂盒但是如果试剂稍有不同，则可能需要优化抗体的量。记住，非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点，切勿使用过多的一抗或二抗。检测试剂要适量另一点也很显而易见：切勿使用过多的检测试剂。如果浓度过高，或者未正确稀释，则会导致高背景。也不要显色过度，如有必要，优化一下何时应加入终止液。

ELISA实验的原理似乎很简单，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，间中夹杂着洗涤和封闭。然而，即使是平淡无奇的洗涤和封闭，如果做得不太好，也有可能毁了整个实验。在实验结束时，我们是否能获得有意义的信息，这在很大程度上取决于结果的信噪比。背景噪音会影响您对结果的判断。如何降低ELISA的背景，下面有一些tips。洗涤很重要洗涤步骤看似很无聊，其实很重要，因为如果未结合的材料（如非特异结合的抗体或检测试剂）残留在微孔板中，那么它会增加背景噪音。如有必要，可增加洗涤液中的盐浓度，这会阻止非特异结合反应。如果背景过高，而您怀疑洗涤不够时，可以尝试增加洗涤次数。封闭更关键封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高，怀疑封闭不充分，那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液，或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰，那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间，但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液：蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素，包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合，但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。最常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定，在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用，因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度（正常浓度为0.01-0.1%），它会降低特异结合，产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液，后者可协助洗涤过程中的封闭。蛋白封闭液则有所不同，是永久的。它们与开放位点结合并封闭，同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。不过，它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。抗体浓度须优化我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤，但是如果试剂稍有不同，则可能需要优化抗体的量。记住，非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点，切勿使用过多的一抗或二抗。

做好对照正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。实验条件的选择在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:（1）　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。（3）　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。（4）　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。进口分装：检测范围和灵敏度不同，用量少时，可使用分装，前期是它的长久性不是很好。试剂盒的标准曲线最高点OD 值均在2.0±0.2，零孔的OD 值都控制在0.10以下。试剂盒的标准曲线相关系数R≥0.98。试剂盒重复性好，板内、板间变异系数均<9 %。试剂的组份都多给20%的富余量，确保完成48/96孔的检测，避免分次检测可能造成试剂量不足的情况。检测抗体及酶结合物的稀释度合适(均为1:30), 方便试验操作者准确地做稀释工作，保证实验结果的重复性。白介素6是一种细胞因子,已被证实为B细胞分化因子.它是一种抗体形成系统,它的生理特性,如肝细胞急性蛋白合成的诱导和基于和白介素3协同作用的生长刺激等,也备受关注. 并且已证实白介素-6与病理学存在稳定的相关关系.例如,报道多种疾病的生长因子为白介素-6, 骨髓瘤细胞能合成白介素-6并表达白介素-6受体.此外, 白介素6在多种炎性疾病和自身免疫疾病发挥重要的作用. 此试剂盒能高灵敏度的检测小鼠血清和细胞基质上清的白介素6 原理 此试剂盒运用了两种特异性抗体,洗板后加入TMB底物液显色,显色的强度与小鼠的白介素-6的量成正比. 检测范围 10.94的 700 pg/mL 预期用途

1、Cell-Based ELISA 的优点：Cell-Based ELISA（基于细胞的ELISA）是一种全新的ELISA技术，有两个最突出的优点：1.1不需要抽提蛋白、包被微孔板：细胞直接在微孔板里培养，待检测的时候，将细胞固定在微孔板上并进行通透处理即可。这样就避免了抽提蛋白时，由于客观和主观上引起样品的损失而导致实验结果在一定程度上偏离了实际情况。同时不用包被微孔板，简化了实验流程，有助于提高效率。科研人员在一个96 孔酶联板上，便能检测目标细胞蛋白经刺激或抑制作用后的表现。由于省去抽提蛋白和裂解细胞的步骤，样本的损失也能降到最低，比起其他普通的ELISA 测定方法，这项全新的ELISA 技术能更快速、更方便地一次检测大量的细胞内蛋白。1.2 可同时检测两种不同蛋白：封闭后加入两种抗不同蛋白且来源于不同宿主的一抗，然后再加入不同的二抗，加入两种荧光底物，检测两个波长。同时检测两种蛋白的好处是显而易见的，可以减少工作量，此外还可以满足一些特殊的实验需要，例如，需要测定某个蛋白的磷酸化比例，就需要测定磷酸化蛋白的数量和总蛋白的数量，这两个测定在同一次实验进行，有助于消除实验误差，得到更为精确的实验结果。2、Cell-Based ELISA 的两种技术：某些公司发展了双通道Cell-Based ELISA技术；双通道与单通道Cell-based ELISA比较：双通道cell-based ELISA，顾名思义，即一次可以同时检测两种目的蛋白，R&D Systems提供的Cell-based ELISA就是双通道cell-based ELISA，原理略：（需要荧光检测方式和相应仪器）；单通道cell-based ELISA，即一次只能检测一种目的蛋白，他和普通ELISA的主要区别在于样品处理过程3、cell-based ELISA 的应用：该产品，最多发展起来的是用于检测磷酸化和非磷酸化蛋白的相对含量；4、有cell-based ELISA产品的公司：目前，多家elisa产品提供商均提供cell based elisa 试剂盒，如Rnd systems， raybiotech， ebioscience，millipore 等公司；5、如何自己进行cell based elisa实验？事实上，根据单通道的cell based elisa原理，可以自己建立cell based elisa实验系统；细胞加入培养板中；加入刺激物或者抑制剂进行培养；对细胞进行固定或者封闭；加入第一抗体；加入HRP 结合的二抗（二抗的选择，同western blot）；加入底物进行显色；

酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay简称ELISA）是在免疫酶技术。ELISA的基本原理有三条：1抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；2抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；3酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

强酸都可以.我们这用的是硫酸

小鼠ELISA试剂盒用于测定小鼠体内特定蛋白质的含量的检测方法，检测范围指的是该试剂盒可以检测的目标蛋白质的浓度范围。不同品牌和型号的小鼠ELISA试剂盒的检测范围可能会有所不同，小鼠ELISA试剂盒的检测范围通常在pg/mL到ng/mL之间。对于ELISA试剂盒，其基本原理是将样本中的目标蛋白质与特异性抗体结合，然后通过荧光、颜色等方式进行检测。ELISA试剂盒检测范围的确定与所使用的抗体、检测物以及检测反应的灵敏度密切相关。检测范围应该根据需要进行选择，以确保其可以准确地检测到实验样本中的目标蛋白质，同时避免样本中浓度过高或过低而导致的检测结果失真。小鼠elisa试剂盒当实验需要检测的目标蛋白质浓度特别高或特别低时，可能需要选择不同品牌和型号的小鼠ELISA试剂盒来满足实验需求。在选择适当的ELISA试剂盒时，需要考虑以下因素：1、抗体特异性：选择具有高特异性的抗体，以确保可以准确地检测目标蛋白质。2、基质干扰：样本中可能存在不同程度的基质干扰。为了避免基质干扰影响检测结果，应选择适当的样本预处理方法。3、灵敏度：对于浓度较低的目标蛋白质，需使用灵敏度较高的ELISA试剂盒。4、动态范围：动态范围内可以实现线性检测，结果与目标蛋白质浓度成正比。因此，应根据预期的目标蛋白质浓度选择适当的ELISA试剂盒。Elisa检测在进行小鼠ELISA实验时，还需要注意以下几点：1、样本获取：样本的采集和保存条件应符合标准要求，以避免样本中的蛋白质失活或降解。2、样本稀释：通常情况下，样本需要进行恰当的稀释处理，以确保检测结果在试剂盒的检测范围内。3、交叉反应：不同抗体之间或与其他组分之间可能存在交叉反应，因此需要进行适当的交叉反应实验。4、实验重复：为了确保结果的准确性和可靠性，建议进行多次实验，以获得重复性较好的数据。小鼠ELISA试剂盒的检测范围通常在pg/mL到ng/mL之间，但在选择试剂盒时需要考虑多方面因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。

除脂 ： 在操作含有脂肪的样本的前处理过程中， 都会接触到除脂这个过程， 一般的除脂过 程都是通过液液分配萃取过程进行实现的， 脂肪属于非极性化合物， 而一般说来药物大 多属于极性化合物， 根据有机化学中相似相溶的原理可知， 在进行除脂过程一般选用非 极性试剂进行除脂，比如正已烷、四氯甲烷、正庚烷、环已烷或其他饱和烷烃等，而在 实验操作过程中，一般说来，还需要考虑到试剂的毒性以及其他危害性，所以正常的实 验过程中，最好选用对人体伤害较少且不容易挥发的试剂进行实验操作，比如正已烷、 正庚烷等，这样既可以达到除脂的效果，也可以保证该方法的回收率。 如果实验室并无以上所列的这几种试剂，也可利用其他非极性有机化合物进行代 替，但不宜选用分子量相对过大的试剂。 在除脂过程中，一般说来操作后脂肪会带有一定的颜色，可能为浅黄色，而无机相 则为透明无色液体， 以此也可以清楚的知道目标相处于上层还是下层， 避免造成实验误 差。 。

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测.在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab")或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标(参见6.2).双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心.2.2 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合.标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应.如抗原为高纯度的,可直接包被固相.如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原.洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应.竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法.另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应.抗HBe的检测一般采用此法.2.5 竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式.其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合.标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅.小分子激素,药物等ELISA测定多用此法.

做好对照正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。实验条件的选择在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:（1）　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。（2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。（3）　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。（4）　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。进口分装：检测范围和灵敏度不同，用量少时，可使用分装，前期是它的长久性不是很好。试剂盒的标准曲线最高点OD 值均在2.0±0.2，零孔的OD 值都控制在0.10以下。试剂盒的标准曲线相关系数R≥0.98。试剂盒重复性好，板内、板间变异系数均<9 %。试剂的组份都多给20%的富余量，确保完成48/96孔的检测，避免分次检测可能造成试剂量不足的情况。检测抗体及酶结合物的稀释度合适(均为1:30), 方便试验操作者准确地做稀释工作，保证实验结果的重复性。白介素6是一种细胞因子,已被证实为B细胞分化因子.它是一种抗体形成系统,它的生理特性,如肝细胞急性蛋白合成的诱导和基于和白介素3协同作用的生长刺激等,也备受关注. 并且已证实白介素-6与病理学存在稳定的相关关系.例如,报道多种疾病的生长因子为白介素-6, 骨髓瘤细胞能合成白介素-6并表达白介素-6受体.此外, 白介素6在多种炎性疾病和自身免疫疾病发挥重要的作用. 此试剂盒能高灵敏度的检测小鼠血清和细胞基质上清的白介素6 原理 此试剂盒运用了两种特异性抗体,洗板后加入TMB底物液显色,显色的强度与小鼠的白介素-6的量成正比. 检测范围 10.94的 700 pg/mL 预期用途

不准确

一、实验目的1.深入了解ELISA 法测定抗体效价的原理。2.掌握ELISA 法测定单克隆抗体效价的方法。二、实验原理ELISA 是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。ELISA 法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。在ELISA 法中.酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。目前常用的几种ELISA 方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。……详细资料请参考：on http://www.bio1000.com/experiment/immunology/229066.html

双抗体夹心法实验原理： 用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗C3抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗C3抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色.TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的C3呈正相关.用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度.

1、Cell-BasedELISA的优点：Cell-BasedELISA（基于细胞的ELISA）是一种全新的ELISA技术，有两个最突出的优点：1.1不需要抽提蛋白、包被微孔板：细胞直接在微孔板里培养，待检测的时候，将细胞固定在微孔板上并进行通透处理即可。这样就避免了抽提蛋白时，由于客观和主观上引起样品的损失而导致实验结果在一定程度上偏离了实际情况。同时不用包被微孔板，简化了实验流程，有助于提高效率。科研人员在一个96酶联板上，便能检测目标细胞蛋白经刺激或抑制作用后的表现。由于省去抽提蛋白和裂解细胞的步骤，样本的损失也能降到最低，比起其他普通的ELISA测定方法，这项全新的ELISA技术能更快速、更方便地一次检测大量的细胞内蛋白。1.2可同时检测两种不同蛋白：封闭后加入两种抗不同蛋白且来源于不同宿主的一抗，然后再加入不同的二抗，加入两种荧光底物，检测两个波长。同时检测两种蛋白的好处是显而易见的，可以减少工作量，此外还可以满足一些特殊的实验需要，例如，需要测定某个蛋白的磷酸化比例，就需要测定磷酸化蛋白的数量和总蛋白的数量，这两个测定在同一次实验进行，有助于消除实验误差，得到更为精确的实验结果。2、Cell-BasedELISA的两种技术：某些公司发展了双通道Cell-BasedELISA技术；双通道与单通道Cell-basedELISA比较：双通道cell-basedELISA，顾名思义，即一次可以同时检测两种目的蛋白，R&DSystems提供的Cell-basedELISA就是双通道cell-basedELISA，原理略：（需要荧光检测方式和相应仪器）；单通道cell-basedELISA，即一次只能检测一种目的蛋白，他和普通ELISA的主要区别在于样品处理过3、cell-basedELISA的应用：该产品，最多发展起来的是用于检测磷酸化和非磷酸化蛋白的相对含量；4、有cell-basedELISA产品的公司：目前，多家elisa产品提供提供cellbasedelisa试剂盒，如Rndsystems，raybiotech，ebioscience，millipore等公司；5、如何自己进行cellbasedelisa实验？事实上，根据单通道的cellbasedelisa原理，可以自己建立cellbasedelisa实验系统；细胞加入培养板中；加入刺激物或者抑制剂进行培养；对细胞进行固定或者封闭；加入第一抗体；加入HRP结合的二抗（二抗的选择，同westernblot）；加入底物进行显色；

　　两者都是基于抗原与抗体之间能发生特异性结合这一基本原理。　　免疫组化是对组织标本或细胞标本中的抗原类物质如细胞中的病原体、蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、酶、激素、核酸等进行定位或定量检测，检测材料是石蜡切片或细胞涂片，检测时用到的抗体可以用酶标记，也可以用荧光素标记。 酶联免疫吸附试验既可以检测抗原也可以检测抗体，若检测抗体，则酶标板需要用抗原包被；若检测抗原，则酶标板需要用抗体包被。

是用空气结合的

ELISA是免疫学的经典实验，酶联免疫吸附测定enzyme linked immunosorbent assay（简写ELISA），指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。

elisa实验原理是：通过特定抗原与抗体的相互作用来检测和定量分析目标物质。下面将详细介绍ELISA实验的原理：1.ELISA的基本原理实验基于抗原与抗体的高度特异性结合，利用酶标记技术和吸附作用进行检测和定量分析。基本步骤包括：涂覆固相载体、非特异性结合位点的阻断、特异性抗原与抗体的结合、酶标记二抗的结合、底物添加和反应终止。通过测量底物的酶催化生成物的颜色或荧光强度，可以间接反映出目标物质的存在量。2.直接ELISA的原理直接ELISA中，目标抗原直接与被酶标记的抗体结合。具体步骤包括：将抗原溶液加到固相载体上，使其吸附；添加被酶标记的特异性抗体，形成抗原-抗体复合物；洗涤去除未结合的物质；加入底物，被酶催化生成可测量的产物。产生的信号强度与目标抗原的浓度成正比。3.间接ELISA的原理间接ELISA中，目标抗原首先与非酶标记的特异性抗体结合，然后再与被酶标记的二抗结合。具体步骤包括：将抗原溶液加到固相载体上，使其吸附；添加非酶标记的抗体，形成抗原-抗体复合物。洗涤去除未结合的物质；加入被酶标记的二抗，与抗原-抗体复合物结合；再次洗涤去除未结合的物质；加入底物，被酶催化生成可测量的产物。产生的信号强度与目标抗原的浓度成正比。4.间接竞争ELISA的原理间接竞争ELISA在间接ELISA的基础上进行了一些修改，用于检测样品中特定抗原的存在量。具体步骤包括：将抗原溶液加到固相载体上，使其吸附。加入被酶标记的特异性抗体和待测样品；洗涤去除未结合的物质；加入底物，被酶催化生成可测量的产物。产生的信号强度与待测样品中特定抗原的浓度成反比。ELISA实验的原理基于抗原与抗体的特异性结合、酶标记技术和底物反应等步骤，通过测量产生的信号强度来定量分析和检测目标物质的存在量。不同类型的ELISA实验可以根据实验设计和样品特点选择合适的方法，以满足不同的研究需求。

ELISA不是结果别乱猜ELISA是一种检查方法胶体金法检测可以排除了你的检查结果是什么？如果是你高危后六周的检查结果是阴性的话你就是健康的！~好好生活吧！~好好做人！~

大鼠灌注取脑；用途：；1.用于常规HE染色，免疫组化分析；2.冰冻切片可以不做脑组织固定；3.不可用于westernblot和PCR；4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作；原理：；心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织；必要性：；1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易；2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤；3.脑内血液大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。2.冰冻切片可以不做脑组织固定。3.不可用于western blot和PCR。4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1) 麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的有效观察指标。6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。7.后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。补充：还有一种省时省剂的方法。夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。

ELISA法是现代医学临床免疫诊断的重要方法，它的基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，再使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定各类抗原，也可用于测定抗体。比如现代检测的各类病毒、寄生虫等抗原抗体、激素、肿瘤标志物还有一些毒物药物都是通过该项技术进行测定的。在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和酶作用的底物。麻烦采纳，谢谢!

概念上有本质不同，不过结果都是一个目的，可以借鉴阻断ELISA：又叫竞争ELISA,我以间接竞争ELISA为例介绍!首先包被猪瘟人工抗原4度过夜,3%脱脂牛奶封闭1H后,加入你需要检测的猪瘟样品及猪瘟提纯标准抗原50微升,再加入猪瘟抗体50微升,混匀,反应1H,再加入酶标记的抗猪瘟抗,反应1H,加入底物显色,根据标准曲线,及OD值,得出样品中的含量,样品中猪瘟含量越高,OD值越小!液相阻断：ELISA其实就是将抗体（兔抗血清）包被在ELISA板中,于此同时将待检血清做几个稀释度和已知抗原在反应板中反应；4°过夜,然后将ELISA板中包被的抗体弃掉,洗板；将反应板中一定量的反应液加入ELISA板中,37°1h；然后弃液,洗板,加入一定量的一抗（豚鼠抗血清）,与所剩抗原结合,37°1h；然后弃液,洗板,加入一定量的酶标二抗（兔抗豚鼠血清+酶标记物）,37°1h；然后弃液,洗板,加入配好的显色液,37°显色10-20分钟左右,加入终止液读数.

直接法——检测Ag将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可测定抗原总量。优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。缺点：实验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。 间接法——检测Ab用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标二抗，加底物显色。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。缺点：交互反应发生的机率较高。 双抗体夹心法——检测Ag将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗原成正比。适用于某些大分子的具有至少双表位的抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。暂时就补充这么些，你也可以问问中洪博元的技术人员还有哪些好方法。

临床上用ELISA测HBsAg的原理是（） A.双抗体夹心法B.间接法C.双抗原夹心法D.竞争法E.捕获法正确答案：A

【答案】：B在双抗体夹心法测抗原时，针对抗原两个不同决定簇的单抗分别做固相和酶标，测定时标本和酶标同时加入的技术为双位点一步法，此示意图即为该原理。

包被抗原后加入待测抗体，反应后洗板，加入酶标二抗，反应后再洗板，加入底物显色。间接Elisa方法主要用来检测抗体，例如我们对动物进行免疫后要检测抗血清的效价的话，就可以用间接Elisa方法来测。

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc 　　ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。 http://www.shjmsj.com/

这是我们试剂盒上的说明书：采用间接ELISA方法检测：用包被抗原为合成多肽抗原和基因工程抗原（包括HCV病毒结构区核心抗原和非结构区抗原）。待测样本加入已包被抗原的反应孔内孵育，若标本中含有抗HCV抗体，则该抗体与微孔内抗原形成抗原抗体复合物，加入酶结合物，经孵育后，酶结合物连接至抗原抗体复合物上，在TMB底物参与反应的情况下产生显色反应。

抗体通常是结合在固相载体上，抗原与固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是抗原蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等地影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。

口蹄疫液相阻断ELISA抗体检测方法检测针对病毒衣壳蛋白的抗体，可用于不同动物免疫效果的评估工作。其原理是先将待检血清与一定量抗原结合，占据抗原位点，然后再用已知量的阳性血清与抗原结合，最后通过检测抗原结合阳性血清的多少反推出待检血清中特异性抗体的数量，由于该试验使用酶标抗体不受待检血清来源动物种类的影响，所以适应于各种动物（猪、牛、羊）血清的检测。

目的探讨温度、孵育时间、振荡对ELISA法检测HBsAg的影响,以期进一步优化检测条件。方法采用HBsAg含量约为1ng/mL的血清标本,在4种不同条件(37℃振荡、37℃不振荡、25℃室温震荡、25℃室温不振荡)下的3个不同反应时间(10、20、30min)测定HBsAg,记录吸光度值。结果除10min37℃不振荡和25℃不振荡差异无统计学意义(P0.05)外,其余各组差异都有统计学意义(P0.05)。结论37℃振荡20min为ELISA检测HBsAg的较佳条件。

在进行ELISA实验时，为了获得更加精确的浓度检测结果，需要控制实验中液体的移动速度，而拍干水可以有效地帮助控制液体的流动速度，从而获得更加准确的实验结果。因此，在进行ELISA实验中，拍干水是一个非常重要的步骤。

血凝抑制试验有血凝素(HA)的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，一种测定抗原或抗体的技术。即加入特异性抗体或特异性抗原后，使原有的血凝反应被抑制。正常值试验后的结果呈阴性。临床意义异常结果：相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合，常用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病调查，也可用于鉴定病毒型与亚型。需要检查的人群：新生儿和孕妇者有需要，和带有相关病毒的患者，以做医疗的测定。酶联免疫吸附剂测定酶联免疫吸附测定enzyme linked immunosorbent assay（简写ELISA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。酶联免疫吸附测定（ELISA）为免疫学中的经典实验，本词条从定义、基本原理、分类方法、操作要点等方面对其进行了详细介绍。

你是不是说的这个血清HIV-1抗体检测：第一代试剂：使用HIV全病毒裂解物为抗原，应用间接法原理检测HIV抗体。如日本富士公司生产的HIV-PA试剂。第二代试剂：使用在细菌或真菌中表达的人工重组或化学合成多肽HIV抗原，应用间接法原理检测HIV抗体。基因重组通常易于在培养基中生产大量同源性抗原，产品为单一目的基因而非多样性抗原混合，特异性高于第一代试剂。第三代试剂：使用合成多肽HIV抗原（少数用重组抗原），应用双抗原（或双抗体）夹心法原理检测HIV抗体（或抗原）。由于标记HIV抗原可同时检测血清中HIV-1 IgG、IgM、 IgA抗体，此类试剂的敏感性和特异性均优于标记抗人免疫球蛋白的间接法。第四代试剂：此类试剂在第三代试剂盒基础上，将针对P24抗原的抗体与HIV-1抗原一起包被固相载体，可同时检测HIV-1 IgG、IgM、 IgA抗体和P24抗。ELISA已经发展到第四代，敏感度几乎100%特异度99.7%以上，在方法学上，不但检测血液，也可检测唾液与尿液，有常规的方法也有快速的方法。可以一滴血一分钟即出现反应。

抗体 抗原 抗体 显色 就这么简单

没学过

ELISA双抗体夹心法 原理 ELISA双抗体夹心法(enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。生物帮有相关介绍。编码RNA http://doc.bio1000.com/show-3399.html

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

1.直接法（directelisa） 将抗原直接固定在固相载体上，参加酶符号的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。优势：操作手续简略，因无须运用二抗可防止交互反响。缺陷：实验中的一抗都得用酶符号，但不是每种抗体都适合做符号，费用相对进步。2.间接法（indirectelisa） 此测定办法与直接法相似，不一样在于一级抗体没有酶符号，改用酶符号的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。优势：二抗能够加强信号，并且有多种挑选能做不一样的测定剖析。不加酶符号的一级抗体则能保存它最多的免疫反响性。缺陷：交互反响发作的机率较高。3.双抗体夹心法（sandwichelisa） 被检测的抗原包被在两个抗体之间，其间一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用酶符号后直接测定抗原的量；或不符号，再透过酶符号的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体有必要当心选择，才可防止交互反响或竞争一样的抗原联系部位。优势：高活络、高专一性，抗原无须事前纯化。缺陷：抗原必定得具有两个以上的抗体联系部位。4.竞争法（competitiveelisa） 样本里的抗原（自在抗原）和纯化并固定在固相载体上的抗原（固定抗原）一同竞争一样的抗体，当样品里的自在抗原越多，就能够联系越多的抗体，而固定抗原就只能联系到较少的抗体，反之亦然。经清洁过程，洗去自在抗原和抗体的复合物，只留下固定抗原和抗体的复合物，拿来与只要固定抗原的对照组成果相比拟，依据呈色区别就可计算出样品里的抗原含量。优势：可适用比拟不纯的样本，并且数据再现性很高。缺陷：全体的敏感性和专一性都较差。bim试剂盒为您提供！

把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面，测定时将受检样品(含待测抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物，反应结束时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例，洗涤除去反应液中其他物质，加u03bb酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物，通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中被测物质含量。

正相反。一般酶和抗体是化学键连接的。阳性对照中，抗体和抗原结合导致抗体的固定化（也就是说结合到板子上了），与抗体连接的酶就一并固定化了，所以再往酶标板中加入底物，酶就发挥作用显色了。阴性对照中，抗原没有，所以抗体不能固定化，随之没有酶的固定化，所以加入底物不显色。

elisa双抗体夹心法原理elisa双抗体夹心法(enzymelinkedimmunosorbentassay——sandwichtechnique)的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。生物帮有相关介绍。编码rnahttp://doc.bio1000.com/show-3399.html

原理LISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。特点某些分泌型蛋白，用siRNA 干扰后可以用ELISA 进行检测。ELISA法酶联免疫吸附实验(ELISA) 即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。编码RNA http://doc.bio1000.com/show-3399.html

上海科艾博生物（COIBO）科技生物学检测试剂盒、进口常规生化试剂、抗体、化学试剂、药典级试剂、标准品、血清等产品，覆盖分子生物学、生物化学、细胞生物学、免疫学、蛋白组学、生物制药与诊断试剂从大的方面说ELISA属于酶免疫技术。 免疫酶技术是将酶作为标记物，标记抗体或抗原后，与相应的抗原或抗体发生反应，通过标记酶相应底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量的检测依据。目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），如果要分类的话，它属于异相固相酶免疫技术。所谓异相是指在检测时不需要将酶标记抗原抗体和游离抗原抗体分开，所谓固相就是指的ELISA的96孔板固相载体了。看下面均相酶免疫测定的原理图：ELISA的主要原理很简单，有这么三个， 1、包被 抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，可能原理是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗体反应等免疫活性； 2、标记 抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点； 3、显色 酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或者抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。ELISA 实验设计根据检测对象的不同，我分别给童鞋们介绍抗原的检测方法设计和抗体的检测方法设计。抗原的检测设计 1、双抗夹心法 针对至少2个抗原决定簇的多价抗原。首先介绍一下抗原决定簇，抗原决定簇就是决定抗原性的特殊化学基团，也叫抗原表位，理论上一个抗原决定簇能诱导产生一种单克隆抗体（可能有童鞋又要问单克隆抗体是神马东东了，以后介绍啊）。由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（线性表位）组成或由不连续的蛋白质三维结构（构象表位）组成。临床上具有2个抗原决定簇的多价抗原有很多，比较常见有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。检测步骤也简单，就是包被、洗涤、加样、洗涤、加样、洗涤、显色。具体说来是先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，再加入待测样品，若其中含有待测抗原就会与固相抗体结合，洗掉杂质后，再加入酶标记的检测抗体进行反应，洗掉多于的酶标抗体后，加入底物显色，显色与否以及颜色的深浅就代表了待测抗原是否存在以及相对含量了，简单吧。对于双抗夹心法检测大分子抗原要注意几点，1.固相抗体和酶标检测抗体一定是分别针对待测抗原的两个不同抗原决定簇，不然两个抗体就会为争同一个决定簇而打架，会出现假阴性的不良结果；2.如果检测的样本是血清，就要注意风湿病患者体内内风湿因子RF这种奇葩异种抗体的存在，它能够神奇地结合固相抗体和检测抗体，造成假阳性的不良结果；3.包被的固相抗体含量一定是高于样品中的抗原含量，不然检测到的含量会比实际含量低；4.如果有童鞋想高端省事一些，将待测样品与酶标检测抗体同时加入固相载体，在酶标检测抗体高于样品中的待测抗原的情况下，会出现假阴性结果，这种现象书本叫钩状效应。 2、竞争法 针对小分子抗原。这种方法也可以用于大分子抗原，只是相对双抗夹心法这种强悍的策略，竞争法完全没有优势，所以竞争法只在检测小分子这个边缘地带发挥余热了。临床上主要用于T3、T4、孕酮等激素以及药物等。检测步骤与双抗夹心法更简单，包被、洗涤、加样、洗涤、显色，少了一步加样的过程，但是设计上复杂一些，首先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，然后每组样本需要分两组，一组同时加入事先混匀好的酶标检测抗原和样本的混合物，一组只加入酶标记抗原，两组颜色只差便是待测抗原的含量，有点晕啊。对于竞争法也需要注意一点，酶标记抗原和待测样本一定要事先混匀好，然后同时加入固相载体，不然会造成不公平竞争，检测出现偏差；抗体的检测设计 就方法来说，有间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法四种设计。 1、 间接法，这个是检测抗体最常用也最简单的方法。操作步骤与双抗夹心一样，只是包被是纯化的相应抗原而不是抗体了，加入样品后洗涤，再加入的酶标记抗抗体，然后显色，颜色深浅与样品中待测抗体的浓度正相关。这个间接法的原理和步骤与双抗夹心一样一样的，为了区分就把包被抗原检测抗体叫做间接法了，以此类推，之前的双抗夹心法也可以叫做直接法，命名其实就是这么回事，规则多了就容易让人糊涂。间接法也有一些自己的特点，1.酶标记抗抗体可选择性检测抗体的亚型，可用于鉴别感染时期，如果是IgM那么提示感染早期；2.酶标抗抗体检测抗体特异性不高，容易产生假阳性，如果封闭不完全，可出现全板阳性，挺吓人的。临床上常用该方法检测抗HCV抗体、抗HEV抗体、抗CMV抗体、抗HSV抗体、抗沙眼衣原体抗体等等。2、 双抗原夹心法，这个完全是山寨双抗夹心法的。原理和步骤也与双抗夹心一样一样的，与间接法相比，具有优越的灵敏度和特异性，但不是很常用，因为就目前的技术条件，想得到能用于ELISA检测的纯化抗原还是有一定的难度。临床上常用于检测HIV抗体初筛，TP抗体和抗HBs抗体等，这些检测对特异性和灵敏度，准确性都要求特别高。3、 竞争法，和检测抗原设计的竞争法完全一致，临床上用的不多，我仔细总结了一下两个很具有代表性的，也各具特点。1、抗HBc抗体，检测方法与抗原相同，包被抗原之后，分两组，一组加入预先混匀的酶标抗体和待测样品，一组只加入酶标抗体，两组的显色之差可代表待测抗体的相对含量，需注意的是待测抗体与酶标抗体是同一物质；2、抗HBe抗体检测，方法与抗原竞争法设计稍有区别，包被的抗HBe抗体后，检测也分两组，一组先加入酶标HBeAg再立即加入待测样品，一组只加酶标HBeAg，两组显色之差代表待测抗体的相对含量，这种设计中包被抗体和待测抗体是同一物质。值得注意的是混合组不是事先混匀再加入，而是先加入待测抗体后再加入酶标抗原。所有的这些复杂的注意事项确实很容易把人搞晕，但是童鞋们只需要记住一条，竞争很残酷，我们就要想尽一切办法保证竞争的公平性，这样就不会错。4、 捕获法，这种方法比较少用，由于具有识别抗体类型的优点，仅用于需要早期诊断的急性感染或者具有爆发性感染的疾病，如HAV-IgM、HBc-IgM、ToRCH等等。原理还是逃不脱经典的双抗夹心，具体方法是先包被能识别抗体类别的抗抗体，洗涤后加样品，再洗涤，加酶标记抗原，洗涤后显色，这些步骤闭上眼睛都能写出来。最后说两句，与抗原检测不同，抗体检测的设计不是根据抗体的结构特点了，这么多种设计方法，童鞋们用的时候就会选择障碍了，掌握2个原则，1.实验要求，如果需要特异性和准确性特别高，那肯定是双抗原夹心法，要求马马虎虎，那就间接法，如果要明确抗体类型，最好的选择就是捕获法了；2.实验成本，与纯化抗体不一样，有时候想要获得纯化的抗原是非常困难的，更别说两种不同的纯化抗原了，所以双抗原夹心法临床上用的并不多。ABS-ELISA顺便说一下ABS-ELISA设计，其实是和上面说的一样的，通过亲和素-生物素系统（ABS）方法显色反应，增加检测灵敏度而已，但是增加操作步骤与实验成本，而且现在单克隆抗体的技术越见成熟，抗体特异性和亲和力大大提高，灵敏度已经不是问题，所以这些次等装备已经不常用。结果判定最后和童鞋说说ELISA结果判定，分定性和定量两种。对于定性试验，参比阴、阳性对照的吸光度，以P/N或者S/CO比值形式报告。1. P/N比值是指（待测样本-空白对照）/（阴性样本-空白对照），一般以P/N≥2.1判为阳性，或许求知欲旺盛的童鞋会问，那么竞争法用P/N比值怎么判，呵呵，这里先不说，卖个乖，你可以百度或者私信我啊；2. S/CO比值，S是待测样本吸光度值，CO为CUT-OFF值，通常取值阴性对照平均值的2.1倍。S/CO比值≥1为阳性，竞争法S/CO比值≤1为阳性。定量检测没有什么可说的，老老实实做标准曲线，既锻炼实验操作能力，又可作为实验内部参照。 记得有这么个规定，定性检测不能目测判断，要凭借酶标仪检测，定量要在每次实验都得与待测样本相同实验条件下绘制标准曲线，有一难度，但是为了对实验负责，你就从了吧。

和western相同 抗体标记蛋白 然后显色

原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA技术作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速，定性或者定量甚至定位的特点。ELISA可用于测定抗原，也可以测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：1、固相的抗原或抗体；2、酶标记的抗原或抗体；3、酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检验方法。扩展资料在ELISA实验方法中，比较常见的方法有双抗体夹心法，竞争法，间接法，双抗原夹心法，捕获法。双抗体夹心法，其基本原理是将一定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，然后加入待检标本，通过加入检测抗体，酶标记第二抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。参考资料来源： 东莞市疾病预防控制中心—常用ELISA实验原理